CN102083419A

CN102083419A - 包含表面被覆了的微粒的医药组合物

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Publication number: CN102083419A
Application number: CN2009801255128A
Authority: CN
Inventors: 大久保胜之; 北浦千枝子; 味吞宪二郎; E.皮尔森; C.J.罗伯特斯; M.C.戴维斯; S.斯托尼克-特伦基; L.伊鲁姆
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2008-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2011-06-01
Also published as: US20110189299A1; EP2308473A1; JP5841708B2; RU2508093C2; RU2011103437A; CA2729764A1; KR20110028631A; JP2010031003A; EP2308473A4; WO2010001932A1

Abstract

本发明的目的是提供可用于通过除了注射之外的方法将低分子量药物和聚合物化合物例如肽和蛋白质有效给药的医药组合物，和制备该组合物的方法。上述问题通过经粘膜给药的医药组合物解决，该组合物含有（a）在预定的pH具有正或负的电荷的药物、（b）医药上可接受的微粒和（c）在该pH可带电的医药上可接受的表面被覆聚合物，其中，该表面被覆聚合物将该微粒的表面被覆，该药物通过该表面被覆聚合物固定在该微粒的该表面，并且通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用以及该表面被覆聚合物和该药物之间的并发静电相互作用形成复合物。

Description

包含表面被覆了的微粒的医药组合物

技术领域

本发明涉及经粘膜给药的医药组合物和其制备方法。更具体地，本发明涉及新型经粘膜给药的医药组合物，其包含由药物、微粒和表面被覆聚合物组成的复合物，其中该表面被覆聚合物将该微粒的表面被覆，该药物通过该表面被覆聚合物固定在该微粒的该表面，并且通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用以及该表面被覆聚合物和该药物之间的并发静电相互作用形成该复合物；和其制备方法。

背景技术

生物技术的进步已经导致发现大量治疗化合物，例如肽、蛋白质、多糖、多核酸、siRNA、RNA、抗体、抗原、低分子量药物等。然而，由于它们的物理化学特性(例如大分子量、亲水性、不稳定性等)，因此这些化合物中的许多难以通过除了注射之外的方法给药到体内。对于这些化合物中的一些，必须通过注射每日多次给药。然而，特别的问题是较年轻的患者未必遵从该化合物的给药的方式(非专利文献1和2)。

当通过口服路径或通过穿过例如肺、口腔、***、鼻子等中的粘膜的其它粘膜传递路径给药时，这些药物由于它们的物理尺寸和亲水性，不容易吸收。而且，这些药物容易被酶例如肽酶和蛋白酶降解，这在胃肠道中尤其是问题。为了改进这些药物输送穿过粘膜表面，已经使用了含有吸收增强剂的制剂，其特别在通过经鼻路径和通过肺部路径的传递中获得一定程度的成功。然而，需要开发实现具有较高分子量的化合物输送穿过粘膜表面的有效方法和组合物。

使用微粒例如纳米颗粒的体系作为输送聚合物药物例如肽和蛋白质穿过粘膜表面的方式已经被广泛研究(非专利文献3-5)。在肽和蛋白质药物的情形中，已经表明除非将该药物封装在纳米颗粒基质内，否则它们的稳定性低。然而，由于这些化合物的大尺寸和纳米颗粒基质中通常疏水的环境，因此这些化合物难以封装在纳米颗粒内，并且这通常导致非常低的装载容量并因此需要大量纳米颗粒给药到粘膜表面。而且，在出版物中已经阐明输送纳米颗粒穿过粘膜不容易实现(非专利文献6)。

现有技术参考文献

非专利文献

非专利文献1: Drug Discovery Today, Vol.7, pp.1184-1189 (2002)

非专利文献2: J. Control. Rel., Vol.87, pp.187-198 (2003)

非专利文献3: J. Pharm. Sci., Vol.96, pp.473-483 (2007)

非专利文献4: Biomaterials, Vol.23, pp.3193-3201 (2002)

非专利文献5: Int. J. Pharm., Vol.342, pp.240-249 (2007)

非专利文献6: J. Pharm. Sci., Vol.96, pp.473-483 (2007)。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是提供可用于通过除了注射之外的方法将低分子量药物和聚合物化合物例如肽和蛋白质有效给药的医药组合物。更具体地，本发明的目的是提供用于通过穿过例如鼻子等中的粘膜的路径将低分子量药物和聚合物药物例如肽和蛋白质有效给药的包含微粒的医药组合物，其中该组合物与传统的用于经粘膜给药的微粒制剂相比具有优良的药物装载效率和装载容量，并且实现了改进的药物稳定性。本发明的目的还在于提供制备该医药组合物的方法。

解决问题的方式

本发明人聚焦于使用微粒体系例如纳米颗粒的经粘膜给药，作为通过除了注射之外的方法而有效给药(例如肽、蛋白质、DNA、RNA、siRNA、多糖、抗体、抗原、低分子量化合物等)的方法，并且进行了勤劳的研究。结果，本发明人发现通过制备包含复合物的组合物，与相同药物的溶液制剂相比，药物稳定性显著改进，其中通过药物和表面被覆聚合物(即附着于微粒表面的聚合物)之间的静电相互作用形成的药物-表面被覆聚合物复合物通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用固定在微粒的表面。而且，本发明人发现与药物被封装的类型的微粒制剂相比，该组合物具有优良的药物装载容量。基于这些发现，本发明人发现通过使用该组合物可以实现优于传统方法的药物传递体系，这使得完成本发明。

因此，本发明如下。

[1] 经粘膜给药的医药组合物，其含有（a）在预定的pH具有正或负的电荷的药物、（b）医药上可接受的微粒和（c）在该pH可带电的医药上可接受的表面被覆聚合物，其中，该表面被覆聚合物将该微粒的表面被覆，该药物通过该表面被覆聚合物固定在该微粒的该表面，并且通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用以及该表面被覆聚合物和该药物之间的并发静电相互作用形成复合物。

[2] 上述[1]的组合物，其中，该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用是静电相互作用。

[3] 上述[1]或[2]的组合物，其中，该预定的pH是给药部位的生理pH。

[4] 上述[1]-[3]中任一项的组合物，其中，该药物选自肽、蛋白质、DNA、RNA、siRNA、多糖、抗原和低分子量药物。

[5] 上述[1]-[4]中任一项的组合物，其中，该药物是可带来药效或疫苗效果的药物。

[6] 上述[4]的组合物，其中，该药物为胰岛素。

[7] 上述[4]的组合物，其中，该药物是选自溴己新、佐米曲坦和它们的盐中的至少1种的药物。

[8] 上述[1]-[7]中任一项的组合物，其中，在该预定的pH下，该表面被覆聚合物本身是微溶于水的。

[9] 上述[1]-[8]中任一项的组合物，其中，该表面被覆聚合物是选自壳聚糖、多聚精氨酸、聚丙烯酸、聚-γ-谷氨酸和它们的盐中的至少1种聚合物。

[10] 上述[1]-[9]中任一项的组合物，其中，该表面被覆聚合物是粘膜附着性的和/或作为经粘膜吸收促进因子发挥功能。

[11] 上述[1]-[10]中任一项的组合物，其中，该微粒含有聚合物，所述聚合物含有羧基或氨基。

[12] 上述[1]-[11]中任一项的组合物，其中，该微粒包含聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物。

[13] 上述[1]-[12]中任一项的组合物，其中，在该预定的pH下的该复合物的平均粒径为10nm以上至50μm以下。

[14] 上述[8]的组合物的制备方法，其包含，

（a）在该表面被覆聚合物为易水溶性的pH下，将该药物、该微粒和该表面被覆聚合物混合，和

（b）将该混合物的pH调节为该预定的pH。

[15] 上述[1]-[13]中任一项的组合物的制备方法，其包含，

（a）在该药物和该表面被覆聚合物具有相同符号的电荷的pH条件下，将该药物、该表面被覆聚合物和该微粒混合，然后

（b）将该混合物的pH调节为该药物的电荷符号变成相反符号的pH，

其中，该药物为两性药物。

[16] 上述[15]的制备方法，其中，在工序（a）的pH条件下，该微粒具有与该药物和该表面被覆聚合物的电荷相反符号的电荷。

[17] 上述[1]-[13]中任一项的组合物的制备方法，其包含，

（a）将该微粒材料的有机溶剂溶液向该表面被覆聚合物的水溶液中滴加，

（b）使该有机溶剂蒸发，

（c）添加该药物并搅拌该混合物，和

（d）将该混合物的pH调节至该预定的pH。

发明效果

本发明组合物的使用使得能够有效地经粘膜给药低分子量药物和聚合物药物例如肽和蛋白质，这到目前为止难以通过除了注射之外的方法给药。本发明组合物中包含的药物与相反电荷的表面被覆聚合物和微粒形成复合物，并且由此具有比包含于溶液制剂的情况更高的稳定性(例如对于酶的稳定性、保存稳定性)，以及与药物封装在微粒基质中的微粒制剂相比更高的药物装载容量。而且，根据在微粒表面上与药物形成复合物的表面被覆聚合物的类型，可以实现药物的持续释放或立即释放和控制药物的经粘膜吸收性。

附图说明

图1解释了包含用胰岛素-壳聚糖复合物表面被覆了的PLGA核颗粒的表面被覆了的微粒(表面载体体系)的制备机理。

图2表示在PLGA微粒表面上形成胰岛素-壳聚糖复合物的结果，其中左边的柱状图表示胰岛素在具有pH 6.0的缓冲液中的释放，右边的柱状图表示胰岛素在具有pH 4.5的缓冲液中的释放，并且竖轴表示释放的胰岛素的量(μg)。

图3表示得自用胰岛素-壳聚糖复合物表面被覆了的PLGA核颗粒的飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS)分析的结果，其中上面的区域表示每一样品(PLGA、壳聚糖(Chitosan)、胰岛素(Insulin)和表面被覆了的微粒(Carrier System))中m/z=33峰的检测结果(横轴：m/z；竖轴：检测强度)，和下面的区域表示在观察区域中表面被覆了的微粒的m/z=33峰的分布图像(左边)和总离子分布图像(右边)。

图4表示培养后留在胰凝乳蛋白酶溶液中的未降解的胰岛素的比例(%)，其中上面的条表示游离胰岛素溶液和下面的条对应于PLGA/壳聚糖/胰岛素表面被覆了的微粒。

图5是解释用于胰岛素通过猪鼻粘膜的输送研究的方法的示意图。

图6表示对于猪鼻粘膜的胰岛素输送研究的结果，其中横轴表示开始该输送研究后的时间(min)，和竖轴表示在给定时间内输送穿过该猪鼻粘膜的胰岛素量(ng/cm²)。

图7表示表面被覆了的微粒或壳聚糖/胰岛素混合物的粒径测量结果，其中(a)表示表面被覆了的微粒(具有核颗粒；PLGA100/壳聚糖/胰岛素=1250/900/200 μg/ml)的粒径分布，(b)表示壳聚糖/胰岛素混合物(不含核颗粒；壳聚糖/胰岛素=900/200 μg/ml)的粒径分布，横轴表示颗粒半径(nm)和竖轴表示强度。

图8表示冻干前和冻干并且重新悬浊后表面被覆了的微粒(PLGA100/壳聚糖/胰岛素=250/180/40 μg/ml)的粒径测量结果，其中(a)表示冻干前表面被覆了的微粒的粒径分布，(b)表示冻干并且重新悬浊后表面被覆了的微粒的粒径分布，横轴表示颗粒半径(nm)和竖轴表示强度。

图9表示得自实施例7的样品或对照样品对大鼠经鼻子给药后的血糖水平，其中结果表明相对于样品给药前为100%，葡萄糖水平(%)相对降低，平均值±标准误差。

图10表示使用得自实施例8的样品的体内释放试验的结果(N=3)(5mM MES等渗压缓冲液(pH 6),37℃)。

具体实施方式

本发明提供经粘膜给药的医药组合物，其含有（a）在预定的pH具有正或负的电荷的药物、（b）医药上可接受的微粒和（c）在该pH可带电的医药上可接受的表面被覆聚合物。在该组合物中，该表面被覆聚合物将该微粒的表面被覆，该药物通过该表面被覆聚合物固定在该微粒的该表面，并且通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用以及该表面被覆聚合物和该药物之间的并发静电相互作用形成复合物(下文中也将称为“表面被覆了的微粒”)。

“经粘膜给药的医药组合物”是指通过合适的方法例如被覆、喷射、喷雾、敷等向需要处理和/或治疗的对象的粘膜给药的医药组合物，其中该药物可以传递到粘膜组织或者穿过粘膜组织传递到循环***或免疫***以产生医疗或疫苗效果。经粘膜给药的医药组合物可以例如穿过粘膜被吸收以用于***传递。作为粘膜的例子，可以提及例如肺、口腔、眼睛、***、胃肠道、鼻子等中的粘膜。从给药便利的观点考虑，优选鼻粘膜作为该粘膜。

构成该表面被覆了的微粒的上述(c)的医药上可接受的表面被覆聚合物覆盖如上所述的微粒的表面。“被覆”这里仅指该表面被覆聚合物通过该微粒和该表面被覆聚合物之间的非共价键相互作用而附着于该微粒的该表面，而不是内部，并且不一定是指该微粒的整个表面被该表面被覆聚合物被覆。

该表面被覆聚合物优选为生物相容的。术语“生物相容”在这里是指物质和其降解产物对身体组织或身体***(例如血液循环***、神经***、免疫***等)没有毒性或有害影响。该生物相容的聚合物适用于对人或其他动物给药。另外，该表面被覆聚合物更优选为可生物降解的。术语“可生物降解性”在这里是指在可接受的时间内物质在活体内通过酶、化学或物理过程等降解形成更小的化学种类。检验物质的生物相容性和生物可降解性的方法是本发明的技术领域公知的。

该表面被覆聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。由于该表面被覆聚合物在预定的pH下在微粒表面上与药物离子性键合，因此其需要是在该预定的pH下具有与该药物相反符号的电荷的聚合物。在必要的情况下，对于该表面被覆聚合物，可以组合使用多于一种的表面被覆聚合物，只要它们能够在该预定的pH下具有相同符号的电荷。

本发明的医药组合物可以例如通过下面提及的制备方法制备；当该组合物通过该制备方法制备时，即使在该预定的pH下该表面被覆聚合物本身是微溶于水的，也可以通过在该表面被覆聚合物容易水溶的pH下将该表面被覆聚合物与该药物和该微粒混合，然后将混合物的pH调节至该预定的pH而制备该组合物。因此，对于该表面被覆聚合物，不仅可以使用在预定的pH下容易水溶的聚合物，而且可以使用在预定的pH下微溶于水的聚合物。

可用于该表面被覆聚合物的聚合物可以选自，但不限于聚阴离子或聚阳离子的多糖、聚氨基酸和其他带电聚合物。该聚合物基于使用的药物类型、表面被覆聚合物和药物的电荷等适宜地选择。

可用于本发明的聚阴离子多糖是指在结构单元中具有一个或多个酸性极性基团例如羧基、硫酸基或磷酸基的多糖。这类聚阴离子多糖的例子包括，但不限于，软骨素硫酸、葡聚糖硫酸、羧甲基纤维素、藻酸、果胶、透明质酸、它们的衍生物和盐等。

可用于本发明的聚阳离子多糖是指在结构单元中具有一个或多个碱性极性基团例如氨基的多糖。这类聚阳离子多糖的例子包括，但不限于，甲壳质、壳聚糖、它们的衍生物和盐等。壳聚糖和壳聚糖衍生物可以选自具有各种分子量、脱乙酰化度的那些，并且对于壳聚糖衍生物选择具有各种取代度的那些。

可用于本发明的聚阴离子聚氨基酸是指其等电点在生理pH的酸性侧的聚氨基酸；其例子包括，但不限于，聚谷氨酸、聚天冬氨酸、它们的衍生物和盐等。

可用于本发明的聚阳离子聚氨基酸是指其等电点在生理pH的碱性侧的聚氨基酸；其例子包括，但不限于，聚赖氨酸、多聚精氨酸、它们的衍生物和盐等。

除了上述的多糖和聚氨基酸之外，可用于该表面被覆聚合物的聚合物的例子包括聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、它们的衍生物和盐等。

该表面被覆聚合物可以是聚乙二醇化(PEG化)和/或糖基化的。

该表面被覆聚合物可以进一步是粘膜附着性的和/或作为经粘膜吸收促进因子发挥功能。粘膜附着性聚合物的例子包括壳聚糖、聚丙烯酸、藻酸钠、羧甲基纤维素等以及它们的PEG化的聚合物等。作为经粘膜吸收促进因子发挥功能的聚合物的例子包括壳聚糖、聚丙烯酸、多聚精氨酸、它们的盐和衍生物等。

本领域那些普通技术人员可以考虑一些因素例如降解速率、机械强度、溶解度、将与表面被覆聚合物形成复合物的药物类型等来确定该表面被覆聚合物的分子量。一般而言，通过凝胶渗透色谱法测量的该表面被覆聚合物的重均分子量应该优选不小于1,000 Da，并且更优选不小于2,000 Da；优选不超过1,000,000 Da，并且更优选不超过500,000 Da。因此一般而言，该表面被覆聚合物的重均分子量优选为1,000-1,000,000 Da，并且更优选2,000-500,000Da。例如，甲壳质或壳聚糖的重均分子量可以为1,000-1,000,000 Da，并且甲壳质或壳聚糖的脱乙酰化度可以为20-100%。

本发明的组合物基于该表面被覆聚合物的选择，能够作为持续释放或立即释放组合物控制药物的释放率，并且能够调节药物的经粘膜吸收性。本领域那些普通技术人员可以适宜地选择表面被覆聚合物以提供该组合物的期望的药物动力学性能。

根据预期的应用选择用于本发明组合物的药物。在本发明的组合物中，由于药物在微粒表面上与合适表面被覆聚合物离子性键合，因此可用于该组合物的药物需要在预定的pH下带正电或带负电(即具有与该表面被覆聚合物相反符号的电荷)。只要满足该条件，任何药物可用于本发明的组合物。在必要的情况下，可以组合使用多于一种的药物，只要它们能够在预定的pH下具有相同符号的电荷。

药物可以是，不限制于，肽、蛋白质、DNA、RNA、siRNA、多糖、抗体、抗原、低分子量化合物等。本发明的医药组合物例如可以通过下面提及的制备方法制备。当该组合物通过下面提及的制备方法制备时，可以特别优选允许在制备过程期间基于pH变化而电荷改变(符号和强度)的药物，因为可以在没有该药物和该表面被覆聚合物之间的静电相互作用的带电条件下使该药物和该表面被覆聚合物充分混合，然后通过改变该pH在它们之间形成离子键。这类药物的例子包括两性药物例如肽和蛋白质，其可以根据pH而带正电或带负电，随着制备过程和组合物中的电荷强度显著改变具有这种酸离解常数(pKa)或碱离解常数(pKb)的药物，和盐形成例如盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐等的低分子量药物，其能够溶于水并且具有较少依赖于pH的电荷。

药物的例子包括，但不限于，抗高血压药、抗低血压药、止痛剂、抗精神病药、抗抑郁剂、抗狂躁剂、抗焦虑剂、镇静剂、催眠药、抗癫痫药、***类激动剂、用于哮喘的治疗剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、用于关节炎的治疗剂、抗惊厥药、ACE抑制剂、减充血药、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森剂、支气管扩张剂、催产药、抗利尿剂、抗血脂药、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐药、抗感染药、抗肿瘤药、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病药、抗过敏药、退烧药、抗癌剂、抗痛风药、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管药、降血胆固醇药、抗疟剂、用于戒烟的药剂、止咳剂、祛痰剂、粘液溶解剂、鼻子减充血药、多巴胺受体激动剂、用于消化道的药剂、肌肉弛缓剂、神经肌肉阻断剂、副交感神经阻断药、***素、兴奋药、厌食药、甲状腺药或抗甲状腺药、激素、抗偏头痛药、抗肥胖药、抗炎药等。该药物也可以选自预期用于预防接种、免疫疗法、抗体治疗、基因治疗、抑制基因表达等的各种肽、蛋白质、多糖、抗原、抗体、DNA、RNA、siRNA、低分子量药物等。

该药物的具体例子包括，但不限于，胰岛素、胰高血糖素、醋酸亮丙瑞林、生长激素、甲状旁腺激素、降钙素、血管内皮生长因子、红细胞生长素、肝素、环孢菌素、催产素、酪氨酸、英脑啡肽、促甲状腺素释放激素、促卵胞激素、促黄体生成激素、抗利尿激素、抗利尿激素类似物、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、白介素II、干扰素、菌落刺激因子、肿瘤坏死因子、促黑素细胞激素、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、降钙肽、胆囊收缩素-12（cholecystekinin-12）、胆囊收缩素-8（cholecystekinin-8）、艾塞那肽（exendin）、***释放因子相关的肽、胰岛素样蛋白质、亮氨酸-英脑啡肽、蛋氨酸-英脑啡肽、脑啡肽原（leumorphine）、后叶激素运载蛋白、和肽素、神经肽Y、神经肽 AF、PACAP相关肽、胰腺激素、肽YY、尿压素、肠肽、促肾上腺皮质肽、表皮生长因子、催乳素、促***释放素(LHRH)、LHRH激动剂、生长激素释放因子、生长激素释放抑制因子、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、内啡肽、增压素、促甲状腺素释放激素、粒细胞-菌落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞-菌落刺激因子、肝素酶、用于流行性感冒疫苗的抗原、破伤风毒素、用于癌疫苗的肽、β–淀粉状蛋白、免疫球蛋白、用于治疗硬化的siRNA、用于治疗癌症的siRNA，低分子量药物例如溴己新、格雷西隆、佐米曲坦、磺马曲坦等，和它们的医药上可接受的盐等。

如上所述，该药物和该表面被覆聚合物在该微粒表面上通过静电相互作用彼此结合形成药物-表面被覆聚合物复合物。对于将该药物和该表面被覆聚合物的组合形成该复合物，其可以是其中在预定的pH下该药物带正电并且该表面被覆聚合物带负电的组合，或者其中在预定的pH下该药物带负电并且该表面被覆聚合物带正电的组合。

上述医药上可接受的微粒(尽管术语“微粒”在本说明书中是指上述微粒(b)，但有时可以将该微粒称为“微核颗粒”以使该术语与“表面被覆了的微粒”清楚地区分)优选由生物相容性聚合物构成。该聚合物可以是可生物降解或不可生物降解的；从对活体的安全性观点考虑，优选可生物降解的。该聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。

可用于该微粒的生物相容和可生物降解的聚合物的例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、PEG和PLGA的嵌段共聚物(PEG-PLGA)、聚酐、聚(ε-己内酯)、聚羟基丁酸酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚对二氧杂环己酮（polydiaxanone）、聚酯酰胺、聚磷腈（polyphosphagen）、聚氰基丙烯酸酯、壳聚糖、壳聚糖衍生物、淀粉、淀粉衍生物、白蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、骨胶原、透明质酸，这些物质的混合物和共聚物等。

可用于该微粒的生物相容和不可生物降解的聚合物的例子包括，但不限于，聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯酯类、泊洛沙姆、季酮酸（tetronics）、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯酯类、聚苯乙烯、乙烯乙酸乙烯、酰化乙酸纤维素、聚氨酯、聚氯乙烯，这些物质的混合物和共聚物等。

该微粒可以是亲水性或疏水性的。由于在水体系中在该微粒的制备过程中和在该表面被覆了的微粒的制备过程中，该微粒的形状和尺寸可以容易地保持，因此优选疏水性微粒。作为优选的例子，具有羧基或者伯、仲或叔氨基的疏水性聚合物可用于该微粒。

本领域那些普通技术人员可以通过考虑一些因素例如降解速率、机械强度和溶解度来确定用于该微粒的聚合物的分子量。典型的是，通过凝胶渗透色谱法测量的该聚合物的重均分子量优选不小于1,000 Da(道尔顿)，并且更优选不小于2,000 Da；优选不超过1,000,000 Da，并且更优选不超过500,000 Da。因此一般而言，该聚合物的重均分子量优选为1,000-1,000,000 Da，并且更优选2,000-500,000Da。

关于微核颗粒的尺寸，可以提及具有不小于1 nm，优选不小于5 nm，并且更优选不小于10 nm的平均粒径的颗粒，和具有不超过50μm，优选不超过20 μm，并且更优选不超过10 μm的一类。

粒径在这里是指通过测量在上述“预定的pH”下分散于水溶液中的微粒得到的值。粒径是通过粒径测量装置测量并且基于假设该颗粒具有球形而计算的直径。该粒径测量装置和该平均粒径的计算方法根据粒径适宜地改变。具体来说，在通过动态光散射测量装置可测量的粒径(通常不超过7 μm)的情形中，该粒径通过动态光散射测量装置测量，并且由散射强度分布确定的流体动力学直径的平均值被用作平均粒径。在通过动态光散射测量装置不能测量的大粒径(通常大于7 μm)的情形中，该粒径通过激光衍射***粒径分布测量装置测量，并且通过将频率分布算术平均得到的平均直径被用作平均粒径。

这里，微核颗粒的平均粒径例如不小于10nm是指在上述通过动态光散射测量装置的散射强度分布中每一粒径峰的比例(每一粒径峰的累积散射强度与所有峰的累积散射强度的比例)中，或者在上述通过激光衍射***粒径分布测量装置的频率分布中每一粒径峰的比例(每一粒径峰的累积频率与所有峰的累积频率的比例)中，粒径峰的平均粒径的不小于10%，优选不小于20%，更优选不小于30%，仍然更优选不小于40%，特别优选不小于50%为不小于10nm。

当将本发明的组合物向粘膜给药时，表面被覆了的微粒到达粘膜表面或者可以进入粘膜组织并且在其中释放药物。然后该药物输送到血流中。当该微粒足够小(例如不超过20nm的该微粒粒径)时，其可以通过细胞间的间隙到达血流。作为选择，该微粒可以被一些粘膜例如鼻子或肠中的M-细胞或M-状细胞吞入并且输送到免疫***或淋巴***中。

上述微粒可以通过文献中描述的各种方法制备。该文献的例子包括Champion JA. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.104, pp.11901-4 (2007)；Chattopadhyay P. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., Vol.59, pp.443-53 (2007)；Zhou WY et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., Vol.19, pp.103-110 (2008)；Schaffazick SR et al., Pharmazie, Vol.62, pp.354-60 (2007)；Almeida AJ et al., Adv. Drug Deliv. Rev., Vol.59, pp.478-90 (2007)；Muller, R.H., “Colloidal Carriers for Controlled Drug Delivery and Targeting: Modification, Characterization and In vivo Distribution”, CRC Press (1991)；Jorg Kreuter (ed.), Colloidal Drug Delivery Systems, Marcel Dekker (1994)等。可用于制备该微粒的方法的例子包括纳米沉淀、相分离、乳化、自组装、高压均质化、复合、离子凝胶化等。

如上所述，该微粒必须与表面被覆聚合物非共价键相互作用以生成表面被覆了的微粒。这里，该非共价键相互作用是指不基于共价键的相互作用，例如静电相互作用、疏水性相互作用、范德华相互作用、氢键等。在它们当中，例如当利用静电相互作用时，该微粒必须是在预定的pH下具有与该表面被覆聚合物相反符号的电荷的聚合物以允许静电相互作用。因此，将用于组合物的药物、表面被覆聚合物和用于微粒的聚合物的组合是带正电的药物、带负电的表面被覆聚合物和带正电的用于微粒的聚合物的组合，所有这些在预定的pH下，或者带负电的药物、带正电的表面被覆聚合物和带负电的用于微粒的聚合物的组合，所有这些在预定的pH下。将由药物、表面被覆聚合物和用于微粒的聚合物满足的等电点(pI)、酸离解常数(pKa)和碱离解常数(pKb)的要求以实现这样的组合如下: 该药物和用于微粒的该聚合物的pI或pKa或(14-pKb)值高于制备后该组合物的pH，并且该表面被覆聚合物的pI或pKa或(14-pKb)值低于制备后该组合物的pH；或者该药物和用于微粒的该聚合物的pI或pKa或(14-pKb)值低于制备后该组合物的pH，并且该表面被覆聚合物的pI或pKa或(14-pKb)值高于制备后该组合物的pH。每一化合物的等电点和/或酸离解常数的确定处于本领域那些普通技术人员的常用技术范围内。作为选择，在能够溶于水并且具有电荷的盐形式的低分子量药物例如盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐等的情形中，可以通过将带电的药物与具有与该药物在水中的电荷相反符号的电荷的表面被覆聚合物和具有与该药物在水中的电荷相同符号的电荷的微粒组合制备组合物。

希望将预定的pH，即制备后该组合物的pH设置为给药部位的生理pH以避免局部刺激。如上所述，本发明的组合物可向例如肺、口腔、眼睛、***、肠、鼻子等中的粘膜给药，其中这些不同粘膜中的生理pH变化。例如，胃肠道的生理pH沿着其长度从胃里的约pH 1增加至结肠里的pH 8；口腔具有pH约6.8；鼻液的pH为约pH 5.5-6.5的范围；***的pH约为4.5。例如，当本发明的组合物将向鼻粘膜给药时，该组合物优选的pH值为例如约6.0。

如上所述，胰岛素可用作本发明组合物中的药物。当该组合物的pH为6.0时，胰岛素在该组合物中带负电，因为胰岛素的等电点约为pH 5.3。因此，表面被覆聚合物必须是在pH 6.0具有正电荷的聚合物。当使用静电相互作用作为非共价键相互作用以使该表面被覆聚合物和该微粒彼此相互作用时，由在pH 6.0具有负电荷的聚合物构成的微粒可用作优选的微粒。这类表面被覆聚合物可以是壳聚糖，并且用于该微粒的该聚合物可以是聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。

如上所述，溴己新、佐米曲坦和它们的盐可用作本发明组合物中的药物。当组合物的pH为6.0－7.0时，表面被覆聚合物必须是在所述pH下具有负电荷的聚合物，因为该药物在水中带正电。当使用静电相互作用作为非共价键相互作用以使该表面被覆聚合物和该微粒彼此相互作用时，由在所述pH下具有正电荷的聚合物构成的微粒可用作优选的微粒。这类表面被覆聚合物的例子包括聚丙烯酸、聚-γ-谷氨酸和它们的盐，并且该微粒的例子包括壳聚糖微粒和氨基改性的聚苯乙烯颗粒。

关于表面被覆了的微粒的尺寸，可以提及具有不小于10 nm，优选不小于20 nm，更优选不小于40 nm的颗粒，和具有不超过50μm，优选20 μm，更优选不超过10μm的平均粒径的一类。

粒径在这里是指通过测量在上述“预定的pH”下分散于水溶液中的表面被覆了的微粒得到的值。具体来说，当该表面被覆了的微粒为悬浊液的形式时，在用具有与该悬浊液的pH相同的pH(上述预定的pH)的水溶液将该悬浊液稀释至适合于测量的浓度后，测量尺寸。当表面被覆了的微粒为除悬浊液之外的剂型例如干粉、薄片剂等，这阻止了该粒径的直接测量时，加入水或合适的pH缓冲液以制备具有上述“预定的pH”的悬浊液然后测量该粒径。该粒径是通过粒径测量装置测量并且基于假设颗粒具有球形而计算的直径。该粒径测量装置和该平均粒径的计算方法根据粒径适宜地改变。具体来说，在通过动态光散射测量装置可测量的粒径(通常不超过7μm)的情形中，该粒径通过动态光散射测量装置测量，并且由散射强度分布确定的流体动力学直径的平均值被用作平均粒径。在通过动态光散射测量装置不能测量的大粒径(通常大于7 μm)的情形中，该粒径通过激光衍射***粒径分布测量装置测量，并且通过将频率分布算术平均得到的平均直径被用作平均粒径。

这里，表面被覆了的微粒的平均粒径例如不小于10nm是指在上述通过动态光散射测量装置的散射强度分布中每一粒径峰的比例(每一粒径峰的累积散射强度与所有峰的累积散射强度的比例)中，或者在通过上述激光衍射***粒径分布测量装置的上述频率分布中每一粒径峰的比例(每一粒径峰的累积频率与所有峰的累积频率的比例)中，粒径峰的平均粒径的不小于10%，优选不小于20%，更优选不小于30%，仍然更优选不小于40%，特别优选不小于50%为不小于10nm。

由于该微粒作为核存在，因此本发明组合物中表面被覆了的微粒与通过只将表面被覆聚合物和药物混合而形成的复合物相比具有单分散的粒径。因此，如本发明中的表面被覆了的微粒的组成使得容易制备具有一致性能的制剂。该特征也是本发明的优点。

本发明的组合物必须作为允许表面被覆了的微粒直接到达目标粘膜部位的制剂传递。其例子包括肺部药剂、口服剂、口腔药剂、眼内药剂、***药剂、鼻内药剂、栓剂等。

作为肺部药剂，优选通过肺部吸入器设备传递到肺泡的吸入剂。

作为口服剂，可以提及常用的口服制剂例如片剂、颗粒剂、细颗粒剂、胶囊等。优选设计为在小肠中释放药物的剂型，例如肠溶包衣片剂、肠溶包衣颗粒剂、肠溶包衣胶囊和肠溶包衣细颗粒剂。

作为口腔药剂、眼内药剂和鼻内药剂，可以提及口腔片剂、口腔喷剂、滴眼液、滴鼻液、气雾剂、软膏剂、凝胶、乳膏剂、液体、悬浊液、洗剂、干粉、薄片剂、贴剂等。

作为***药剂和栓剂，可以提及软膏剂、凝胶、乳膏剂、液体、悬浊液、洗剂、干粉、薄片剂、胶囊等。

作为制备上述剂型的方法，可以采用本领域普遍使用的已知制备方法。在必要的情况下，当制备上述剂型时，通常用于制备特定剂型的载体例如赋形剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂，以及各种制剂添加剂例如甜味剂、表面活性剂、悬浊剂、乳化剂、着色剂、防腐剂和稳定剂可以以合适的量适宜地加入以制备该剂型。并且，本发明的组合物可以以通过使悬浊液冻干而制备的干粉等形式保存，并且当使用时通过将水加入该干粉而重新悬浊。采用该方法，可以避免该药物、用于微粒的该聚合物和/或该表面被覆聚合物的水解，以改进该组合物的保存稳定性。

本发明组合物中用于微粒的聚合物、表面被覆聚合物和药物的优选的相对比例根据将使用的该微粒、该表面被覆聚合物和该药物而变化，因此不能一般而论。例如，当使用聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)作为用于该微粒的聚合物，使用壳聚糖作为该表面被覆聚合物，和使用胰岛素作为该药物时，组合物中它们的重量比可以为PLGA:壳聚糖:胰岛素=1:0.1-100:0.01-100。

本发明的医药组合物稳定并且具有低毒性，并且可以安全使用。给药频率和单次剂量根据使用的药物、患者的状态和体重、给药路径、治疗策略等而变化，因此不能一概而论。例如，当将其中胰岛素用作该药物的本发明的组合物经鼻向患有糖尿病等的患者给药时，作为一种治疗策略，可以在每次进餐前将约2mg－约6mg活性成分(胰岛素)向成年人(约60kg体重)给药。

本发明还提供了上述医药组合物的制备方法。本发明的方法包括将药物、表面被覆聚合物和微粒在具有合适pH的溶液中混合，任选地改变该pH以引起该药物和该表面被覆聚合物之间的静电相互作用，以及该表面被覆聚合物和该微粒之间的非共价键相互作用。该方法不需要加热处理等因此是便利的。

在该方法中，预先确定药物、表面被覆聚合物和微粒的组合，以及本发明组合物的pH(预定的pH)。这些因素可以如上在关于本发明组合物的解释中提及的而确定。通常在将该药物、该表面被覆聚合物和该微粒混合之前通过上述方法制备该微粒。然后，将该药物、该表面被覆聚合物和该微粒混合并且任选地调节pH，由此制得本发明的表面被覆了的微粒。该混合物和任选的pH调节包括选自以下a)－c）的任一种：

a) 将该药物和该表面被覆聚合物在具有不会形成它们的复合物的pH的溶液中混合，将该微粒加入该溶液，并且改变该溶液的pH以促进该药物和该表面被覆聚合物的复合物形成，以及该药物-表面被覆聚合物复合物固定在该微粒表面上；

b) 将该药物和该表面被覆聚合物在具有形成它们的复合物的pH的溶液中混合，并且将该微粒加入该溶液，以制备固定在该微粒表面上的该药物-表面被覆聚合物复合物；

c) 将该微粒和该表面被覆聚合物在溶液中混合以使该表面被覆聚合物固定在该微粒表面上，将该药物加入该溶液，并且调节该溶液的pH以促进固定在该微粒表面上的该药物和该表面被覆聚合物的复合物的形成。

特别地，当该表面被覆聚合物本身在预定的pH下微溶于水时，希望首先(a)在该表面被覆聚合物易溶于水的pH下混合该药物、该微粒和该表面被覆聚合物，然后(b)将该混合物的pH调节至预定的pH。

当根据pH改变电荷符号的药物，即两性药物用作用于本发明医药组合物的药物时，以下方法可用于本发明的医药组合物的制备方法。即，作为第一步骤，将该药物、该表面被覆聚合物和该微粒在该药物的电荷和该表面被覆聚合物的电荷为同一符号的pH条件下混合，由此使得由于非共价键相互作用例如静电相互作用，该药物和该表面被覆聚合物都朝着该微粒表面吸引。另外，作为第二步骤，将该混合物的pH调节至该药物的电荷改变成相反符号的pH，由此通过静电相互作用在该微粒表面上聚集的药物和表面被覆聚合物之间有效地形成结合，由此可以有效地制备本发明的医药组合物。该制备方法是有用的，因为其可以抑制游离的药物-表面被覆聚合物复合物(未固定在微粒表面)作为副产物产生。

用胰岛素(药物；等电点：约5.3)、壳聚糖(表面被覆聚合物)和PLGA微粒(微粒)解释该方法，例如将胰岛素、壳聚糖和PLGA微粒在其中胰岛素带正电的“小于等电点的pH”(例如pH 4.5等)下混合，然后将pH调节至其中胰岛素带负电的“高于等电点的pH”(pH 6.0等)。尽管在pH 4.5和pH 6.0下壳聚糖具有正电荷并且PLGA颗粒具有负电荷，但胰岛素在pH 4.5下带正电并在pH 6.0下带负电。因此，可以制得其中在pH 6.0下相互离子键合的壳聚糖和胰岛素固定在PLGA微粒表面上的本发明的组合物之一。图1解释了该实施方式。

因此，本发明提供本发明组合物的制备方法，其包括：

（a）在药物和表面被覆聚合物具有相同符号的电荷的pH条件下，将药物、表面被覆聚合物和微粒混合，然后

（b）将该混合物的pH调节为药物的电荷符号变成相反符号的pH，

其中，该药物为两性药物。

作为选择，作为尤其可用于通过减小核颗粒的粒径使作为产物的表面被覆了的微粒的粒径最小化的仍然另一种制备方法，可以采用以下方法。在该方法中，同时开始该微粒的制备和该微粒与该表面被覆聚合物之间的静电相互作用，而不是预先制备该微粒。具体地，在该方法中，将包含如上所述的微粒的材料的合适有机溶剂(例如丙酮溶液等)滴加到该表面被覆聚合物的水溶液中，并且通过搅拌等将该有机溶剂从该溶液蒸发，由此开始形成作为核颗粒的微粒和用该表面被覆聚合物被覆该微粒；在加入该药物并且混合之后，任选地改变pH以促进该药物和该表面被覆聚合物之间以及该表面被覆聚合物和该微粒之间的静电相互作用，由此制得该表面被覆了的微粒。

因此，本发明提供本发明组合物的制备方法，其包括：

（a）将微粒材料的有机溶剂溶液向表面被覆聚合物的水溶液中滴加，

（b）使该有机溶剂蒸发，

（c）添加药物并搅拌该混合物，和

（d）将该混合物的pH调节至预定的pH。

尽管下文中通过参照实施例和实验例进一步详细解释本发明，但本发明不限于以下实施例等。

实施例

制备例1: 各种粒径的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微粒的制备

使用具有50:50的丙交酯:乙交酯比例的PLGA(RESOMER RG 502H,Bohringer Ingelheim)制备PLGA微粒。将该PLGA以所需的浓度溶于HPLC等级丙酮。在持续搅拌下以1:3的比例将PLGA/丙酮溶液滴加到纯净水中。搅拌该混合物直到丙酮全部蒸发(约4小时)。

通过动态光散射测量装置(DLS 802, Viscotek)测量所得微粒的粒径分布。表1示出了PLGA浓度和得到的颗粒的直径之间的关系。显然通过降低初始有机溶剂溶液中的聚合物浓度，可以容易并且可再现地获得较小的颗粒。

表1

PLGA浓度对粒径的影响

实施例1: 在两种不同的缓冲液体系中制备用药物-表面被覆聚合物复合物表面被覆了的微粒体系

使用胰岛素(pI约5.3)作为蛋白质药物，并且使用壳聚糖作为带正电的表面被覆聚合物。

将1.5 ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 160 μg/ml)加入1.5ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 0.72 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少30 min。将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径; 下文中也称为“PLGA 100”)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 500μg/ml)悬浊液加入该壳聚糖/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。用NaOH (0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入盐和补充物以提供与表2或表3所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。

表2

0.5 mM柠檬酸等渗缓冲液(pH 6.0)的组成

	MW	g/L	浓度(mM)	离子强度(mM)
					D-葡萄糖	180.16	1.80	10	----
MgCl₂	95.21	0.0468	0.492	1.476
					KCl	74.55	0.340	4.56	4.56
CaCl₂?2H₂O	147.02	0.176	1.2	3.6
					柠檬酸	192.1	0.096	0.5	0.8
NaCl	58.44	8.015	137.15	137.15

表3

50 mM MES 0.5 mM柠檬酸等渗缓冲液(pH 6.0)的组成

	MW	g/L	浓度(mM)	离子强度 (mM)
					D-葡萄糖	180.16	1.80	10	----
MgCl₂	95.21	0.0468	0.492	1.476
					KCl	74.55	0.340	4.56	4.56
CaCl₂?2H₂O	147.02	0.176	1.2	3.6
					柠檬酸	192.1	0.096	0.5	0.8
MES	195.2	9.76	50	20
					NaCl	58.44	7.22	123.56	123.56

分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位(表4)。

可从表4看出，对于两种不同的缓冲液体系，获得了类似并且优选的粒径和zeta电位。两类表面被覆了的微粒各自具有约为未被覆的微粒的两倍的粒径和高的正zeta电位。发现两种表面被覆了的微粒作为胶体悬浊液是稳定的。

表4

在两种不同缓冲液体系中的表面被覆了的PLGA微粒(PLGA 100/CS/Ins)

* 在水中测量

** 在0.5 mM柠檬酸溶液(pH 6.0)中测量

CS: 壳聚糖，Ins: 胰岛素

实施例2: 在具有两种不同胰岛素浓度的20 mM MES缓冲液体系中制备用药物-表面被覆聚合物复合物表面被覆了的微粒体系

将2ml于 0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 160 μg/ml或800μg/ml)加入2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 0.72 mg/ml或3.6 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将4ml于0.5 mM柠檬酸溶液中如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 0.5 mg/ml或2.5 mg/ml)悬浊液加入该壳聚糖/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH (0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入盐和补充物以提供与表5所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。

表5

20 mM MES 0.5 mM柠檬酸等渗缓冲液(pH 6.0)的组成

	MW	g/L	浓度 (mM)	离子强度 (mM)
					D-葡萄糖	180.16	1.80	10	----
MgCl₂	95.21	0.0468	0.492	1.476
					KCl	74.55	0.340	4.56	4.56
CaCl₂?2H₂O	147.02	0.176	1.2	3.6
					柠檬酸	192.1	0.096	0.5	0.8
MES	195.2	3.90	20	8
					NaCl	58.44	7.92	135.56	135.56

分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。两种表面被覆了的微粒样品表现出优选的粒径和zeta电位(表6)；粒径约为未被覆的颗粒的两倍(表4)并且zeta电位为高的正电位。发现两种表面被覆了的微粒作为胶体悬浊液是稳定的。

表6

在两种不同胰岛素浓度下表面被覆了的PLGA微粒

	直径(nm)	zeta电位 (mV)
			PLGA 100/CS/Ins = 250/180/40 μg/ml	221.8 ± 77.9	+ 30.2 ± 2.5
PLGA 100/CS/Ins = 1250/900/200 μg/ml	189.6 ± 36.8	+ 30.2± 3.0

CS: 壳聚糖, Ins: 胰岛素

实施例3: 使用聚-L-精氨酸作为表面被覆聚合物制备表面被覆了的PLGA微粒体系

使用胰岛素(pI约5.3)作为蛋白质药物，并且使用聚-L-精氨酸作为带正电的表面被覆聚合物。

将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 6.0)中的牛胰岛素(Sigma, 40μg/ml)加入3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 6.0)中的聚-L-精氨酸(MW 125 kDa, Sigma；2.88 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将6ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 6.0; PLGA微粒浓度: 250μg/ml)悬浊液加入该聚-L-精氨酸/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。向其中加入盐和补充物以提供与表5所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为285.9± 90.6 nm，并且发现zeta电位为+ 48.3± 0.9 mV。

实施例4: 使用壳聚糖和聚-L-精氨酸作为表面被覆聚合物制备表面被覆了的PLGA微粒体系

使用胰岛素(pI约5.3)作为蛋白质药物，并且使用壳聚糖和聚-L-精氨酸作为带正电的表面被覆聚合物。

将2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 800 μg/ml)加入2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(MW 143 kDa, 0.36 mg/ml)和聚-L-精氨酸(MW 125 kDa, Sigma；1.8 mg/ml)的混合物，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将4ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 2.5 mg/ml)悬浊液加入该壳聚糖/聚-L-精氨酸/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。向其中加入盐和补充物以提供与表7所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为336.1 ± 20.8 nm，并且发现zeta电位为+ 40.3 ± 3.4 mV。

表7

5 mM MES 0.5 mM柠檬酸等渗缓冲液(pH 6.0)的组成

	MW	g/L	浓度 (mM)	离子强度 (mM)
					D-葡萄糖	180.16	1.80	10	----
MgCl₂	95.21	0.0468	0.492	1.476
					KCl	74.55	0.340	4.56	4.56
CaCl₂?2H₂O	147.02	0.176	1.2	3.6
					柠檬酸	192.1	0.096	0.5	0.8
MES	195.2	0.98	5	2
					NaCl	58.44	8.27	141.56	141.56

实施例5: 使用另一种制备方法制备胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒体系

将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的0.1% w/v 聚苯乙烯微粒(MolecularProbe, 羧化的FluoSpheres)加入3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 180μg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少1小时。将6ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 20 μg/ml)加入上述聚苯乙烯和壳聚糖的混合物，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH (0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入盐和补充物以提供与表5所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。

分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为302.0 ± 68.6 nm，并且发现zeta电位为+ 27.9± 1.7 mV。聚苯乙烯核颗粒的直径为196.7 ± 27.5 nm，表明在该聚苯乙烯核颗粒的***周围存在厚度约50 nm的层。

实施例6: 使用另一种制备方法制备胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒体系

将1.8ml于丙酮溶液中的具有50:50的丙交酯:乙交酯比例的PLGA(RESOMER RG 502H, Bohringer Ingelheim)(PLGA 0.01% (w/v): 可制备约20 nm的PLGA颗粒的浓度)加入6ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 73 kDa, 0.25 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下直到丙酮完全蒸发。将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 160 μg/ml)加入3 ml该PLGA/壳聚糖悬浊液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH (0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且加入盐和补充物以产生与表2所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。通过DLS 802 (Viscotek)测量该表面被覆了的微粒的粒径。发现该颗粒的平均直径为146.1 ± 35.8 nm。该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。

实施例7: 制备用于动物试验的胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒体系

使用胰岛素(pI约5.3)作为蛋白质药物，并且使用壳聚糖作为带正电的表面被覆聚合物。制备样品以具有用于动物试验的高浓度(胰岛素浓度6 mg/mL)。

将牛胰岛素水溶液(15 ml, Sigma, 320 μg/ml, pH 4.5)和0.02 ml 50 mM柠檬酸水溶液加入15 ml壳聚糖水溶液(由Koyo Chemical生产, Koyo Chitosan FL-80, 1.44 mg/mL, pH 4.5)，将pH调节至4.5± 0.1，并且使该混合物静置约1小时。然后加入30 ml PLGA微粒(粒径约100 nm, PLGA微粒浓度1 mg/mL, pH 4.5)悬浊液和0.02 ml 50 mM柠檬酸水溶液，并且将pH调节至4.5。使所得溶液静置1小时，将pH调节至6.0，使麦芽糖(0.421 g)溶于其中，并且pH证实为6。将由此制备的溶液用液氮冷冻，然后冻干。将冻干的产品再次分散在体积相当于冻干前溶液的1/15的蒸馏水中。将再悬浊液离心分离(19400×G, 3小时, 4℃)并且除去4/5体积的上清液，由此将颗粒部分浓缩得到用于动物试验的样品(胰岛素浓度6 mg/mL)。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为252 nm，并且发现zeta电位为+ 10.6 mV。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，通过下述方法测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的胰岛素的比例，发现装载效率为93%。

实施例8: 制备用于释放试验的胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒体系

将牛胰岛素水溶液(15 ml, Sigma, 320μg/ml, pH 4.5)和0.02 ml 50 mM柠檬酸水溶液加入15 ml壳聚糖水溶液(由Koyo Chemical生产, Koyo Chitosan FL-80, 1.44 mg/mL, pH 4.5)，将pH调节至4.5 ± 0.1，并且使该混合物静置约1小时。然后加入30 ml PLGA微粒(粒径约100 nm, PLGA微粒浓度1 mg/mL, pH 4.5)悬浊液和0.02 ml 50 mM柠檬酸水溶液，并且将pH调节至4.5。使所得溶液静置1小时，将pH调节至6.0，使麦芽糖(0.421 g)溶于其中，并且pH证实为6。

实施例9: 使用阳离子壳聚糖衍生物作为表面被覆聚合物制备表面被覆了的PLGA微粒体系(pH 8)

使用胰岛素(pI约5.3)作为蛋白质药物，并且使用阳离子壳聚糖衍生物作为带正电的表面被覆聚合物。

将2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 0.32 mg/ml)加入2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的阳离子壳聚糖衍生物(由Dainichiseika生产, 阳离子壳聚糖衍生物溶液, 1.44 mg/ml)，并且将该混合物在室温下静置至少30分钟。将4ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 1.0 mg/ml)悬浊液加入该阳离子壳聚糖衍生物/胰岛素溶液，并且使该混合物在室温下静置至少1小时。向其中加入麦芽糖至10% w/v，并且通过加入NaOH将pH调节至8。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径。发现该颗粒的平均直径为230 nm。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，通过下述方法测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的胰岛素的比例，发现装载效率为74% w/w。

实施例10:使用阳离子壳聚糖衍生物作为表面被覆聚合物制备表面被覆了的 PLGA微粒体系(pH7)

将2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 7.0)中的牛胰岛素(Sigma, 0.32 mg/ml)加入2ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 7.0)中的阳离子壳聚糖衍生物(由Dainichiseika生产, 阳离子壳聚糖衍生物溶液, 1.44 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少30分钟。将4ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 7.0; PLGA微粒浓度: 1.0 mg/ml)悬浊液加入该阳离子壳聚糖衍生物/胰岛素溶液，并且使该混合物在室温下静置至少1小时。向其中加入麦芽糖至10% w/v，并且证实pH为7。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为234 nm，并且发现zeta电位为+ 11.3 mV。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，通过下述方法测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的胰岛素的量，发现装载效率为65% w/w。

实施例11: 使用带正电药物和带负电表面被覆聚合物制备表面被覆了的微粒体系

使用佐米曲坦(pKa=9.5)作为带正电的低分子量药物，并且使用聚丙烯酸作为带负电表面被覆聚合物。

将4 ml三甲胺改性的聚苯乙烯颗粒的水悬浊液(1 mg/ml, micromer NR3+ 100 nm, Corefront Corporation)加入2 ml含水聚丙烯酸溶液(由Wako Pure Chemical Industries生产, 平均分子量250,000, 1.44 mg/ml)，并且将该混合物轻轻搅拌。约1小时后，向其中加入2 ml含水佐米曲坦溶液(640μg/ml)，将该混合物轻轻搅拌，并且将pH调节至6.0。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为330 nm，并且发现zeta电位为- 75 mV。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，根据下述方法(在不同的HPLC条件下)测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的药物的量，发现装载效率为14% w/w。

实施例12: 使用带正电药物和带负电表面被覆聚合物制备表面被覆了的微粒体系

使用溴己新盐酸盐作为带正电的低分子量药物，并且使用聚丙烯酸钠作为带负电表面被覆聚合物。

将1 ml溴己新盐酸盐水溶液(640 μg/ml)和1 ml蒸馏水加入2 ml聚丙烯酸钠水溶液(聚合度2,700-7,500，由Wako Pure Chemical Industries生产, 1.44 mg/ml)，并且将该混合物轻轻搅拌。约1小时后，向其中加入4 ml三甲胺改性的聚苯乙烯颗粒的水悬浊液(1 mg/ml, micromer NR3+ 100 nm, Corefront Corporation)，将该混合物轻轻搅拌，并且将pH调节至6。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为160 nm，并且发现zeta电位为- 57 mV。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，根据下述方法(在不同的HPLC条件下)测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的药物的量，发现装载效率为88% w/w。

实施例13: 使用带正电药物和带负电表面被覆聚合物制备表面被覆了的微粒体系

使用溴己新盐酸盐作为带正电的低分子量药物，并且使用聚-γ-谷氨酸钠作为带负电表面被覆聚合物。

将1 ml溴己新盐酸盐水溶液(640 μg/ml)和1 ml蒸馏水加入2 ml聚-γ-谷氨酸钠溶液(平均分子量200,000-500,000，由Wako Pure Chemical Industries生产, 1.44 mg/ml)，并且将该混合物轻轻搅拌。约1小时后，向其中加入4 ml三甲胺改性的聚苯乙烯颗粒的水悬浊液(1 mg/ml, micromer NR3+ 100 nm, Corefront Corporation)，将该混合物轻轻搅拌，并且将pH调节至6。

通过Zeta sizer Nano (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为203 nm，并且发现zeta电位为- 63 mV。发现该颗粒作为胶体悬浊液是稳定的。另外，根据下述方法(在不同的HPLC条件下)测量本实施例中与该表面被覆了的微粒结合的药物的量，发现装载效率为32% w/w。

实验例1: 评价在微粒表面上药物和表面被覆聚合物的相互作用

将1ml于表5中所述的缓冲液中的用胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒的悬浊液(PLGA 100/壳聚糖/胰岛素=500/360/80μg/ml)加入微管并且在18000 rpm (23900×g)下离心分离60 min。将沉淀用表5中所述的缓冲液冲洗。在将pH 4.5或pH 6.0解离缓冲液加入该沉淀后，将每根管在室温下振荡2小时。再次在相同条件下将悬浊液离心分离15 min并且收集上清液。然后通过ELISA定量分析每一上清液缓冲液中的胰岛素浓度。

表明在其中壳聚糖和胰岛素都带正电因此静电力导致它们的吸引相互作用低的pH 4.5缓冲液的情况下，胰岛素的量显著高于在其中两者为相反电荷，因此静电吸引力变得更大的pH 6.0的情况(图2)。应该注意在解离试验之前通过上述洗涤操作除去了游离的胰岛素和壳聚糖。这些结果表明壳聚糖/胰岛素复合物存在于微粒表面上。

将1ml于表2中所述的缓冲液中的通过实施例1所述方法制备的用胰岛素/壳聚糖表面被覆了的PLGA微粒(PLGA 100/壳聚糖/胰岛素=250/180/40 μg/ml)的悬浊液加入微管并且在18000 rpm (23900×g)下离心分离60 min。将沉淀用表2所述的缓冲液冲洗。在使清洗后的沉淀重新悬浊于该缓冲液中，铺展在玻璃板上并且自然干燥约48小时，得到TOF-SIMS样品。作为用于比较的对照，还制备在其上铺展有胰岛素、壳聚糖或者通过制备例1的方法制备的PLGA 100的玻璃板样品。

将这些样品各自通过TOF-SIMS IV装置(ION-TOF GmbH)测量存在或不存在对应于胰岛素的半胱氨酸残基的SH的峰(m/z=33)。结果，在PLGA和壳聚糖中没有检测到显著水平的m/Z=33峰。然而，在上述洗涤后的表面被覆了的微粒样品中和在胰岛素样品中检测到强的峰。每一样品的测量结果示于图3的上面的区域。

另外，对于上述洗涤后的表面被覆了微粒还证实了在观测区域中的m/z=33分布(图3中下侧左边的区域)和总离子分布(图3中下侧右边的区域)，并且还证实了两者的分布图案匹配，即由颗粒检测出m/z＝33。

与特异性相关的上述测量结果和粒径分布图像的结果表明在洗涤后在表面被覆了的微粒的表面上存在胰岛素。

实验例2: 评价药物装载效率和装载容量

如下制备将进行实验的样品。

[PLGA/壳聚糖/胰岛素(1000/720/160 μg/ml)表面被覆了的微粒(于表8所述的缓冲液中)]

将4.5ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 0.64 mg/ml)加入4.5ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 2.88 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将9ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 2.0 mg/ml)悬浊液加入该壳聚糖/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH(0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入葡萄糖以提供与表8所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。

表8

100 mM 葡萄糖0.5 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0; 非等渗)的组成

	MW	g/L	浓度 (mM)	离子强度 (mM)
					D-葡萄糖	180.16	18.0	100	----
柠檬酸	192.1	0.096	0.5	0.8

分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为248.8 ± 94.2 nm，并且发现zeta电位为+ 8.7± 0.5 mV。

[PLGA/壳聚糖/胰岛素(250/90/40 μg/ml)表面被覆了的微粒(于表8所述的缓冲液中)]

将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 160 μg/ml)加入3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 0.36 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将6ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 500 μg/ml)悬浊液加入该壳聚糖/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH(0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入葡萄糖以提供与表8所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。

分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为253.7 ± 31.3 nm，并且发现zeta电位为+ 6.4 ± 1.8 mV。

[PLGA/聚-L-精氨酸/胰岛素(125/720/40 μg/ml) 表面被覆了的微粒(于表5所述的缓冲液中)]

将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 6.0)中的牛胰岛素(Sigma, 160 μg/ml)加入3ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 6.0)中的聚-L-精氨酸(MW 125 kDa, Sigma；2.88 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少约30 min。将6ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径)(pH 6.0; PLGA微粒浓度: 250 μg/ml)悬浊液加入该聚-L-精氨酸/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。向其中加入盐和补充物以提供与表5所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。分别通过DLS 802 (Viscotek)和Zeta sizer 2000 (Malvern)测量该表面被覆了的微粒的粒径和zeta电位。发现该颗粒的平均直径为497.4 ± 141.9 nm，并且发现zeta电位为+ 44.3 ± 2.1 mV。

通过下述方法测量胰岛素的装载效率和装载容量

[结合的胰岛素的分析方法]

将0.5 ml或1 ml每一上述样品加入1.5 ml微管并且离心分离(15000 rpm (21900×g), 180 min, 4℃)。收集上清液并且使用胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia牛胰岛素ELISA)和稀释缓冲液(Mercodia糖尿病样品缓冲液)或HPLC测量该上清液中的胰岛素浓度(胰岛素浓度取作A)。作为对照，将于1.5 ml微管中的0.5 ml或1 ml每一上述样品在4℃下保持180 min，并且以相同的方式测量所有样品中的胰岛素浓度(胰岛素浓度取作B)。

如下计算装载效率和装载容量：

装载效率(%) = 100×((B的平均值)-A)/(B的平均值));

装载容量(%) = 结合的胰岛素质量比核颗粒的总质量=100×((B的平均值)-A)/核颗粒总质量

(核颗粒总质量=颗粒数目×4/3×3.14×(核颗粒半径)³×密度)。

通过上述方法的胰岛素装载的分析结果示于表9中。

表9

表面被覆了的微粒的胰岛素装载效率和胰岛素装载容量

a: 装载效率

b: 装载容量

CS: 壳聚糖, Ins: 胰岛素

实验例3: 评价复合在微粒表面的胰岛素的稳定性

在本实验中使用用于实验例2的于表8所述的缓冲液中的PLGA/壳聚糖/胰岛素(1000/720/160 μg/ml)表面被覆了的微粒作为样品。作为对照，使用具有与表8所述的缓冲液相同溶剂组成的胰岛素溶液(pH 6; 胰岛素浓度: 160 μg/ml)。

如下制备将用于酶反应的样品。

将得自于牛胰腺的α-胰凝乳蛋白酶(Fluka Biochemika; code No. 27270)溶于5 mM MES缓冲液(pH 6.0)至40 μg/ml的浓度。将1 ml样品在37℃下加热15 min，加入以相同方式预热的0.6 ml 5 mM MES缓冲液(pH 6.0)和以相同方式预热的0.4ml于5 mM MES缓冲液中的α-胰凝乳蛋白酶(pH 6.0；α-胰凝乳蛋白酶浓度：40 μg/ml)。伴随着振荡在37℃下将该混合物培养30 min。通过加入1 ml冰冷却的冰醋酸终止酶反应。将该反应混合物在混合机中搅拌1 min，置于室温下不少于1小时，并且通过具有0.1 μm滤器直径的过滤器，得到用于HPLC分析的样品。

如下制备不含酶的对照样品。

将1 ml样品与1 ml 5 mM MES缓冲液(pH 6.0)和1 ml冰醋酸混合。然后将该混合物在混合机中搅拌1 min，置于室温下不少于1小时，并且通过具有0.1 μm滤器直径的过滤器，得到用于HPLC分析的样品。

如下制备用于胰岛素定量分析的校正曲线的标准样品。

将1 ml胰岛素溶液(40-160 μg/ml)与1 ml 5 mM MES 缓冲液(pH 6.0)和1 ml冰醋酸混合，并且将该混合物在混合机中搅拌。将该混合物用作用于HPLC分析的校正曲线的标准样品。

在以下条件下进行样品的HPLC分析:

C18柱(Inertsil ODS-2, 5 μm, 250 mm × 4.6 mm);

流动相A: 0.1% TFA水溶液, 流动相B: 0.1% TFA CH₃CN 溶液;

梯度条件(流动相B浓度): 在0 min: 30%, 在10 min: 40%, 在11 min: 30%, 在16 min: 30%;

柱式加热炉温度: 40℃, 流动速率: 1.0 ml/min, 注射体积: 20 μl, 检测: UV275nm。

作为在上述条件下的分析结果，酶反应后残留的胰岛素的比例在PLGA/壳聚糖/胰岛素中为83.9% ± 2.3%，在胰岛素溶液中为61.8% ± 2.0%。换句话说，与游离胰岛素溶液的38.2%相比，实验期间只有16.1%的表面被覆了的复合胰岛素降解(图4)。

这些结果表明胰岛素对于酶反应的稳定性显著提高。

实验例4: 使用表面被覆了的微粒评价胰岛素输送穿过猪鼻粘膜

使用胰岛素(pI 约5.3)作为蛋白质药物，并且使用壳聚糖和聚-L-精氨酸作为带正电的表面被覆聚合物。以与实施例4相同的方式制备表面被覆了的微粒。作为对照，使用具有与表7中所述的缓冲液相同溶剂组成的胰岛素溶液(pH 6;胰岛素浓度: 200 μg/ml)。从猪鼻腔(呼吸区域)分离猪呼吸粘膜组织。在置于水平扩散室之前，将该分离的组织保存在具有与实施例4中使用的缓冲液相同组成的缓冲液(氧化并冷却)中。将该组织切成合适的尺寸并且放在图5所示的水平扩散室的给体单元和受体单元之间 (粘膜的有效面积: 0.79 cm²)。将新鲜的(上述)缓冲液(氧化并冷却)注入给体单元和受体单元，并且使两个单元在加热至29 ± 1℃的循环水中培养30 min。并且使该组织平衡。在输送研究期间用氧处理注入该给体单元和受体单元的缓冲液，并且用加热至29 ± 1℃的循环水加热两个单元。通过Alamar Blue Assay和组织的TEER值的测量证实输送研究之前和之后的组织的存活以及不存在损伤。

通过用相同量的每一样品代替给体单元中的全部缓冲液开始输送研究。在选择的时间点下从受体单元取出200 μl样品并且用相同量的新鲜缓冲液(氧化并且加热至29 ± 1℃)代替。使用胰岛素ELISA试剂盒和稀释缓冲液分析从受体单元取出的样品。分析结果示于图6。图6表明与加入对照的胰岛素溶液相比，当加入壳聚糖/聚-L-精氨酸/胰岛素表面被覆了的PLGA微粒时，更大量的胰岛素输送通过分离的鼻呼吸粘膜组织。

实验例5: 表面被覆了的微粒的粒径分布的测量

将1.5ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的牛胰岛素(Sigma, 0.8 mg/ml)加入1.5ml于0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)中的壳聚糖(Bioneer 143 kDa, 3.6 mg/ml)，并且将该混合物置于室温下至少30 min。将3ml于0.5 mM柠檬酸溶液中的如制备例1所述制备的PLGA微粒(约100 nm直径；下文中也将称为“PLGA 100”)(pH 4.5; PLGA微粒浓度: 2.5 mg/ml)悬浊液，或者将单独的0.5 mM柠檬酸溶液(pH 4.5)加入该壳聚糖/胰岛素溶液，并且将该混合物置于室温下至少1小时。通过加入NaOH(0.1-2.5N)将pH增至6.0，并且向其中加入盐和补充物以提供与表2所述的缓冲液相同的悬浊液溶剂组成。通过DLS 802 (Viscotek)测量该表面被覆了的微粒或壳聚糖/胰岛素混合物的粒径。

结果示于图7中。图7(a)表示表面被覆了的微粒的粒径分布，和图7(b)表示壳聚糖/胰岛素混合物的粒径分布。另外，它们每一个的峰区域的强度、百分比、粒径和标准偏差示于表10和11中。

[表10]

区域中的%	直径(nm)	标准偏差
			0.2	0.1	-
0.2	0.3	0.0
			0.3	2.0	0.1
93.3	218.3	51.6
			6.0	9.6E+06	5.3E+06

[表11]

区域中的%	直径(nm)	标准偏差
			1.4	17.1	1.1
7.4	118.9	14.0
			37.8	345.9	54.9
5.8	2.6E+03	1.9E+02
			47.6	6.0E+04	7.6E+03

当加入PLGA颗粒时，获得单分散的粒径。当不加入PLGA颗粒时，获得包括大粒径的多分散的粒径分布。结果表明核颗粒的存在提供具有均匀粒径的表面被覆了的微粒。

实验例6: 证实将表面被覆了的微粒悬浊液配制成干粉的可能性

通过实施例1的方法制备[PLGA100/壳聚糖/胰岛素 (250/180/40 μg/ml)表面被覆了的微粒(于表2所述的缓冲液中)]。将该悬浊液冻干并且再悬浊于如冻干之前相同量的水中。使用DLS 802 (Viscotek)测量冻干前的粒径以及冻干和再悬浊后的粒径。粒径测量结果示于图8中。图8(a)表示冻干前的粒径分布，和图8(b)表示冻干和再悬浊后的粒径分布。另外，它们每一个的峰区域的强度、百分比、粒径和标准偏差示于表12和13中。

[表12]

区域中的%	直径(nm)	标准偏差
			0.3	0.7	0.0
0.3	4.9	0.0
			81.7	183.0	21.2
17.6	118,000.0	40,000.0

[表13]

区域中的%	直径(nm)	标准偏差
			0.4	0.0	0.0
0.4	0.3	0.0
			0.3	8.7	0.4
80.6	229.4	47.9
			2.3	5,325.6	669.2
15.9	128,000.0	34,200.0

冻干前的粒径为183.0 ± 21.2 nm，并且冻干和再悬浊后的粒径为229.4 ± 47.9 nm。结果表明主要组分的粒径不会由于冻干和再浊浮而显著变化，并且不会产生显著的凝聚体。从该结果明显看出，本发明的表面被覆了的微粒不仅可作为悬浊液而且可以以其他剂型例如干粉等使用。

实验例7: 表面被覆了的微粒对大鼠鼻腔的体内给药的试验

使用大鼠(血统: SD大鼠, 7周龄, 雄性, 饲养者: Japan SLC) 用于试验。从试验前一天的晚上开始使大鼠禁食。通过肌肉内注射和腹部灌注在麻醉下进行试验。在血糖浓度变稳定后，将样品向鼻腔给药，并且在10、20、30、60、90和120分钟后从尾部静脉取样血液。使用血糖检测试剂盒(由Terumo生产, Medisafe Mini)测量血糖水平。

作为样品，将实施例7所述的表面被覆了的微粒以20 μl/300 g体重(400 μg胰岛素/kg体重)向大鼠的鼻腔给药。作为对照，还将各自具有与实施例7相同的溶剂组成的于0.5 mM 柠檬酸(pH 6) (缓冲液)中的10% w/v麦芽糖溶液、胰岛素溶液(pH 6: 胰岛素浓度: 6 mg/ml,于0.5 mM柠檬酸中的10% w/v麦芽糖)、壳聚糖/胰岛素混合物 (pH 6; 壳聚糖浓度: 27 mg/ml, 胰岛素浓度: 6 mg/ml, 于0.5 mM柠檬酸中的10% w/v麦芽糖), 向大鼠的鼻腔给药。

试验结果示于图9中。图9表明与对照的缓冲液和胰岛素溶液给药相比，血糖水平急剧降低，并且即使当与壳聚糖/胰岛素混合物相比时，初始血糖水平也迅速降低，并且本发明的实施例对肽药物的经粘膜传递展现出优良的促进效果。

实验例8: 使用表面被覆了的微粒的体内释放试验

将0.5 mL得自实施例8的样品加入1.5 mL Eppendorf管并且离心分离(13600 rpm (19400×G), 3 hr, 4℃)，得到沉淀。作为用于释放试验的液体，制备于5 mM MES中的152 mM NaCl水溶液(pH 6.0, 生理等渗离子强度154 mM)。

将0.5 mL用于释放试验的该液体加入该沉淀，并且通过移液和在混合机中使该沉淀再分散，并且将分散液放入10 mL玻璃小瓶。将Eppendorf管用0.5 mL用于释放试验的新鲜液体洗涤，并且将洗液放入上述玻璃小瓶(总悬浊液1 mL)。将含有悬浊液的玻璃小瓶在37℃, 75rpm下振荡以进行释放试验。在预定时间(0、0.5和3小时)后，使悬浊液通过0.1 μm过滤器(Sartorius)得到滤液。将该滤液与1/2体积的5%磷酸在混合机中混合，得到HPLC样品，其用于分析释放的胰岛素的量。

为了将释放前的胰岛素含量定量，将1 mL蒸馏水和0.5 mL 5%磷酸加入该沉淀，在混合机中混合并且在4℃下静置过夜。将该混合物重新在混合机中混合并且通过0.1 μm过滤器(Sartorius)，得到HPLC样品，其用于定量分析该沉淀中的胰岛素含量。

使用上述胰岛素HPLC分析条件定量分析胰岛素。

释放率(%) = 100×(释放的液体的胰岛素含量/释放前沉淀的胰岛素含量)

释放试验结果示于图10，其中几乎所有含于沉淀中的胰岛素在释放试验的3小时内释放。

产业实用性

使用本发明组合物使得能够有效经粘膜给药低分子量药物和聚合物药物例如肽和蛋白质，其到目前为止难以通过除了注射之外的方法给药。本发明组合物中包含的药物与表面被覆聚合物和微粒形成复合物，并且由此具有比当含于溶液制剂中时更高的稳定性(例如对于酶的稳定性、保存稳定性)，以及具有与其中药物封装在微粒基质中的微粒制剂相比更高的药物装载容量。而且，根据在微粒表面上与药物形成复合物的表面被覆聚合物的类型，可以生成表现出药物的持续释放或立即释放的表面被覆了的微粒并控制药物的经粘膜吸收性。

本申请基于在日本提交的专利申请No. 2008-172669 (申请日: 2008年7月1日)，其内容在此全部引入。

Claims

1.组合物，其是含有（a）在预定的pH具有正或负的电荷的药物、（b）医药上可接受的微粒和（c）在该pH可带电的医药上可接受的表面被覆聚合物的经粘膜给药用医药组合物，其特征在于，该表面被覆聚合物将该微粒的表面被覆，该药物通过该表面被覆聚合物固定在该微粒的表面，并且通过该微粒和该表面被覆聚合物以非共价键相互作用，同时该表面被覆聚合物和该药物静电相互作用形成复合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述微粒和上述表面被覆聚合物的非共价键的相互作用是静电相互作用。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，预定的pH是给药部位的生理pH。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，上述药物选自肽、蛋白质、DNA、RNA、siRNA、多糖、抗原和低分子量药物。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，上述药物是可带来药效或疫苗效果的药物。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中，上述药物为胰岛素。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中，上述药物是选自溴己新、佐米曲坦和它们的盐中的至少1种的药物。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的组合物，其中，在上述预定的pH下，上述表面被覆聚合物单独是水难溶性的。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，上述表面被覆聚合物是选自壳聚糖、多聚精氨酸、聚丙烯酸、聚-γ-谷氨酸和它们的盐中的至少1种聚合物。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的组合物，其中，上述表面被覆聚合物是粘膜附着性的和/或作为经粘膜吸收促进因子发挥功能。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其中，上述微粒含有聚合物，所述聚合物含有羧基或氨基。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的组合物，其中，上述微粒包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的组合物，其中，在上述预定的pH中的上述复合物的平均粒径为10nm以上并且50μm以下。

14.方法，其是权利要求8所述的组合物的制备方法，其特征在于，

（a）在上述表面被覆聚合物为易水溶性的pH下，将上述药物、上述微粒和上述表面被覆聚合物混合，

（b）将该混合液的pH调节为上述预定的pH。

15.方法，其是权利要求1～13中任一项所述的组合物的制备方法，其含有，

（a）在上述药物和上述表面被覆聚合物具有相同符号的电荷的pH条件下，将上述药物、上述表面被覆聚合物和上述微粒混合后，

（b）将该混合物的pH调节为上述药物的电荷变成相反符号的pH，

其中，上述药物为两性药物。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，在上述工序（a）的pH条件下，上述微粒带上与上述药物和上述表面被覆聚合物的电荷相反符号的电荷。

17.方法，其是权利要求1～13中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，

（a）将上述微粒材料的有机溶剂溶液向上述表面被覆聚合物的水溶液中滴加，

（b）使该有机溶剂挥发后，

（c）添加上述药物并混合，

（d）将该混合液的pH调节至上述预定的pH。