KR100593397B1

KR100593397B1 - 중배엽 줄기세포 및/또는 ｐ 물질을 함유하는 상처 치유또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제

Info

Publication number: KR100593397B1
Application number: KR1020040086359A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 홍현숙; 김재찬
Original assignee: 한국원자력연구소; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2006-06-28
Also published as: EP1658855A2; US20060127373A1; US20140065109A1; JP5134772B2; JP2006124389A; EP1658855B1; ATE423565T1; CN1824289B; CN1824289A; DE602005012905D1; KR20060037176A; US8551470B2; EP1658855A3; US9254305B2

Abstract

본 발명은 중배엽 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells) 및/또는 P 물질(Substance P)의 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로서의 용도, 및 P 물질의 중배엽 줄기세포의 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

중배엽 줄기세포 및/또는 Ｐ 물질을 함유하는 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제{Wound healing or wound healing promotive agent, or cell therapeutic agent containing mesenchymal stem cells and/or Substance P}

도 1은 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼에서 c-kit+ 줄기세포가 말초혈액과 상처 층에 나타나는 것을 보여주는 사진이고(→: c-kit+ 세포);

도 2a는 각막에 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 적출한 안구의 RT-PCR 분석 결과를 보여주는 사진이며;

도 2b는 각막에 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 분리한 말초혈액의 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이고;

도 2c는 각막에 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 각막 상처 층의 H&E 염색 및 P 물질에 대한 항체로의 면역조직화학 염색 결과를 보여주는 사진이며;

도 2d는 각막에 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 각막 상처 층의 c-kit, CD-29, 및 α-SM 액틴에 대한 항체로의 면역조직화학 염색 결과를 보여주는 사진이고;

도 3a는 P 물질을 정맥주사한 마우스에서 분리한 혈액의 항-CD29 항체로의 면역조직화학 염색 결과를 보여주는 사진이고;

도 3b는 P 물질을 정맥주사한 마우스에서 분리한 혈액 내 CD-29+ 세포 수 측정 결과를 나타낸 그래프이며(n=3);

도 4a는 P 물질 처리에 의해 인간 중배엽줄기세포가 3-D 콜라겐 젤 상에서 콜라겐 젤을 분해함을 상 대비 현미경으로 관찰한 사진이고;

도 4b는 P 물질 처리에 의해 인간 중배엽줄기세포가 3-D 콜라겐 젤 상에서 배양액으로 분비한 젤라틴 단백분해효소 활성도 검색 결과를 보여주는 사진이며;

도 4c는 P 물질 처리에 의해 인간 중배엽줄기세포가 분비한 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 및 TIMP-2를 각각의 항체로 면역침전한 결과를 보여주는 사진이고;

도 5a는 P 물질 처리 후 인간 중배엽줄기세포의 생존세포 수를 나타낸 그래프이며(n=4, 평균±표준편차)

도 5b는 P 물질 존재 하에 배양된 인간 중배엽줄기세포의 β-카테닌 항체를 이용한 면역형광 염색결과를 보여주는 사진이고;

도 5c는 P 물질 처리된 인간 중배엽줄기세포에서 분비된 VEGF의 ELISA 결과를 나타낸 그래프이며;

도 5d는 P 물질 존재 하에 인간 중배엽줄기세포가 배양 상등액으로 분비한 피브로넥틴(FN)을 항-FN 항체로 웨스턴 블랏 분석한 결과를 보여주는 사진이고;

도 6a는 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼에서 DiⅠ 표지된 토끼 증배엽줄기세포를 주입한 후 안구를 슬릿-램프로 관찰한 결과를 보여주는 사진이며;

도 6b는 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼의 각막 FLAT 마운트에서 DiⅠ 표지된 중배엽줄기세포를 형광 입체현미경 하에 관찰한 결과를 보여주는 사진이고;

도 7a는 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼에서 P 물질을 정맥투여한 군과 대조군의 손상 회복 정도를 육안으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이며;

도 7b는 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼에서 P 물질을 정맥투여한 군과 대조군의 안구를 적출 고정하여 H&E 염색한 결과를 보여주는 사진이고;

도 7c는 각막에 알칼리 화상을 입힌 토끼에서 P 물질을 정맥투여한 군과 대조군의 안구 조직을 CD-29 항체로 면역조직화학 염색한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 중배엽 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells) 및/또는 P 물질(Substance P)의 상처 치유(wound healing) 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로서의 용도, 및 P 물질의 중배엽 줄기세포의 유리(mobilization) 또는 증식(proliferation), 또는 유리 또는 증식 촉진제로서의 용도에 관한 것이다.

P 물질은 감각 뉴우런, 대식세포, 호산구, 내피세포와, 상피세포 및 케라토사이트와 같은 각막 세포, 및 육아조직에서 발현되는 11개의 아미노산으로 이루어진 뉴로펩티드이다. P 물질이 조혈 조절에 대한 신경-면역 커뮤니케이션에 관여하고 있음이 몇몇 보고서에서 제안된 바 있다. P 물질 신경의 신경 섬유가 골수 기질에 분포하고 있으며, P 물질은 골수 기질세포의 표면 수용체 NK-1을 통해 신호를 전달하여 골수 기질세포를 자극함으로써, 골수 기질세포가 공급자로서 조혈 촉진에 유리한 줄기세포 인자 및 인터류킨-1을 생산하도록 한다. 그러나, 지금까지 전신적인 혈류를 통해 제공되는 P 물질의 MSC 이동 및 MSC 재증식(repopulation)에서의 역할은 보고된 바 없다.

한편, 상처 자체는 모두 이웃 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 독특하고 특이한 미세환경(microenvironment)을 창출한다. 상처 미세환경의 일부 인자는 충분히 오랜 기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 골수의 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로의 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에의 참여를 유발할 수 있다.

골수 줄기세포와 배양된 중배엽 줄기세포(MSC)를 이용한 최근 세포이식 실험 결과, 이들이 폐, 위장관계 및 경색된 심근의 조직 수복에 관여하는 것으로 나타났다. 그러나, 상처가 없는 정상적 생리 상태에서, MSC는 지방 조직과 익상편(pterygium)과 같은 골수 이외의 조직에서는 검출되지만, 말초혈액에서는 거의 검출되지 않는다. 따라서, 조직 수복 및 병리학적 진전 동안 골수로부터 다른 말초조직으로 MSC를 이동(mobilize)시키는 특정 시스템이 존재할 것으로 생각된다.

각막은 투명하고 무혈관성이며 많은 신경이 통하는 조직으로 구성되어 있으며, 각막 손상 및 질환 시 그 본래의 상태가 파괴될 수 있다. 각막 상처는 윤부 줄기세포에 의해 제공되는 것으로 여겨지는 각막 상피세포의 측면 이동, 염증세포의 침윤, 및 상처 기질에서의 혈관신생을 자극하며, 이들 모두는 독특한 각막 상처 미세환경에 의해 자극될 수 있다. 이전의 보고에 따르면, 각막 탈신경이 상처 치유과정의 실질적인 지연을 유발하고, 비당뇨 환자 보다 당뇨 환자에서 낮은 수준의 P 물질이 또한 지연된 재상피화와 지연된 치유의 원인인 것으로 제안되었다. 각막 표면은 삼차 신경절 뉴우런에 의해 매우 많은 신경을 가지며, 내생 P 물질이 각막 상피세포와 케라토사이트에서 발현되므로, P 물질의 상처 미세환경에서의 관여와 각막 수복에서의 참여가 예상된다.

본 발명자들은 각막 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 P 물질이 안구와 말초혈액에서 발현수준이 증가하는 최초의 뉴로펩티드임을 발견하였다. 또한, 각막에 화상을 입히지 않고 P 물질을 정맥주사한 경우에도, 훨씬 많은 CD29+ 중배엽 줄기세포가 말초혈액으로 이동하고, 시험관 내 3-D 콜라겐 젤에서 P 물질이 기질 분해효소를 유도하고 이들의 저해제를 저해하여 인간 MSC의 이동을 촉진함을 밝혔다. 또한 P 물질이 MSC의 세포증식, β-카테닌의 핵으로의 이동을 촉진, 이들의 표적 유전자인 VEGF(vascular endothelial growth factor)와 피브로넥틴의 발현을 촉진하는 것을 확인하여, P 물질이 MSC 이동 후 MSC의 골수 재증식에 관여할 것임을 밝혔다. 나아가, 본 발명자들은 알칼리 화상 토끼의 귀 정맥에 주입한 DiⅠ 표지된 MSC가 상처 층에 성공적으로 보급되고 각막 투명도와 시력 회복을 개선시켜, 각막 상처 치유를 용이하게 한다는 사실을 밝혔다. 또한, P 물질을 알칼리 화상 토끼에 정맥주사하여 상처 치유 회복이 실제로 촉진됨을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명의 제1 목적은 중배엽 줄기세포를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제2 목적은 P 물질을 함유하는, 중배엽 줄기세포 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제3 목적은 상기 중배엽 줄기세포 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제4 목적은 P 물질 처리에 의해 골수로부터 중배엽 줄기세포를 유리시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 분리방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제5 목적은 P 물질의 존재 하에 중배엽 줄기세포를 증식시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 확장방법을 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 유효성분으로서 중배엽 줄기세포를 함유하는, 상처, 예를 들어 각막 또는 피부 상처, 치유 또는 치유 촉진제에 관한 것이다.

둘째, 본 발명은 유효성분으로서 중배엽 줄기세포를 함유하는, 세포, 예를 들어 각막 또는 피부 세포, 치료제에 관한 것이다.

본 발명에서, 중배엽 줄기세포는 P 물질 처리에 의해 골수로부터 유리되거나 증식된 것일 수 있다. 본 발명의 제제는 중배엽 줄기세포와 함께 P 물질을 추가로 함유할 수 있다.

셋째, 본 발명은 유효성분으로서 P 물질을 함유하는, 중배엽 줄기세포 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제에 관한 것이다.

넷째, 본 발명은 유효성분으로서 상기 중배엽 줄기세포 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제를 함유하는, 상처, 예를 들어 각막 또는 피부 상처, 치유 또는 치유 촉진제, 또는 세포, 예를 들어 각막 또는 피부 세포, 치료제에 관한 것이다.

다섯째, 본 발명은 P 물질을 처리하여 골수로부터 중배엽 줄기세포를 유리시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.

여섯째, 본 발명은 P 물질의 존재 하에 중배엽 줄기세포를 증식시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 확장방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자에서는, 각막의 투명성과 무혈관성으로 인해, 상처 치유과정 동안 줄기세포의 전신적인 참여를 조사하는데 있어서 다른 상처 모델에 비해 장점을 가질 수 있는 알칼리 화상 각막 동물모델을 사용하였다.

본 발명자들은 각막에 알칼리 화상을 입은 토끼의 각막과 말초혈액에서 c-kit+ 세포가 출현함을 확인한 후, RT-PCR 분석과 ELISA를 이용하여 각막 알칼리 화상을 입힌 마우스에서 상처 미세환경과 말초혈액에서 사이토카인과 다른 인자의 발현 프로파일을 조사하였다. 그 결과, P 물질이 마우스에서 각막 알칼리 화상을 입힌 후 안구와 말초혈액에서 발현수준이 증가하는 최초의 뉴로펩티드임을 확인하였다. 이 때, P 물질은 각막에서 먼저 증가한 후, 말초혈액에서 잇따라 증가하는데, 이것은 P 물질이 염증성 세포나 대식세포의 전신적 침윤에 의해서가 아니라 각막에 상주하는 세포에 의해 분비됨을 보여주는 것이다. 혈액에서 P 물질 농도의 증가는 P 물질의 전신 확산으로 인한 것일 수 있다. 또한, 호중구에서의 P 물질 면역반응성의 결핍, 염증기(상처 후 5 일까지) 보다 빠른 P 물질의 유도와 종결, 및 상처 치유 후기(상처 후 7-10 일)에서 상피세포와 섬유아세포성 세포에서 약한 P 물질 염색은 P 물질이 감각 뉴우런의 통각 자극에 의해 제공된다는 가설을 뒷받침한다.

이어서, 상처 미세환경에서 발현되는 다른 인자와 별도로, P 물질의 전신적 영향을 결정하기 위하여, P 물질을 상처가 없는 마우스로 정맥주사하고 CD29+ MSC의 말초혈액으로의 이동을 조사하였다. 그 결과, P 물질을 정맥주사한 경우 주사하지 않은 마우스에 비해 약 15배 많은 CD29+ MSC가 말초혈액으로 이동함을 확인하였다. 이 때, 상처가 없는 상태에서는 MSC가 모이는 상처 부위가 존재하지 않아, MSC가 혈액으로 이동한 것으로 생각된다.

또한, 골수의 골수강 내(endosteal) 표면으로부터의 MSC 이동에서 P 물질의 작용기작을 결정하기 위하여, 시험관 내 이동 어세이를 사용하고 MSC 이동, 기질 분해효소의 역학, 세포증식, 및 β-카테닌 배치에 대한 P 물질의 영향을 조사하였다. 그 결과, 시험관 내 3-D 콜라겐 젤에서 P 물질이 기질 분해효소를 유도하고 이들의 저해제를 저해하여 인간 MSC의 이동을 촉진하는 것을 밝혔다. 이는 P 물질의 MSC 이동에 있어서의 역할을 추가로 뒷받침하는 것이다. 또한, P 물질이 세포증식, β-카테닌의 핵으로의 이동을 촉진하여 MSC의 이동 후 MSC의 골수 재증식을 촉진함을 확인하였다.

나아가, 본 발명자들은 정맥주사된 MSC가 손상된 조직에 도착하여 각막 수복에 관여하는지 여부를 각막 투명도 및 시력 회복 점수에 기초하여 조사하였다. 그 결과, 알칼리 화상을 입힌 토끼의 귀 정맥으로 주입된 DiⅠ 표지된 MSC가 상처 층으로 성공적으로 보급되고 각막 투명도와 시력 회복을 개선시켜 각막 상처 치유를 용이하게 함을 확인하였다.

마지막으로, 본 발명자들은 P 물질의 정맥투여가 손상된 각막의 수복을 직접 촉진하는지 여부를 육안적 검사, H&E 염색 및 면역조직화학적 염색에 기초하여 조사하였다. 그 결과, 알칼리 화상을 입힌 후 P 물질을 정맥투여한 군에서 각막 상처 치유가 대조군에 비해 신속하게 진행됨을 확인하였다.

결론적으로, 각막 알칼리 화상 시 P 물질이 각막과 혈액에서 최초로 상승하고, MSC의 말초혈액으로의 이동을 촉진하며, 각막 상처 치유와 골수에서의 MSC 재증식에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, P 물질이 MSC의 골수로부터 상처 부위로의 이동 및 공급에 관여하는 상처 신호전달의 개시자로서 역할하는 것으로 결론지었다. 또한, MSC는 상처 부위로 이동하여 상처 치유에 관여하는 것으로 밝혀졌다.

상기한 바에 기초하여, MSC는 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로 사용될 수 있다. 또한, P 물질은 MSC의 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, P 물질의 유효용량은 0.1 내지 100 ㎍/㎏이고, MSC의 유효용량은 3×10⁴ 내지 3×10⁷ 세포/㎏, 특히 1×10⁵ 내지 1×10⁷ 세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 상처의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있는데, 정맥주사, 피하주사, 내피주사, 근육주사 등의 주사, 특히 정맥주사에 의 해 투여되는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 퉁상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 각막 알칼리 화상 후 말초혈액 내 c-kit 양성 줄기세포의 증가 및 이들의 상처 층으로의 공급 확인

체중 2-3 ㎏의 뉴질랜드 화이트 래빗을 Samtako BioKorea로부터 구입하였다. 모든 동물실험은 원자력의학원과 중앙대학교 윤리위원회의 승인을 받고 안과 및 시력 연구에서 동물 사용을 위한 ARVO 진술서에 따라 수행하였다. 알칼리 화상을 내기 위해, 토끼 눈을 1 N NaOH로 적신 6 ㎜ 조각의 와트만 여과지와 30 초간 접촉시켰다. 1, 3, 5, 7, 10 및 14 일에, 안구와 전혈을 분리하였다. 말초혈액의 도말표본과 각막의 동결 단편을 항-c-kit 항체(Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-1493, 1:100)로 염색하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

완전한 각막은 무혈관성 조직이므로, 이에 대한 심각한 손상은 각막 수복을 위해 혈관을 통한 염증세포와 다른 줄기세포의 공급을 필요로 할 수 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 토기 각막에 알칼리 화상을 내었을 때, 정상 대조군에 비해 말초혈액에서 c-kit 양성 세포의 수가 증가하였다. 이는 알칼리 화상 후 5 일째 각 막 상처 층에서도 탐지되었다. 이 결과로부터, 골수로부터 유래된 줄기세포가 각막 수복에 활발하게 참여함을 확인할 수 있었다.

실시예 2: P 물질의 각막 알칼리 화상에 의해 유도된 상처 신호전달 개시제로서의 역할 확인

체중 30-40 g의 Balb/c 마우스를 Jackson Lab(West Grove, PA)으로부터 구입하였다. 알칼리 화상을 내기 위해, 마우스 눈을 1 N NaOH로 적신 3 ㎜ 조각의 와트만 여과지와 10 초간 접촉시켰다. 1, 3, 5, 7, 10 및 14 일후, 안구와 전혈을 분리하였다.

조직 손상 자체는 염증과 같은 전신적 반응과 손상된 조직을 수복하기 위하여 골수로부터 줄기세포 이동을 유발하는 독특한 미세환경을 조성한다. RT-PCR을 사용하여 알칼리 화상을 낸 각막의 상처 미세환경에서 이들 기능을 보유하는 후보 인자를 분석하였다. 구체적으로는, 트리졸(Invitrogen)에 의해 알칼리 화상을 입은 안구로부터 RNA를 분리하였다. 총 1 g의 RNA를 역전사-중합효소 키트(Takara)를 이용하여 역전사(RT)한 후, 마우스 유전자-특이적 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다:

VEGF(예상 크기: 407), (센스) 5'GTACCTCCACCATGCCAAGT3', (안티센스) 5'AATGCTTTCTCCGCTCTGAA 3',

TNF-알파(예상 크기: 438), (센스) 5'GAACTGGCAGAAGAGGCACT3', (안티센스) 5'GTGGGTGAGGAGCACGTAGT3',

IL-1(예상 크기: 432), (센스) 5'GCTGCTTCCAAACCTTTGAC3', (안티센스) 5'AGGCCACAGGTATTTTGTCG3',

P 물질(예상 크기: 309), (센스) 5'TCGATGCCAACGATGATCTA3', (안티센스) 5'AGTTCTGCATTGCGCTTCTT3'

그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 각막 상처 후 안구에서 P 물질, IL-1, TNF-알파 및 VEGF가 유도되는 것으로 밝혀졌다.

추가로 이들 인자의 전신적 프로파일을 모니터링하고 골수로부터의 줄기세포 이동에서 이들의 역할을 평가하기 위하여, 말초혈액의 ELISA(R&D system)를 수행하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b로부터 알 수 있는 바와 같이, 무-상처 상태와 비교하여, 혈청 중 P 물질의 농도는 1 일에 약 3.2배, 3 일에 4.4배, 5 일에 1.3배 증가하였다. 그러나 전-염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1 유도는 알칼리 화상 후 5 일과 3 일에 각각 탐지되었고, VEGF는 더 늦은 7 일부터 유도되었다.

조직학적 조사를 위해 각막 상처 층을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색하고, P 물질 항체(Santa Cruz Biotechnology: Cat # sc-9758, 1:200)로 면역조직화학 염색하였다. 즉, 마우스 안구를 4% 파라포름알데히드로 48 시간 고정시켰다. 파라핀 포매된 표본을 4-㎛ 단편으로 세로로 자르고, 폴리-D 라이신-코팅된 슬라이드로 옮긴 후, H&E 염색을 수행하였다. P 물질의 면역조직화학적 염색을 위해, 내생 퍼옥시다제 활성을 0.5% H₂O₂로 5 분간 인큐베이션하여 차단하였다. 그 후 조직을 0.3% 트리톤 X-100으로 5 분간 투과화시키고, 일차 항체로 인큐베이션한 후, 잔여 과정을 제조자(ABC kit, Vector)의 설명서에 따라 수행하고, 세포를 패스트 레드로 반대염색하였다.

그 결과를 도 2c에 나타내었다. H&E 염색 결과, 염증성 호중구는 5 일간 유지되었고, 이동하는 상피세포가 5 일째에 관찰되었으며, 섬유아세포 침윤이 7 일째에 명확히 나타나고, 대부분의 대식세포는 14 일째에 사라졌다. 면역-반응성 P 물질은 1 일후 상처 층에서 가장 강력하게 탐지되었고 3 일까지 약해졌다. 5 일째에, P 물질은 섬유아세포성 세포와 이동하는 상피세포에서 매우 약하게 검출되었지만 염증성 세포에서는 검출되지 않아, 초기 염증세포는 P 물질을 분비하지 않음을 암시하였다. 따라서, 각막 상처 자체가 각막에 상주하는 세포에 의해 제공되는 P 물질이 풍부한 미세환경을 창출하고, 그 후 혈청에서 P 물질 증가를 유발하는 것으로 보인다.

골수로부터 유래된 MSC가 상처 부위로 공급되는지 여부를 조사하기 위하여, MSC 마커, 항-CD-29(Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-6622, 1:200), 항-c-kit(Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-1493, 1:100), 및 항-α-SM 액틴 항체(Progen, Cat # 61001(1:200))를 이용하여 면역조직화학 염색을 상기한 바와 같이 수행하였다. 그 결과를 도 2d에 나타내었다. 도 2d로부터 알 수 있는 바와 같이, CD-29, c-kit, 및 α-SM-액틴 발현 섬유아세포성 세포는 5 일까지의 초기 염증기에서는 검출되지 않았다. 이들은 섬유증식기에 해당하는 7 일부터 10 일에 상처 층에서 검출되었고, 재형성기에 해당하는 14 일 이후 대부분 사라졌다. 이 결과는 상처 치유 초기에 섬유아세포성 세포가 없다가 7 일에 섬유아세포성 세포가 처음 출현하는 것과도 일치한다. 단지 소수의 섬유아세포성 세포가 정상적인 각막 기질에 존재하고(도 2c), 섬유아세포성 세포는 7 일전 염증기에는 존재하지 않으므로, 7 일 상처 층에 있는 CD-29, α-SM-액틴, 및 c-kit 양성 세포는 혈액으로부터 유입된 것으로 판단되었다.

실시예 3: P 물질의 정맥주사에 의한 MSC의 골수로부터 말초혈액으로 이동 확인

줄기세포의 혈류로의 이동을 P 물질이 담당하는지, 상처 미세환경 중 다른 미확인 인자가 관여하는지를 결정하기 위하여, P 물질을 조사하였다.

상처 미세환경에서 다른 인자들의 영향을 구별하기 위하여, P 물질(Calbiochem)을 각막에 알칼리 화상을 유발하지 않은 Balb-c 마우스의 꼬리정맥에 정맥주사하고(0.1 nmole/g 체중), 24 시간후 전혈을 채취하였다. 퍼콜 구배 원심분리에 의해 적혈구를 제거한 후, 림프구를 제거하기 위하여 부착된 세포를 2 일간 배양하고, MSC를 부착된 대식세포로부터 구별하기 위하여 대식세포에서는 발현되지 않는 항-CD-29(β1 인테그린) 항체로 면역염색하였다.

그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 1 일내에, P 물질의 정맥주사는 비주사된 마우스에 비해 CD-29 양성 MSC의 말초혈액으로의 이동을 약 15배 촉진하였다(도 3b). 이로부터, P 물질이 상처 치유과정의 초기에 발현되어 MSC를 골수로부터 전신 혈로 이동시켜, MSC를 각막 상처 부위로 공급하고 각막 수복을 용이하게 하는 역할을 담당함을 알 수 있었다.

실시예 4: P 물질에 의한 MMP 활성 증가 확인

골수의 골수강 내 표면에 강하게 부착되어 있는 MSC의 이동에서 P 물질의 작용기작을 결정하기 위하여, 먼저 P 물질이 3-D 콜라겐 젤의 상부에서 배양된 인간 MSC의 이동을 촉진하는지를 조사하였다. 즉, 12 ㎜ 밀리셀 멤브레인(Millipore: 12-㎛ 구멍 크기) 내에 타입 Ⅰ 콜라겐 젤 매트릭스를 제조자(Nitta gelatin, 일본)의 설명서에 따라 제조하고, 타입 Ⅳ 콜라겐(Nitta)으로 밤새 코팅하였다. MSC(Cambrex Bio Science)를 콜라겐 젤의 상부에 플레이팅하고, 바깥 챔버를 P 물질-함유 MSCGM(Cambrex Bio Science)으로 채웠다. 콜라젠 젤의 제거(clearance)를 상 대비 현미경(Olympus)을 이용하여 모니터링하였다. 72 시간 후에, 밀리셀 삽입물과 바깥 접시를 고정한 후 헤마톡실린으로 염색하고, 배양 상등액을 젤라틴 단백분해효소검색(zymography)를 위해 저장하였다. 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 하부 접시에 적용된 P 물질은 용량 의존적으로 콜라겐 젤의 분해와 MSC 이동을 촉진하였다.

배양 배지를 젤라틴 단백분해효소검색(gelatin zymography)하였다. 구체적으로, 배양 상등액에 머캅토에탄올이 포함되지 않은 표본 완충용액을 첨가하여 0.1% 젤라틴(Becton Dickinson)이 포함된 8% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. SDS를 제거하기 위하여, 젤을 2.5% 트리톤 X-100으로 재생하고, 전개 완충액(50 mM 트리 스-HCl, pH 7.2 100 mM NaCl, 20 mM CaCl₂)으로 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하여, 젤을 쿠마시 블루로 염색하였다. 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 나타난 바와 같이, MSC 이동 중 MMP-9와 MMP-2 활성이 강력하게 유도되었다.

MMP(matrix metalloproteinase)의 생합성 및 그 저해제에 대한 P 물질의 영향을 ³⁵S-메티오닌으로 표지된 MSC의 배양 배지와 세포 용균물(lysates)의 면역침전에 의해 조사하였다. 즉, MSC를 P 물질로 처리하고 50 μCi/㎖ ³⁵S-메티오닌(Amersham)으로 16 시간 동안 표지하였다. 세포 용균물을 용균 완충액(1% NP40, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF)으로 제조하였다. 분비된 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, 및 TIMP-2의 면역침전을 위해, 배양 상등액을 일정하게 회전시키면서 2 시간 동안 그들의 특이적인 항체(항-MMP-1(Chemicon; Cat # MAB3307, 1:100), 항-MMP-2(Chemicon; Cat # MAB13405, 1:200), 항-MMP-9(Calbiochem; Cat # 444236, 1:100), 항-TIMP-1(Calbiochem; Cat # IM32L, 1:250) 및 항-TIMP-2(Calbiochem; Cat # IM11L, 1:250))로 인큐베이션하고, 항체를 단백질-G 세파로스-4B(Biorad)에 의해 수집하였다. 펠렛을 면역침전 완충액(150 mM NaOH, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.2% SDS 및 0.5% Na데옥시콜레이트)으로 3회, 고염 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl)으로 1회, 저염 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 7.4)으로 1회 세척하였다. SDS-PAGE 후, 젤을 2 M 살리실산나트륨에 담그고 건조한 후 X-선 필름에 2 주간 노출시켰다. MMP-9의 면역침전을 위해, 세포 용균물을 MMP-9 항체로 인큐베이션하고, 남아있는 과정은 상기한 바와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 4c에 나타내었다. MMP-1, MMP-2 및 MMP-9의 생합성이 P 물질에 의해 용량 의존적으로 촉진되었다. 반면, 그들의 저해제인 TIMP-1 및 TIMP-2의 생합성은 P 물질에 의해 억제되었다.

결론적으로, P 물질은 3-D 콜라겐 젤에서 인간 MSC의 이동, 콜라겐 분해효소의 유도, 및 이들 저해제의 억제를 촉진하였다.

실시예 5: P 물질에 의한 MSC 재증식 촉진 확인

P 물질이 단지 골수로부터 MSC를 이동시키는 능력만을 갖는다면, 이동 후 골수 기질에서 MSC 풀이 비게 될 것이다. P 물질의 영향을 세포 증식 및 자가 재생 능력 측면에서 다시 조사하였다.

P 물질 처리 후 3 일째 트립판 블루 배제된 생존 세포를 계수하고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다. P 물질은 대조군에 비해 생존세포 수를 각각 1 nM에서 1.7배, 10 nM에서 2.1배, 100 nM에서 2.2배 증가시켰다.

P 물질이 인간 MSC의 자가 재생 능력에 영향을 미치는지를 결정하기 위하여, wnt 신호전달 경로의 하류 작용제인 β-카테닌을 면역형광 염색에 의해 조사하였다. 즉, MSC(Cambrex Bio Science)를 1×10⁴/웰의 밀도로 접종하여 MSCGM(Cambrex Bio Science)으로 배양하였다. 세포가 모두 부착된 후, P 물질을 농도별로 처리하여 16 시간 및 48 시간동안 37 ℃에서 배양하였다. 세포가 접종된 커버슬립을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.3% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 인산완충용액 에 희석시킨 20% 정상 염소 혈청으로 1 시간동안 비특이적 항원을 차단한 후, 커버슬립을 β-카테닌에 대한 항체(BD Biosciences; Cat # 610153, 1:100)와 FITC-컨쥬게이트된 이차 항체(Vector)로 90 분간 인큐베이션하였다. 세포를 DAPI로 반대염색하고, 공촛점 현미경(Leica)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 5b에 나타내었다. P 물질 처리 16 시간후, β-카테닌이 주로 인간 MSC의 세포질에서 관찰되었지만 100 nM 처리 시 소수의 MSC에서 β-카테닌의 핵 이동이 나타났다. 그러나, P 물질 처리 48 시간 후, β-카테닌의 핵 이동이 더 우세해졌고, 특히 100 nM P 물질에서는 모든 MSC가 β-카테닌의 핵 이동을 나타내었다.

Tcf/β-카테닌의 하류 유전자인 피브로넥틴과 VEGF의 ELISA와 웨스턴 블랏 분석을 수행하고, 그 결과를 도 5c 및 5d에 각각 나타내었다. 도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이, P 물질이 VEGF와 피브로넥틴을 유도하였다. 이로부터 P 물질이 잘 알려진 표준 wnt 신호전달 경로를 통해 세포 증식 또는 자가 재생을 촉진하여 MSC의 재증식을 담당함을 알 수 있었다.

결론적으로, P 물질은 세포 증식, β-카테닌의 핵 이동, 및 그의 하류 유전자 VEGF 및 피브로넥틴의 유도를 자극하며, 이들은 모두 P 물질이 골수에서 MSC 재증식에서 또 다른 역할을 함을 암시한다.

실시예 6: 정맥주사된 MSC의 각막 상처 층으로의 공급 및 시력 회복 개선 확인

도 3에 나타낸 바와 같이, P 물질의 정맥주사는 마우스 CD29+ MSC가 말초혈 액으로 이동하는 것을 자극하는데 충분하였다. 이동된 MSC가 실제로 각막 상처 치유에 참여하는지 여부를 조사하기 위하여, DiⅠ 표지된 MSC를 각막 알칼리 화상 24 시간 후 비-조사된(non-irradiated) 토끼의 귀 정맥으로 주입(transfuse)하여 MSC의 골수로의 호밍(homing)을 최소화하고 상처 부위로의 공급을 최대화하였다.

MSC를 골수 세척 및 흡인에 의해 1 월령의 알로제닉 토끼의 경골로부터 분리하고, MSCGM으로 3 계대까지 배양하였다. 부착된 세포를 c-kit, STRO-1, 및 α-평활근(SM) 액틴 발현에 의해 MSC로 확인하고, 세포 주입(transfusion) 실험에 사용하였다. 주입된 MSC를 추적하기 위하여, 트립신처리된 세포를 DiⅠ 용액(Celltracker™ CM-DiⅠ(Cat# C-7000); Molecular Probes)으로 37 ℃에서 5 분간 및 4 ℃에서 15 분간 인큐베이션하였다. PBS로 3 회 세척한 후, MSC(1×10⁶ 세포/㎖)를 신선한 무혈청 배지에 재현탁하고 각막 알칼리 화상 1 일후 10 마리 토끼의 귀로 주사하였다. 알칼리 화상 2 주 및 4 주후 무-주입 및 DiⅠ 표지된 MSC 주입 그룹의 안구를 슬릿-램프로 조사하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었으며, MSC 주입 그룹이 무-주입 그룹 보다 각막 시력 회복이 우수한 것으로 확인되었다.

상피 치유시간을 사진-슬릿 현미경 조사와 사진-기록으로 상피 결함의 폐쇄에 의해 결정하였다. 각막 불투명도를 하기 기준에 따라 등급화하였다: 등급 0; 불투명하지 않음, 등급 1; 홍채 구조가 약간 불투명하게 보임, 등급 2; 미세한 홍채 구조가 보이지 않음, 등급 3; 홍채의 존재만이 갈색으로 나타남, 및 등급 4: 완전 불투명함.

그 결과를 표 1에 나타내었다.

	상피 치유시간	각막 불투명도	각막 혈관신생
대조군(n=10)	10.25±2.36 일	3.43±0.79	3.57±0.79
MSC IV(n=10)	5.50±0.58 일^*	1.50±0.65^*	1.71±0.75^*

*: p<0.05

표 1에 나타낸 바와 같이, MSC 주사된 토끼는 비주사된 그룹에 비해 2-배 단축된 상피 치유시간, 우수한 각막 불투명도, 및 감소된 각막 혈관신생을 나타내었다.

주입된 DiⅠ 표지 MSC가 상처 층으로 배치되는지 여부를 확인하기 위하여, FLAT 마운트(mount)를 수행하였다. 각막에서 DiⅠ 표지된 MSC를 확인하기 위하여 1 일, 2 주 및 3 개월에 FLAT 마운트를 형광 입체현미경(Leica)으로 조사하였다. 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6b로부터 알 수 있듯이, DiⅠ 표지된 MSC가 상피 수준과 기질 수준에서 검출되었다. 또한 IV 주입 1 일후에도 DiⅠ 표지된 MSC가 상처 층에서 검출되었으며, 이들의 존재는 비록 DiⅠ 강도가 낮기는 하지만 주입 3 개월 후까지 검출되었다.

실시예 7: 정맥주사된 P 물질에 의한 각막 상처 치유 촉진 확인

도 3에 나타낸 바와 같이, P 물질의 정맥주사는 마우스 CD29+ MSC가 말초혈액으로 이동하는 것을 자극하는데 충분하였고, 도 6에 나타낸 바와 같이, MSC의 정맥주입은 손상된 각막의 시력 회복을 개선하였다. 이에, P 물질만의 정맥투여가 각 막 손상 치유를 실제로 촉진하는지 여부를 조사하였다. 뉴질랜드 화이트 토끼에 알칼리 화상을 입힌 후, P 물질을 6.5 ㎍/㎏ 용량으로 화상 후 즉시와 2 일후 2회 정맥주사하였다. 정맥주사 7 일후 각막 손상 회복 정도를 디지털 카메라로 촬영하여 손상 회복 정도를 육안으로 평가하였다. 그 결과를 도 7a에 나타내었다. 도 7a에 나타난 바와 같이, 육안 관찰에 의해서도 P 물질을 투여한 토끼에서는 상처 치유가 신속하게 진행됨을 확인할 수 있었다. 반면, P 물질을 투여하지 않은 토끼(대조군)에서는 알칼리 손상의 흔적이 허옇게 보였고 손상 부위의 혈관도 선명하게 관찰되어, P 물질 투여군 보다 상처 치유가 지연되고 있는 것으로 나타났다.

상처 치유 정도를 조직학적 수준에서 관찰하기 위하여, 안구를 적출하여 고정한 후 H&E 염색과 CD-29 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 시행하였다. H&E 염색 결과를 도 7b에 나타내었다. 도 7b에 나타난 바와 같이, P 물질을 투여한 토끼의 경우 각막 표피층이 4∼5 층으로 재생되어 정상 각막 조직과 유사한 소견을 보였고, 기질에는 염증세포가 거의 관찰되지 않았으며, 스핀들 형태의 케라토사이트가 콜라겐 내에 끼어있는 형태로 관찰되었다. 또한, 표피 바로 아래층에서만 매크로파지가 아직 관찰되었고, 기질의 대부분은 정상 기질과 유사한 소견을 보였다. 이에 비해, P 물질을 투여하지 않은 대조군은 1∼2 층의 각막 표피층만이 관찰되었고, 염증성 세포가 아직 기질 내부에서 관찰되었다. 또한, 이동성이 큰 세포들이 표피층과 가까운 기질층에서 관찰되어 치유 정도가 P 물질 투여군 보다 지연됨을 확인하였다. CD-29 면역조직화학 염색 결과를 도 7c에 나타내었다. 도 7c에 나타난 바와 같이, P 물질을 투여하지 않은 대조군에서는 아직 분화되지 않은 중배엽 줄기세포(CD-29를 발현하는 큰 세포군)들이 관찰되었으나, P 물질 투여군에서는 대부분이 CD-29 발현 세포가 스핀들 형태의 작은 세포로 콜라겐 섬유다발 속에 갇혀 있는 형태로 정상 각막 기질과 유사한 양상을 나타내었다. 따라서, P 물질 투여군에서 상처 회복이 신속히 진행되고 있음을 조직학적 수준에서도 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 P 물질만의 투여에 의해서도 각막 손상 회복을 촉진하는 효과를 발휘할 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명에 따르면, 각막 손상 모델에서 P 물질은 각막 손상 시 초기에 분비되어 혈액을 통해 골수로 이동, 골수에 위치한 중배엽 줄기세포를 자극하여 상처 부위로 이동하고 골수에서 재증식하도록 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, P 물질은 중배엽 줄기세포의 유리 또는 증식, 또는 유리 또는 증식 촉진제, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로 사용될 수 있다.

또한, 중배엽 줄기세포는 상처 부위로 이동하여 상처 치유에 직접 관여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 중배엽 줄기세포는 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제로 사용될 수 있다.

Claims

유효성분으로서 P 물질(Substance P) 처리에 의해 골수로부터 유리되거나 증식된 중배엽 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells)를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제.
유효성분으로서 P 물질 처리에 의해 골수로부터 유리되거나 증식된 중배엽 줄기세포를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 세포 치료제.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, P 물질을 추가로 함유하는 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 각막 또는 피부 상처를 치유하거나 각막 또는 피부 세포를 치료하기 위한 제제.
유효성분으로서 P 물질을 함유하는, 중배엽 줄기세포 유리 또는 유리 촉진제.
유효성분으로서 P 물질을 함유하는, 중배엽 줄기세포 증식 또는 증식 촉진제.
유효성분으로서 제6항 또는 제7항에 따른 제제를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제.
유효성분으로서 제6항 또는 제7항에 따른 제제를 함유하는, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 세포 치료제.
P 물질을 처리하여 골수로부터 중배엽 줄기세포를 유리시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 분리방법.
P 물질의 존재 하에 중배엽 줄기세포를 증식시키는 단계를 포함하는, 중배엽 줄기세포의 확장방법.