CN101157929B

CN101157929B - 番红霉素的生物合成基因簇

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Publication number: CN101157929B
Application number: CN200710037087XA
Authority: CN
Inventors: 唐功利; 刘�文; 李磊
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2007-02-02
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2027-02-02
Also published as: CN101157929A

Abstract

本发明是四氢异喹啉生物碱家族中一种链霉菌产生的具有抗肿瘤活性的抗生素——番红霉素的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含30个基因：3个非核糖体聚肽合成酶基因、4个前体分子3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸合成基因、2个肽骨架环合酶基因、7个番红霉素的修饰基因、5个与S-腺苷化甲硫氨酸合成相关基因、3个调节基因、2个抗性基因和4个功能不确定的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断番红霉素的合成，可使其产量发生改变；还可得到番红霉素的结构类似物。该基因簇可用于四氢异喹啉生物碱家族化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。

Description

番红霉素的生物合成基因簇

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素番红霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

四氢异喹啉生物碱是一类结构复杂而独特的天然产物家族，以番红霉素(Saframycins，SFM)为代表的双四氢异喹啉生物碱是其中的一个分支，它们具有良好的抗菌和抗肿瘤活性[Chem.Rev.(2002)102，1669-1730]。SFM(如图1所示)首次分离自链霉菌Streptomyces lavendulae314[J.Antibiot.(1977)30，1015-1018]，其中番红霉素A(SFM-A)是活性较高的组份，其抗肿瘤活性的ID₅₀约为5nM[Gann.(1980)71，790-796]。SFM-A能够以0.2μg/mL的浓度抑制RNA合成，以2.0μg/mL的浓度抑制DNA合成。它主要是通过DNA的烷基化发挥抗肿瘤生物活性，其C-21位的氰基有助于形成亲电的亚胺离子从而在DNA的小沟对鸟嘌呤G的N-2位进行烷基化修饰，而且对烷基化修饰的位点具有中等程度的序列特异性，如5′-GGG，5′-GGC[Chem.Rev.(2002)102，1669-1730]。2004年，Myers从牛脑组织裂解液中筛选到了与SFM-A-DNA复合物相结合的靶蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2004(101)，5862-5866]。该蛋白一般以四聚体的形式存在，为甘油醛磷酸脱氢酶，参与葡萄糖的代谢；以单聚体形式存在时，是细胞周期中S期转录复合物的重要组成部分，因此推测GAPDH应是跟细胞周期有关的蛋白。究竟SFM-A抗肿瘤的作用机制主要是由烷基化修饰引起DNA的断裂，还是通过与效应蛋白相结合终止细胞周期，使DNA不能合成，目前还没有定论，但SFM-A具有抗肿瘤活性，可以对DNA进行烷基化修饰却是不争的事实。

SFM-A具有独特的化学结构(如图1所示)，双四氢异喹啉骨架结构是该家族化合物的典型特征。1979年，Arai等人首次通过X-ray晶体衍射分析确定了SFM-C的结构[Tetrahedron Lett.(1979)20，2355-2358]，随后通过与SFM-C的¹³CNMR数据比较确定了SFM-B的结构。SFM-A，C-21位存在一个氰基，其结构通过与SFM-C的高场¹H NMR等波谱数据对比分析得以确定。其他各成员的结构也陆续通过NMR，X-ray等方法被确定。之后，随着该家族其他化合物的发现，这一独特的化学结构吸引了许多有机化学家从事其化学合成研究[Org.Lett.(1991)1，75-77；Org.Lett.(2000)2，3019-3022；J.Am.Chem.Soc.(1999)121，10828-10829；J.Am.Chem.Soc.(2001)123，5114-5115；J.Am.Chem.Soc.(2002)124，12969-12971]。前体标记实验表明：SFM骨架来源于2个酪氨酸，边链来源于1个丙氨酸和1个甘氨酸，甲基来源于甲硫氨酸[J.Biol.Chem.(1985)260，344-348]。

目前，一个来源于加勒比海的一种海鞘(Ecteinascidia turbinate)中的四氢异喹啉天然产物Et743(见图1)已进入Pharma Mar公司的III期临床研究，非常有希望成为一种治疗乳腺癌，恶性黑素瘤，肺癌及卵巢癌的新药。该化合物体外活性LC₅₀<1pM，ID₅₀0.2-0.6nM，活性比抗肿瘤药物紫杉醇高约50倍[Clin.Can.Res.(2002)8，75-85]。作为一种具有良好临床应用前景的抗肿瘤药物，Et743来源十分有限。据统计，从1吨海鞘中只能获得1g Et743，不能满足临床科学研究的需要。有人用培养海鞘细胞的方法获得Et743，但是其海洋来源使得研究非常困难。目前临床研究所用Et743主要来源于荧光假单孢菌Pseudomonas fluorescensA2-2发酵产生的番红菌素B(safracin，SAC-B)的氰化衍生物经21步化学半合成得到[Chem.Rev.(2002)102，1669-1730；Org.Lett.(2000)2，2545-2548]。

SFM与Et743骨架结构相似，而且其宿主菌是链霉菌，可以通过发酵的方法来获得代谢产物。我们以微生物来源的番红霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，阐明生物合成机理，通过代谢工程改造生产Et743或产生SFM类似物进而结合化学半合成生成Et743或类似物，为新活性“非天然”天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容：

本发明涉及四氢异喹啉生物碱家族中一种链霉菌Streptomyces lavendulae314产生的具有抗肿瘤活性的抗生素—番红霉素(Saframycins，SFM)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。本发明中整个基因簇共包含30个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中3个(sfmA，sfmB，sfmC)用于编码非核糖体聚肽合成酶(NRPS)，共包含3个模块，12个功能域，负责催化SFM聚肽链的生物合成；4个基因(sfmO5，sfmM2，sfmM3，sfmD)编码的蛋白负责催化前体分子3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸的生物合成；2个基因(sfmCy1，sfmCy2)编码的蛋白负责催化肽骨架的环合；5个基因(sfmS1，sfmS2，sfmS3，sfmS4，sfmS5)编码的蛋白负责S-腺苷化甲硫氨酸(SAM)的合成，为甲基化酶提供辅因子；7个基因(sfmM1，sfmO1，sfmO2，sfmO3，sfmK，sfmO4，sfmO6)编码的甲基化酶和氧化还原酶催化分子骨架的进一步修饰；还包括3个调节基因(sfmR1，sfmR2，sfmR3)、2个抗性基因(sfmG，sfmH)及4个功能不确定的基因(sfmE，sfmF，sfmI，sfmJ)。

本发明还提供了一个编码TetR家族转录调节因子的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为sfmR1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第786-1373碱基处。

本发明还提供了一个编码氧化还原酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为sfmO1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第1370-2284碱基处。

本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为sfmR2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第2487-2996碱基处。

本发明还提供了一个编码氧化还原环合酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为sfmCy1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第3166-4704碱基处。

本发明还提供了一个编码移位酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为sfmG，其基因的核苷酸序列位于序列1中第4738-6177碱基处。

本发明还提供了一个编码紫外修复蛋白的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为sfmH，其基因的核苷酸序列位于序列1中第8748-6289碱基处。

本发明还提供了一个编码单氧化酶的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组成，命名为sfmO2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10384-8819碱基处。

本发明还提供了一个编码甲基化酶的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组成，命名为sfmM1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11059-10460碱基处。

本发明还提供了一个编码未知功能蛋白的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名为sfmI，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11694-11212碱基处。

本发明还提供了一个编码吡哆胺-5’-磷酸氧化酶相关蛋白的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列组成，命名为sfmJ，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12188-11691碱基处。

本发明还提供了一个编码细胞色素P-450羟化酶的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为sfmO3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12372-13559碱基处。

本发明还提供了一个编码铁氧化还原蛋白的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为sfmK，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13613-13798碱基处。

本发明还提供了一个编码氧化还原环合酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为sfmCy2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第15388-13874碱基处。

本发明还提供了一个编码细胞色素P-450羟化酶的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为sfmO4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16947-15520碱基处。

本发明还提供了一个编码包括AL，PCP，C，A，PCP非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为sfmA，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16971-22481碱基处。

本发明还提供了一个编码包括C，A，PCP非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为sfmB，其基因的核苷酸序列位于序列1中第22618-25866碱基处。

本发明还提供了一个编码包括C，A，PCP，RE非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为sfmC，其基因的核苷酸序列位于序列1中第25863-30320碱基处。

本发明还提供了一个编码5-甲基-O-甲基-酪氨酸-3-羟化酶的核苷酸序列，由序列19中的氨基酸序列组成，命名为sfmD，其基因的核苷酸序列位于序列1中第30317-31414碱基处。

本发明还提供了一个编码肽酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为sfmE，其基因的核苷酸序列位于序列1中第31411-33780碱基处。

本发明还提供了一个编码MbtH类似蛋白的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为sfmF，其基因的核苷酸序列位于序列1中第33777-33998碱基处。

本发明还提供了一个编码甲基化酶的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为sfmM2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第34031-35131碱基处。

本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列，由序列23中的氨基酸序列组成，命名为sfmR3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第35223-35759碱基处。

本发明还提供了一个编码预苯酸脱氢酶的核苷酸序列，由序列24中的氨基酸序列组成，命名为sfmO5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第37069-35900碱基处。

本发明还提供了一个编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的核苷酸序列，由序列25中的氨基酸序列组成，命名为sfmS1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第38550-37096碱基处。

本发明还提供了一个编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核苷酸序列，由序列26中的氨基酸序列组成，命名为sfmS2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第39521-38580碱基处。

本发明还提供了一个编码5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶的核苷酸序列，由序列27中的氨基酸序列组成，命名为sfmS3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第42940-39557碱基处。

本发明还提供了一个编码碳水化合物激酶的核苷酸序列，由序列28中的氨基酸序列组成，命名为sfmS4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第44013-43036碱基处。

本发明还提供了一个编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列，由序列29中的氨基酸序列组成，命名为sfmS5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第45220-44015碱基处。

本发明还提供了一个编码甲基化酶的核苷酸序列，由序列30中的氨基酸序列组成，命名为sfmM3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第46245-45241碱基处。

本发明还提供了一个编码FAD依赖的氧化酶的核苷酸序列，由序列31中的氨基酸序列组成，命名为sfmO6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第46553-47683碱基处。

序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA质粒的途径。

本发明还提供了产生SFM生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与SFM生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有Streptomyceslavendulae314基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括***、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸及SFM聚肽骨架，进一步催化合成抗生素SFM。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过***、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断SFM生物合成的一个或几个步骤而得到新的SFM结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高SFM或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

包含本发明所提供的非核糖体聚肽合成酶可以通过缺失、***或失活来自于相同或不同的非核糖体聚肽合成酶***的一个或多个非核糖体聚肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体聚肽合成酶库或非核糖体聚肽合成酶衍生库或组合库。

本发明所提供的催化合成腺苷化甲硫氨酸(SAM)的合成基因可用于合成腺苷化甲硫氨酸。

本发明所提供的成3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸生物合成基因可用于合成SFM家族独特的成3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸及其他酪氨酸类似物。

本发明所提供的SFM骨架的后修饰基因提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的氧化还原反应也可有其他应用。

总之，本发明所提供的包含SFM生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解SFM家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明：

图1：番红霉素(Saframycin，SFM)、Et743及番红菌素(Safracin，SAC)的化学结构

图2：SFM生物合成基因NRPS片段的克隆

(A)NRPS催化的肽链延伸；(B)推测的SFM肽链的生物合成；(C)PCR得到NRPS基因片段的电泳：泳道1为分子量标准，泳道2，3为PCR产物；(D)NRPS基因片段中断的突变菌株发酵产物的HPLC分析：I是标准品，II野生型发酵产物，III是与SFM生物合成无关的NRPS基因中断的突变体发酵产物，IV是与SFM生物合成相关的NRPS基因中断的突变体发酵产物，V上述IV的发酵产物与标准品的共进样。

图3：SFM生物合成基因RE片断的克隆

(A)NRPS中肽链终止的方式；(B)推测的SFM肽链的终止；(C)PCR得到RE基因片断的电泳：泳道1为分子量标准，泳道2，3为PCR产物。

图4：SFM生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶谱

(A)3个交叠的粘粒代表了抗生链霉菌基因组70kb的DNA区域，B代表限制性内切酶BamHI，实体表示已被DNA测序的部分，Probe-2和Probe-3代表标记的探针部分；(B)SFM生物合成基因簇的基因组成。

图5：SFM生物合成基因簇中包含的S-腺苷化甲硫氨酸(SAM)的生物合成途径

图6：提出的3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸(A)和SFM-A(B)的生物合成途径

图7：基因置换与基因互补突变菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析

(A)野生型发酵产物；(B)NRPS基因置换的突变体(

Figure S07137087X20070227D00009092713QIETU

)发酵产物；

(C)基因置换的突变体经SfmB基因互补的突变体发酵产物；(D)

Figure S07137087X20070227D00009092739QIETU

基因置换的突变体经SfmA—F基因互补的突变体发酵产物；(E)SFM-A标准品。

图8：四氢异喹啉家族化合物生物合成中非核糖体聚肽合成酶NRPS催化的肽骨架的合成

(A)SFM-A的生物合成途径；(B)SFM-Mx1生物合成途径；(C)SAC-B的生物合成途径。

图9：SFM-A生物合成途径中三个NRPS的底物识别功能分析

(A)重组蛋白的分离纯化：泳道1，SfmA(C-A-PCP)，泳道2，SfmB，泳道3，SfmC；(B)三个NRPS重组蛋白的底物测定。

图10：在SAC的产生菌荧光假单孢菌中异源表达SFM-A的生物合成基因

(A)SAC和SFM-A生物合成基因簇的对比；(B)突变菌株发酵产物的HPLC分析：I，野生型假单孢菌，II，野生型假单孢菌发酵后经KCN处理，III，含有sfmO4异源表达质粒的重组假单孢菌，IV，含有sfmO4异源表达质粒的重组假单孢菌发酵后经KCN处理。

图11：SFM-A的生物合成基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白分离纯化泳道1，蛋白分子量标准，泳道2，纯化后的蛋白。(A)SfmO1，(B)SfmO3，(C)SfmO4，(D)SfmM2，(E)SfmM3，(F)SfmD。

符号说明：

图1

Saframycin：番红霉素；aminated-Saframycin：氨基化番红霉素；Ecteinascidin：海鞘素；Safracin：番红菌素；cyano-Safracin：氰基化番红菌素。

图2

Module：模块；C：缩合酶；A：腺苷化酶；PCP：肽酰载体蛋白；Loading：起始模块；NRPS：非核糖体肽合成酶；Wavelength：波长。

图3

Acyl-S-T：酰基硫酯载体蛋白；TE：硫酯酶；C：缩合酶；red或RE：还原酶。

图4

Probe：探针；Skeleton：骨架；Tailoring：后修饰；Regualtion：调节；Resistance：抗性；SAM Recycle：酰苷化甲硫氨酸再生循环；Unassigned：功能不确定；Beyondboundary：边界之外。

图5

S-adenosylhomocysteine：腺苷化高半胱氨酸；S-adenosylmethionine：腺苷化甲硫氨酸；L-homocysteine：高半胱氨酸；L-methionine：甲硫氨酸；5-methyl-THF：N⁵-甲基四氢叶酸；THF：四氢叶酸；5，10-methylene-THF：N⁵，N¹⁰-亚甲基四氢叶酸；Adenosine：腺嘌呤核苷；AMP：腺嘌呤核苷单磷酸；ATP：腺嘌呤核苷三磷酸；PPi：焦磷酸；Pi：磷酸根；MT：甲基化酶。

图6

AL：酰基辅酶A连接酶；PCP：肽酰载体蛋白；C：缩合酶；A：腺苷化酶；SAC-B：番红菌素B；SFM-A：番红霉素A。

图7

WT：野生型；mLLS524B：NRPS基因SfmB置换的突变体；mLLS647：ΔSfmB基因置换的突变体经SfmB基因互补的突变体；mLLS925：ΔSfmB基因置换的突变体经SfmA—F基因互补的突变体；SFM-A：番红霉素A。

图8

AL：酰基辅酶A连接酶；PCP：肽酰载体蛋白；C：缩合酶；A：腺苷化酶；RE：还原酶；SFM-A：番红霉素A；SFM-Mx1：番红霉素Mx1；SAC-B：番红菌素B。

图9

Relative activity：相对活性；Ala：丙氨酸；D-Ala：D型丙氨酸；Ala-Gly：丙—甘二肽；Pyruvate：丙酮酸；Cys：半胱氨酸；Tyr：酪氨酸；3h5mOmTyr：3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸；5mOmTyr：5-甲基-O-甲基酪氨酸；OmTyr：O-甲基酪氨酸；3hTyr：3-羟基-酪氨酸；Phe：苯丙氨酸。

图10

Skeleton：骨架；Tailoring：后修饰；Regualtion：调节；Resistance：抗性；SAMRecycle：酰苷化甲硫氨酸再生循环；Unassigned：功能不确定；Beyond boundary：边界之外；Wavelength：波长；SAC-B：番红菌素B；cyano SAC-B：氰基化番红菌素B；aminated SFM-S：氨基化番红霉素S；SFM-Y3：番红霉素Y3。

具体实施方式：

以下结合图1-图11对本发明进一步详细说明。

1.克隆SFM-A的生物合成基因片断：

SFM-A的前体标记实验证明，二聚四氢异喹啉环骨架来自两个酪氨酸，边链来自丙氨酸，甘氨酸，O-，C-，N-甲基来自甲硫氨酸[J.Biol.Chem.(1985)260，344-348]。来源于粘细菌Myxococcus xanthus的类似物SFM-Mx1与SFM-A结构极其类似，Pospiech等通过转座子***失活的方法克隆到SFM-Mx1的18kb的部分生物合成基因，表明其中含有两个非核糖体聚肽合成酶(NRPS)和一个O-甲基转移酶，证明SFM-Mx1的生物合成是采用NRPS机理[Microbiol.(1995)141，1793-1803；Microbiol.(1996)142，741-746]。最近来源于荧光假单孢菌Pseudomonasfluorescens A2-2的化合物番红菌素B(SAC-B)生物合成基因簇的克隆和分析表明SAC-B的生物合成也是采用NRPS机理[Mol.Microbiol.(2005)56，144-154]。这些研究为克隆SFM的生物合成基因提供了极为重要的信息。我们推测SFM的生物合成可能是采用NRPS机理，Ala-Gly-Tyr-Tyr依次缩合(图2A，B)，结合还原成环，氧化还原，脱水，N-，O-，C-甲基化，加氰，脱氨等后修饰完成。因此克隆策略就是从克隆NRPS基因入手。

典型NRPS是以模块形式存在的多功能酶，每一模块含有一套独特的，非重复使用的催化功能域，即催化功能域与产物合成顺序是一一对应的(图2A)。我们基于已有的一些化合物的生物合成序列A功能域设计了NRPS通用引物，希望得到相关的NRPS基因片断。采用兼并性引物(5’-TAC ACG TCC GGC ACSACS GGC AAR CCN AAR GG-3’和5’-AW CGA GKS GCC GCC SRR GSMGAA GAA-3’)PCR克隆编码NRPS基因部分序列的方法得到约1.2kb的PCR产物(图2C)，克隆入pGEM-T Easy载体，经限制性内切酶分组，DNA顺序分析表明与已知的NRPS基因有很高的同源性。进一步经基因中断发现：有的基因中断突变菌株仍然产生SFM-A，说明它们与SFM的生物合成无关；而另一组基因失活的突变菌株完全丧失了产生SFM-A的能力(图2，D)，证明已经克隆了与SFM-A生物合成相关的NRPS基因片段。

绝大多数非核糖体聚肽类的合成完毕后都是由硫酯酶(TE)将聚肽链从PCP上解离并催化缩合，但有些天然产物的生物合成中没有NRPS常用的TE而是存在一个末端的还原酶，称之为RE结构域[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)98，11136-11141；Gene(2004)325，35-42]。这类化合物一般不是形成大环的酰胺或内酯，而是解离成醛，进而形成末端的醇，胺，酰胺或亚胺。SFM-A与SFM-Mx1结构非常类似，所以我们猜测SFM-A也采用还原酶RE来解离连接在PCP上的四肽，首先RE在NADPH作用下将四肽解离下来形成醛，再分子内反应成环(图3A，B)。根据部分化合物的生物合成序列的PCP功能域和RE功能域的保守序列设计了RE引物，希望能克隆到相关基因。采用兼并性引物(5’-GAC AAC TTCTTC GAG CTG GGS GGS SAY TC-3’和5’-GCG GAC CAA CTT CTC CGCSRC CCAYTT RCT-3’)PCR克隆编码RE基因部分序列的方法得到约0.8kb的PCR产物(图3C)，克隆入pGEM-T Easy载体，经限制性内切酶分组，DNA顺序分析表明与已知的RE基因有很高的同源性。

2.SFM-A的生物合成基因簇的克隆，顺序分析及功能分析：

将上述NRPS基因片段和RE基因片段用地高辛标记为探针Probe-2和Probe-3从Streptomyces lavendulae314的基因组文库约6000个克隆中筛选，分离得到的粘粒涵盖了染色体约70kb的区域(图4A)。DNA顺序分析了50kb的染色体区域，GC含量71.8％。生物信息学分析包含了32个开放读码框(图4B)。其中含有三个NRPS模块，说明SFM-A的生物合成采取NRPS机理。同时序列分析还显示该生物合成基因簇包含大量新奇的NRPS后修饰基因及2个抗性基因和3个调控基因(图4B)，这为我们研究非核糖体聚肽类化合物的后修饰提供了很好的一个平台。详细的分析结果列于表1。

表1SFM-A的生物合成基因簇中各基因及编码蛋白的功能分析

3.SFM-A的生物合成基因簇边界的确定：

根据基因编码蛋白的功能分析，SFM-A的生物合成基因簇被确定为从基因sfmR1到sfmO6(图4B)，涵盖染色体46.9kb的区域，包含30个开放读码框。整个SFM-A的生物合成基因簇共30个基因，其中3个(sfmA，sfmB，sfmC)用于编码非核糖体聚肽合成酶(NRPS)，共包含3个模块，负责催化SFM-A聚肽链的生物合成；5个基因(sfmS1，sfmS2，sfmS3，sfmS4，sfmS5)编码的蛋白负责S-腺苷化甲硫氨酸的生物合成，为甲基化提供辅因子；4个基因(sfmO5，sfmM2，sfmM3，sfmD)编码的蛋白负责催化酪氨酸衍生物3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸的生物合成；1个(sfmM1)用于编码甲基化酶，负责催化分子中的N甲基化；2个基因(sfmCy1，sfmCy2)编码的蛋白催化氧化还原反应，负责肽链骨架的氧化成环；6个基因(sfmO1，sfmO2，sfmO3，sfmK，sfmO4，sfmO6)编码的蛋白催化氧化还原反应，负责分子骨架合成后的修饰；还包括3个调节基因(sfmR1，sfmR2，sfmR3)和2个抗性基因(sfmG，sfmH)及4个功能不十分确定的基因(sfmE，sfmF，sfmI，sfmJ)。

4.S-腺苷化甲硫氨酸(SAM)的生物合成：

甲基化修饰是天然产物生物合成中经常发生的反应，绝大多数情况下是一种甲基化酶催化的，这类甲基化酶利用S-腺苷化甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，而SAM的生物合成在多数情况下来源于宿主的基础代谢。在番红霉素A的生物合成基因簇中包含5个基因(sfmS1，sfmS2，sfmS3，sfmS4，sfmS5)编码的蛋白形成完整的SAM合成循环(图5)：当甲基化发生时，SAM作为甲基供体失去甲基被转化为S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine)；这时sfmS1编码的S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶将其水解产生L-高半胱氨酸(homocysteine)和腺嘌呤核苷A；然后sfmS3编码的5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶利用5-甲基四氢叶酸(5-methyl-THF)作为甲基供体将高半胱氨酸转化为L-甲硫氨酸(methionine)，而sfmS2编码的亚甲基四氢叶酸还原酶则催化5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-methylene-THF)转化为5-甲基四氢叶酸；sfmS4编码的碳水化合物激酶则催化腺嘌呤核苷A转化为腺嘌呤核苷单磷酸AMP，进而完成A到ATP的再生循环；最后sfmS5编码的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化L-甲硫氨酸和ATP转化为SAM，从而完成SAM的再生循环。

5.3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸的生物合成：

3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸的生物合成如图6A所示：sfmO5编码的预苯酸脱氢酶催化基础代谢产物预苯酸转化为酪氨酸(该反应在基础代谢酪氨酸的合成中也有)，然后在酪氨酸sfmM2和sfmM3编码的甲基化酶催化下发生羟基甲基化和苯环5位C甲基化修饰，进一步在sfMD编码的酶作用下苯环3位羟基化，从而完成番红霉素中3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸单元的生物合成。

6.SFM-A骨架合成中NRPS的功能：

SFM-A生物合成基因簇中共有三个典型的NRPS基因：sfmA、sfmB和sfmC。为了进一步确证它们与SFM-A生物合成的相关性构建了NRPS基因SfmB基因置换的突变体mLLS524B(ΔSfmB)，经生物发酵、HPLC检测发现该NRPS基因失活的突变体不再产生SFM-A(图7B)，而将SfmB基因置于外源启动子ErmE下进行基因互补可以部分恢复SFM-A的产生(图7C)，将SfmA—F完整的操纵子置于外源启动子ErmE下进行基因互补可以将SFM-A的产生基本完全恢复至野生型水平(图7D)，进一步证实克隆到的生物合成基因簇确与SFM-A的生物合成相关。

进一步分析这三个NRPS基因编码蛋白的氨基酸序列，可以推测出了这三个NRPS模块的组织结构(图8A)。SfmA包括五个功能域(AL-PCP₀-C₁-A₁-PCP₁)，SfmB包含三个功能域(C₂-A₂-PCP₂)，SfmC包含四个功能域(C₃-A₃-PCP₃-RE)。序列分析表明，位于SfmAN-端的AL结构域与许多细菌来源的酰基辅酶A连接酶(Acyl-CoA ligase)具有高度的同源性，同时AL缺乏腺苷化结构域(A)所必需的一些核心氨基酸基序，因此SfmA的AL结构域可能不具备A结构域应有的识别和激活氨基酸底物的功能。推测SfmA的A1、SfmB的A2和SfmC的A3结构域分别识别和激活丙氨酸Ala、甘氨酸Gly和Tyr衍生物(3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸)。其中SfmC是一种非线性型NRPS，它重复催化激活了两次Tyr衍生物。位于SfmC的C-端RE结构域同与myxochelin生物合成相关的MxaA C端的R结构域[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)98，11136-11141]同源性很高，后者的催化机理是先将底物催化还原成中间体醛，再将底物还原成醇解离。推测SfmC的RE结构域也采用了类似的催化机制。将SFM-A生物合成基因簇中负责骨架合成的SfmA、SfmB和SfmC与将SFM-Mx1和SAC-B中负责骨架合成的NRPS的组织结构进行了对比可见(图8)，催化这三种物质骨架生物合成的NRPS在组织构上具有高度相似性。进一步分别将SfmA-AL和SafB-A₀，SfmA-A₁、SafB-A₁和SacA-A₁，SfmB-A₂、SafA-A₂和SacB-A₂，SfmC-A₃、SafA-A₃和SacC-A₃进行序列分析对照，这些NRPS不仅组织构架具有高度相似性，而且它们相对应的组织结构域也具有高度的序列同源性。联系到SFM-A、SFM-Mx1和SAC-B在分子结构上所具有的相似性，可以推断这三种物质的生物合成应该是采用相同的机制合成了共同的聚肽骨架。

根据A.Marahiel[EMBOJ.(1997)16，4174-4183；Chem.Biol.(1999)6，493—505]和Townsend[Chem.Biol.(2000)7，211-224]的总结，A结构域的底物特异性可以由位于该蛋白和底物结合区的8个位置固定的关键氨基酸残基来预测。我们将这些A结构域决定底物选择性的8个核心氨基酸进行对比，结果如表2所示。

表2.NRPSA结构域决定底物选择性的8个核心氨基酸进行对比

Pospiech等人关于SafA和SafB各个模块A结构域激活底物的推测主要是根据组织结构和催化功能一对应的线性逻辑关系推测的，而不是根据底物识别的规则[Chem.Biol.(2000)7，623-642]。然而不符合线性逻辑关系的生物合成的例子已经发现了很多[ChemBioChem.(2002)3，490-504]，说明仅根据这一点而不考虑保守氨基酸的底物选择性这种做法是不可靠的。SafB-A1与microcystin的McyA及bleomycin的NRPS-7中推测激活Ala的结构域中决定底物特异性的8个核心氨基酸一致，因此沈奔等人[Chem.Biol.(2000)7，623-642]认为这三种蛋白决定底物特异性的氨基酸基序可能是一种新型的用来识别Ala的氨基酸序列。另一方面，SafA-1与已经发现的Tal[J.Mol.Biol.(1999)286，465-474]和CdaPSII[Chem.Biol.(1999)6，385-400]中激活甘氨酸的结构域同源性很高，说明它极有可能激活甘氨酸而非作者所推测的酪氨酸衍生物。A.Velasco等人推测[Mol.Microbiol.(2005)56，144-154]SacA-A直接激活一个Ala-Gly二肽，这个二肽由一个非常活泼的核糖肽基转移酶获得或来自蛋白质水解。这一假设缺乏足够证据，且SacB-A和SacC-A的显著差异也不支持它们同样激活L-Tyr衍生物的假设。综上所述，我们认为，A.Velasco和Pospiech等人的推测存在着不合理之处，而我们的推理则能比较圆满的解释这三种类似物共同的聚肽骨架的生物合成途径。

NRPS模块中A结构域对于底物的特异性是推测其催化机制的关键。SFM-A的多肽骨架是由SfmA、SfmB和SfmC三个NRPS模块共同催化合成的。起始合成时，SfmA的A1结构域首先识别并激活一个丙氨酸，活化的丙氨酸被PCP₁的巯基捕获形成氨酰-S-PCP1。下游的SfmB-A₂结构域识别激活一个甘氨酸。丙氨酸与PCP1相耦联的肽链上的α-羰基碳原子受到下游模块上的Gly-S-PCP2通过氨基基团孤对电子的亲核进攻形成一个二肽。SfmC-A3识别并激活3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸，整个SfmC重复使用了两次，催化了两次3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸的延伸。然后四肽-S-PCP3被RE结构域还原成醛并解离下来，环合后形成了SFM-A的多肽骨架(图6B)。

为了进一步验证上述模型，需要对SfmA，SfmB，SfmC三个NRPS蛋白底物的选择性进行实验验证。编码SfmA的C-A-PCP三功能域和SfmB，SfmC两个NRPS蛋白的基因被克隆入表达载体pET28a中，在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导得到表达。重组蛋白SfmA(C-A-PCP)和SfmB、SfmC三个NRPS重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和FPLC得到分离纯化(图9A)，采用ATP-³²PPi同位素交换的方法进行测活。结果显示：SfmA(C-A-PCP)特异地识别丙氨酸，SfmB识别甘氨酸，而SfmC特异性识别L-酪氨酸衍生物3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸(图9B)。这与我们的推测完全吻合。

7.SFM-A完整的生物合成途径及后修饰得到系列番红霉素分子：

SFM-A分子骨架聚肽链部分是由非核糖体聚肽合成酶NRPS催化合成的(图6B)。在上述NRPS的催化下1分子丙氨酸、1分子甘氨酸与2分子3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸缩合成四肽，然后四肽-S-PCP3被RE结构域还原成醛并解离下来，环合后形成了SFM-A的多肽骨架。然后SfmCy1和SfmCy2的作用下进一步环合形成核心骨架结构，进而在SfmM1催化下发生N—甲基化、SfmO2催化下发生酚氧化成醌生成SAC-B，然后在SfmO4催化下发生酚氧化成醌，进而发生转氨、氰化等生成SFM-A。而SfmO3和SfmO1可能催化14位进一步发生氧化形成SFM-F、D等系列类似物。

8.SFM-A生物合成基因簇的应用—生物合成基因簇中的基因可以在异源宿主荧光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2中进行异源表达可以催化SAC-B的生物转化：

在克隆、分析了完整SFM生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对SFM-A的生物合成机制进行了初步探讨，这有助于理解SFM-A和其他四氢异喹啉家族化合物的生物合成机制，同时也为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得SFM-A结构类似物提供了可能。荧光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2发酵产生SAC-B类化合物(图1)，该化合物的结构与SFM结构类似，但活性却低很多。同时，在我们推测的SFM-A生物合成途径中，SAC-B是中间产物(图6B)，这提示我们有可能利用SFM-A的生物合成基因在简单、低等的荧光假单孢菌中部分重组相对复杂的SFM-A的生物合成途径，从而将SAC-B进一步转化为其他SFM-A结构类似物。当sfmO4基因以pVLT33[Gene(1993)123，17-24]为载体构建的表达质粒采用接合转移的方法导入SAC-B产生的宿主菌Pseudomonas fluorescens A2-2中得到相应的突变菌株，经发酵、HPLC和LC-MS分析(图10BIII)显示sfmO4导入的突变株可以将SAC-B转化为新化合物—氨基化的SFM-S(aminated SFM-S)。若在发酵产物中加入***相应的化合物均转化为相应含氰基单元的化合物SFM-Y3(图10BIV)。SfmO4编码细胞色素P450氧化酶，在SFM-A生物合成基因簇中有两个基因编码细胞色素P450氧化酶(sfmO3和sfmO4)，SfmO4在异源宿主荧光假单孢菌Pseudomonasfluorescens A2-2中成功地将SAC-B转化为aminated SFM-S同时也进一步显示该基因编码的酶在SFM-A生物合成途径中的功能：即催化苯酚环氧化为醌的结构。

9.SFM-A生物合成基因簇的应用—生物合成基因簇中的基因可以在异源宿主大肠杆菌中进行异源表达并得到重组蛋白：

氧化还原酶催化机制的研究对于阐明SFM-A的整条生物合成途径具有重要意义。在SFM-A生物合成基因簇中有8个基因编码的蛋白(sfmO1—sfmO6及sfmCy1、sfmCy2)与已知的氧化还原酶同源性很高，推测它们属于氧化还原酶系。其中7个氧化还原酶(sfmO1—sfmO5及sfmCy1、sfmCy2)在大肠杆菌BL21(DE3)中以pET28a为载体可以很好地进行蛋白表达。另外N-甲基化酶基因sfmM1和负责前体3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸生物合成的基因sfmM2、sfmM3及sfMD均可在大肠杆菌中获得很好的表达。其中的蛋白SfmO1、SfmO3、SfmO4、SfmM2、SfmM3及SfmD可以被分离纯化获得可溶性重组蛋白(图11)以进行进一步功能研究。

以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

SFM-A产生菌链霉菌S.lavendulae314总DNA的提取：

将100μL1x10⁸S.lavendulae314孢子悬液接种到3mL ISP-2(Yeast extract0.4％，Malt extract1.0％，Glucose0.4％，pH7.2)液体培养基中，30℃，230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期，取2mL接种到50mL ISP-2中(含25mM氯化镁)，30℃，250rpm培养约23hr后达到稳定生长期前期，呈乳黄色浑浊，将菌液4℃，3500rpm，离心15min收集菌丝，用裂解液洗涤，收集淡乳黄色菌丝0.5mL。向1mL菌丝中加入10mL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管，涡旋至均一，37℃水浴15mim。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL，用裂解液新鲜配制)，1mL10％SDS，混匀后迅速放入70℃水浴15mim，呈澄清。置冰上冷却，加入2.5mL5M KAc，冰上冷却15min。加入10mL饱和酚，混匀，10mL氯仿，混匀，12000rpm，4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加等量的CHCl₃-异戊醇(24：1)抽提，12000rpm，4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管，加5mL70％乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE溶解，加RNase A使终浓度为50μg/mL，37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，CHCl₃-异戊醇抽提两次，向水相中加入0.1体积的3MNaAc，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL70％乙醇用于洗涤)，将液体吸出，再加1mL无水乙醇洗涤，吸出乙醇，超净台中吹干，溶于适当体积的TE(pH8.0)中。

实施例2

SFM-A产生菌链霉菌S.lavendulae314遗传转移***的建立：

培养含有适当质粒的E.coliS17-1至OD₆₀₀0.3-0.4，20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于—80℃的S.lavendulae314的20％甘油孢子悬液500μL，用等体积的TES缓冲液(50mM TES Na，pH8.0)洗两次，重悬于等体积的TES缓冲液，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基，37℃温育2—5hr。离心重悬于0.5—1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM MgCl₂的平板上，30℃温浴20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖3mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的LB软琼脂或1mL无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。

由于S.lavendulae314对硫链丝菌肽，阿泊拉霉素和红霉素都敏感，最后确定遗传转移所用抗生素的浓度：硫链丝菌肽25μg/mL，阿泊拉霉素50μg/mL，红霉素50μg/mL。IWL-4(可溶性淀粉1.0％，K₂HPO₄0.1％，MgSO40.1％，NaCl0.1％，(NH₄)₂SO₄0.2％，CaCO₃0.2％，FeSO₄0.0001％，MnCl₂.6H₂O0.0001％，ZnSO₄0.0001％，酵母提取物0.05％，胰化蛋白胨0.1％，琼脂2.0％，pH7.2)培养基最好，接合转移效率最高。在IWL-4培养基上，无论是在链霉菌中可以自主复制的质粒pKC1139，pHZ1358，还是位点特异性整合的质粒pSET152，接合转移的效率都较高。转移效率约为10^-4。

实施例3

SFM-A产生菌链霉菌S.lavendulae314基因组文库的构建：

首先通过一系列的稀释实验来确定Sau3AI的用量，在此基础上大量酶切得到的DNA片段略大于40kb，脱磷。SuperCos1先用Xba I从两个cos序列中间切开并脱磷，然后再从多克隆位点处用Bam HI切开，获得两个臂，与制备的40kb的DNA片段连接过夜。从-80℃冰箱中取出包装混合物置于干冰桶中，将包装混合物在指间迅速融化，在刚刚开始融化时加入4μL的连接产物，用枪混匀，22℃水浴2小时。加入500μL SM缓冲液[(L^-1)：5.8g NaCl，2.0g MgSO₄，50.0mL1MTris.HCl(pH＝7.5)，5.0mL2％(w/v)明胶]和50μL氯仿，轻轻混匀，离心机离心4秒，上下界面出现沉淀，转移上清至新管中，于4℃保存。将冻存于-80℃的菌株E.coli VCS257涂布在LB培养基上复苏。挑取单菌落接种于50mL LB培养基中(蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl1.0％，pH＝7.0；添加0.2％麦芽糖和10mMMgSO₄)，37℃，220rpm振荡6.5小时，测得其OD₆₀₀＝0.83时，取用100μL的包装上清和100OD₆₀₀＝0.83的菌液，轻弹管壁使其混匀，平行操作5份。22℃水浴30分钟，加入800μL的LB培养基，37℃水浴1.5小时，每15分钟倒转一次。每一份涂布一块大板，LB琼脂(Amp：100μg/mL)(15mm×15mm)，每一份用200μL的LB培养基涮洗，37℃培养18个小时。测定噬菌斑形成单位(pfu)以估算文库的效价。然后用LB培养基刮洗，加入氨苄西林和甘油，使氨苄西林的终浓度为50μg/mL，甘油的终浓度为18％。分装成1mL×12，0.5mL×48，025mL×24。保存于-80℃。共约10000个克隆，效价为4000cfu/μg DNA。对于链霉菌而言，其染色体DNA的大小约为8Mb，如果***片段为20kb的文库效价是2000～5000cfu，就足以代表它的整个基因组。我们文库的效价达到4000cfu/μg DNA，具有良好的质量，满足文库筛选的需要。

实施例4

SFM-A产生菌链霉菌S.lavendulae314的发酵、产物分离纯化与鉴定：

取1x10⁸S.lavendulae314孢子100μL涂布在YSA(酵母提取物0.1％，可溶性淀粉0.5％，琼脂1.5％，自来水，pH7.5)平板上，30℃培养七天后，用打孔器打一块长满孢子的琼脂块接种到50mL(500mL锥形瓶)发酵培养基(葡萄糖0.1％，可溶性淀粉1.0％，NaCl0.5％，K₂HPO₄0.1％，Casein acid hydrolysate0.5％，Meat extract0.5％，自来水，pH7.0)中，27℃，250rpm培养。约20小时后，产生深蓝色色素，培养基呈浑浊，有很多泡沫。6小时后停止培养，离心收集上清，调pH＝6.8，加KCN使终浓度为1mM，35℃震荡30min。将发酵液用乙酸乙酯萃取，有机相用去离子水洗，有机相浓缩抽干溶于100μL乙酸乙酯。取20μL经HPLC检测。

HPLC分析：

UV＝270nm；柱子：EC150/4.6 NUCLEOSIL100-5 C18Ser.No.2085011Batch21302092；流动相条件：V＝1mL/min；A＝H₂O(0.05％TFA)B＝CH₃CN(0.05％TFA)

时间/min	0	5	25	27	29	30
							B/％	10	10	85	85	10	10

实施例5

PCR克隆SFM-A生物合成基因：

PCR体系包含：DMSO(8％，v/v)，MgCl₂(25mM)，dNTP(2.5mM)，兼并性引物(40mM)，Taq DNA聚合酶(2.5u)及适量模板S.lavendulae314总DNA。首先95℃，3min，1轮；然后94℃，1min，68℃，1min，72℃，2min，5轮；94℃，1min，65℃，1min，72℃，2min，30轮；最后72℃，10min，1轮。PCR结束后，1％琼脂糖电泳检查结果。低熔点胶回收预期大小的DNA片段，与pGEM T Easyvector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素，IPTG(异丙基硫代—β—D-半乳糖苷)和X-gal(5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D-半乳糖苷)的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落过夜培养，抽提质粒，EcoR I酶切鉴定是否含有预期大小的DNA***片段。***有预期大小DNA片段的质粒测序。

实施例6

核酸分子杂交：

1)DIG DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL0.8MEDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL4M LiCl混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于—80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μLTE((pH8.0)中。

2)DIG DNA探针标记后的质量检测：稀释标记的DNA探针，至以下六个梯度，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。稀释标记的对照DNA至浓度分别为以下浓度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分别取1μL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据7)所述步骤进行显色反应，对比标记的DNA探针和DIG标记的对照DNA的显色强度以决定标记的DNA探针浓度。

3)菌落杂交(文库筛选)的膜转移：将保存于—80℃的基因文库稍融，取50μL，用450μLLB稀释得到10^-1的稀释倍数，倍比稀释得到10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。300μL涂平板(15cm×15cm，平板为LB/50μg/mL卡那霉素)。选取合适的比例，使每块平板约1200—1500个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37℃培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上，干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4—5hr，使克隆重新生长作为原平板。将尼龙膜置于变性液(0.25M NaOH，1.5M NaCl)饱和的滤纸上15分钟(不要浸过膜)，转移至中和液(1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH7.5)饱和的滤纸上5分钟。转移至2×SSC(20xSSC储备液(L-1)：NaCl，175.3g，柠檬酸钠，88.2g，pH＝7.0)饱和的滤纸上自然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120℃固定45分钟。常温下于3×SSC/0.1％SDS溶液中振荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。

4)Southern杂交的膜转移：DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适当距离，做好标记。浸泡于400mL0.25M HCl中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗三次。取一张每边都比凝胶大1mm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标记。采用向上毛细管转移方法，用10×SSC转移缓冲液转移8—24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分钟。

5)预杂交和杂交：预热杂交液(20mL/100cm²)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm²)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。

6)杂交后严紧洗脱：室温下用2×SSC/0.1％SDS漂洗两次，每次5分钟。68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。

7)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15MNaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10％的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)中平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于70％DMF，浓度为70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μLNBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。

实施例7

基因中断突变菌株的获得：

将获得的转化子接种到液体培养基ISP-2(Am25μg/ml)中，30℃振荡约28hr。取出200μl涂布在ISP-2(Am50μg/ml)平板，30℃培养6-8天，收孢子，保存于-80℃；取出10μl在ISP-2(Am50μg/ml)平板画线，37℃培养，放置2—3天。挑37℃整合生长的单菌落，接种至液体培养基ISP-2(Am25μg/ml)，37℃，振荡2—3天。取出涂布在ISP-2平板(Am50μg/ml)，37℃整合2-3天，收孢子，保存于-80℃。取出200μL涂布在ISP-2平板(Am50μg/ml)，30℃放置2—5天，用于鉴定其生物活性。

基因中断或基因置换所用载体为pOJ260或pKC1139，基因置换用红霉素抗性基因替代目标基因中间的DNA片段。构建好的质粒通过实施例2所述属间接合转移的方式导入S.lavendulae314中得到双交换突变体，所得突变体通过Southern杂交在基因型上加以证明。

实施例8

基因在假单孢菌中表达及发酵产物分析：

首先将pET28a中的目标蛋白基因以XbaI/HindIII切出，克隆入载体质粒pVLT33相应的位点，转化E.coli CC118(Kana50μg/mL)，酶切鉴定。正确的质粒以结合转移的方式导入假单孢菌PseudomonasfluorescensA2-2中。接合转移方法如下：将构建的pVLT33质粒的衍生质粒转化到E.coli S17-1中，于LB中(Kana50μg/mL)37℃培养。取P.fluorescens A2-2的菌株在LB的平板上划线培养，于30℃培养。S17-1(含有pVLT33的衍生质粒)的单菌落，于LB(Kana50μg/mL)中37℃培养过夜。挑取P.fluorescens A2-2的单菌落于LB中30℃培养过夜。取上述细菌的过夜培养物，以1％的量转接到相应的LB的培养基中，继续在相应的温度下培养至OD₆₀₀至0.8—1.0左右。分别取上述两种菌液1mL和4mL按1：4的比例混合均匀，用0.22μm的膜过滤，取下滤膜，有菌的一面朝上，放置在LB的平板上(无抗生素)，37℃培养8hr。将滤膜取下，用3mL10mM的MgSO4洗膜。分别取1ul、0.1ul稀释涂在LB的平板上(Kana50μg/mL同时加入Ap100μg/mL或Tc12.5μg/mL以抑制E.coli的生长)，于30℃培养过夜。挑3～5个单菌落到LB培养基(Kana50μg/mL同时加入Ap100μg/mL或Tc12.5μg/mL)于27—30℃培养过夜，保存菌种。进一步培养和表达同大肠杆菌，采用LB培养基(Kana50μg/mL)，培养温度是25℃—30℃；在OD₆₀₀在0.6—1.0加入IPTG诱导，诱导后可适当延长培养的时间(24hr)。

Pseudomonas fluorescens A2-2及突变体的发酵：接种0.1％的菌种到50mLYMP3(葡萄糖1％，牛肉提取物0.25％，胰化蛋白胨0.5％，CaCO₃0.8％，pH6.5)培养基(250mL摇瓶)中，27℃，250rpm培养30hr，转接2％到50mL(500mL摇瓶)M-16培养基(D-mannitol 15.2％，dried yeast3.5％，(NH4)2SO41.4％，FeCl30.018％，CaCO32.6％，pH6.5)中，27℃，220rpm培养四天。发酵液离心，上清调pH＝9，用乙酸乙酯萃取浓缩。或先调pH＝3，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再将水相调pH＝9，用乙酸乙酯萃取浓缩，浓缩液中含有SAC-B。如果将发酵液调pH＝6.8，加KCN至终浓度为1mM，35度，250rpm反应半小时，再用乙酸乙酯萃取浓缩，浓缩液中含有cyano-SAC-B。突变体的发酵与此类似，在转接40小时后，加IPTG至终浓度为0.2mM，24℃，220rpm培养至96小时(或72小时)。发酵液离心上清调pH＝9，用乙酸乙酯萃取浓缩。或先将pH＝3，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再将水相调pH＝9，用乙酸乙酯萃取浓缩，浓缩液中含有化合物aminated SFM-S。如果将发酵液调pH＝6.8，加KCN至终浓度为1mM，35℃，250rpm反应半小时。用乙酸乙酯萃取浓缩，浓缩液中含有SFM-Y3。

实施例9

基因在大肠杆菌中表达及重组蛋白分离纯化：

主要以PCR方法获得待表达的目标基因(表NRPS基因时PCR获得编码N端和C端的基因，中间部分通过粘粒亚克隆获得)，以EcoRI/HindIII克隆入普通载体如pSP72中，经DNA顺序分析确定后，***片段再经NdeI/HindIII切出，连入表达载体pET28a的相应酶切位点，获得了表达质粒。转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接入3mL LB(Kana，50μg/mL)，37℃过夜培养。取30μL过夜培养物接入3mL LB(Kana50μg/mL)培养液，37℃培养两小时，加入IPTG至终浓度1mM/L，37℃继续培养四小时后离心收集1mL菌体，加入50μL蛋白电泳缓冲液，涡旋后在沸水浴中煮沸3min，取出样品，12000rpm离心5min，取10μL上清上样，用SDS-PAGE蛋白电泳检查表达情况。大量表达将表达良好的2ml过夜培养物接种于500ml LB培养基(卡那霉素50μg/ml)，37℃培养2.5小时(A_600nm约0.5)，转移至25℃继续培养0.5小时，加入IPTG至终浓度0.1mM，25℃表达6小时或15℃表达24小时以上。冰中冷却，4℃5000rpm离心5分钟收集菌体(取1ml菌液收集菌体作为SDS-PAGE样品分析全菌蛋白)，STE缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0)洗涤1次，破菌缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，以NaOH调pH为8.0)洗涤1次，加入10ml(2ml/g湿菌体)破菌缓冲液(加入溶菌酶至终浓度1mg/ml)重悬均匀，4℃(或冰中)放置30分钟。-80℃冻存30分钟后室温融化，冰浴状态下超声破碎10分钟(200～300W，超声10秒间歇50秒)。上清液转移至50ml尖底离心管。加入1～2ml Ni-NTA亲和层析柱填料(视可溶性蛋白表达量及大小而定)，冰浴状态下摇荡1～2小时(若蛋白大于150KD时间可延长，200KD以上可过夜)。4℃2,000rpm离心5分钟，倾去上清，用10～20ml淋洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，25mM咪唑，以NaOH调pH为8.0)轻轻旋起柱填料，冰浴状态下摇荡10分钟，4℃2,000rpm离心5分钟，倾去上清，加入10ml淋洗缓冲液旋起柱填料，装柱，以10～20ml淋洗缓冲液淋洗2～3次。以0.5mlx6次洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，以NaOH调pH为8.0)对目的蛋白进行洗脱。分析SDS-PAGE结果，若目的蛋白纯度达到90％以上，合并目的蛋白，4℃对透析液(50mM Tris-HCl，25mM NaCl，5mMβ-巯基乙醇，10％甘油，0.02％NaN₃)透析过夜后定量，分装保存于-80℃待测活；若纯度较差则合并目的蛋白，根据目的蛋白的性质结合其他方法(如凝胶过滤)进一步分离纯化。

以下根据本发明内容提供基因和蛋白序列：

氨基酸/核苷酸序列表：

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院上海有机化学研究所

<120>番红霉素(Saframycin)生物合成基因簇

<130>说明书、权利要求书

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>49362

<212>DNA

<213>链霉菌Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>2

<211>195

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>3

<211>304

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>4

<211>169

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>5

<211>512

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>6

<211>479

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>7

<211>819

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>8

<211>521

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>9

<211>199

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>10

<211>160

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>11

<211>165

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>12

<211>395

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>13

<211>61

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>14

<211>504

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>15

<211>475

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>16

<211>1836

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>17

<211>1082

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>18

<211>1485

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>19

<211>365

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>20

<211>789

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>21

<211>73

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>22

<211>366

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>23

<211>178

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>24

<211>389

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>25

<211>484

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>26

<211>313

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>27

<211>1127

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>28

<211>325

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>29

<211>401

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>30

<211>334

<212>PRT

<213>Streptomyces lavendulae314(NRRL11002)

<400>1

<210>31

<211>376

<212>PRT

<213>Streptomyceslavendulae314(NRRL11002)

<400>1

Claims

1.一种抗肿瘤活性的抗生素-番红霉素的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于编码番红霉素生物合成所涉及的30个基因。

2.一种根据权利要求1所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成抗生素番红霉素。

3.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成S-腺苷化甲硫氨酸。

4.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成双四氢异喹啉生物碱核心骨架结构。

5.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸或5-甲基-O-甲基酪氨酸。

6.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其中的基因在荧光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2中进行异源表达可以催化番红菌素B的生物转化得到氧化产物氨基化的番红霉素S，该氧化产物经***处理可以得到番红霉素Y3。

7.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其中的非核糖体聚肽合成酶基因在大肠杆菌中获得异源表达，经分离纯化得到的重组蛋白分别识别并活化丙氨酸、甘氨酸或3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸。

8.根据权利要求2所述的番红霉素的生物合成基因簇的用途，其中的氧化还原酶、环合酶基因、甲基化酶基因及5-甲基-O-甲基-酪氨酸-3-羟化酶基因均在大肠杆菌中获得异源表达，经分离纯化得到重组蛋白。