CN102060853A - 逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色谱法分离生物碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色谱法分离纯化生物碱的方法。其特征是该方法包括：将总生物碱溶于固定相和流动相的混合液中，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，本发明在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗脱出柱子时，交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。本发明在同等硬件设备基础上提高分离效果，显著提高所得化合物的纯度，操作方便，一次分离即可得到高纯度产品。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及生物碱分离纯化技术领域，即利用逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色谱法分离纯化方法从中草药中分离纯化高纯度的单体生物碱的方法。
背景技术
生物碱在植物体内含量少，但具有较强的生理活性。许多生物碱是治病良药，如毛茛科黄连根茎中的小檗碱是黄连素的主要成分，有抗菌消炎作用；萝芙木中的利血平能降血压；石蒜中的加兰他敏对小儿麻痹后遗症有疗效，罂粟果皮中所含的***碱是著名镇痛剂；奎宁碱是有价值的解热药；三尖杉碱和长春花碱是治癌良药；秋水仙素(碱)能人工诱变产生多倍体。有的生物碱可用来制作农业用的杀虫剂。生物碱类化合物在化学，生物学都有广泛的运用，极具商业价值。由于这各种生物碱的碱性不同，给分离纯化工作带来了很多困难，在传统色谱分离中不可逆吸附，峰展宽，峰拖尾等现象很难避免。因此如何快速、高效地从生药材粗提物中分离并纯化得到单体生物碱是大家比较关心的课题。
pH-区带精制逆流色谱是作为一种改进的高速逆流技术按照液液分配色谱技术的原理，不用任何固体支撑体或载体，因此克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，理论回收率为100％。该方法分离可离子化的pKa值相差大于0.2的物质，具有一系列优点：①与普通的高速逆流色谱相比，进样量提高了10倍。②流分被高度浓缩。③样品量的增加，是纯流分的产率明显增加。④少量的杂质被高度浓缩在主峰的边缘而易于检测。⑤没有紫外吸收的样品可以通过测定流出液的pH值而实现在线监测。(高速逆流色谱分离技术及应用，曹雪丽编著，化学工业出版社)
尽管具有上述优点，但产品的纯度还不够高，有待进一步改进。
发明内容
本发明公开了一种逆转双向洗脱的pH-区带精制逆流色谱法分离提纯生物碱的方法，该技术具有高效，快速，可在不改***件的条件下显著改善分离效果，产品纯度大于98％。
准备总生物碱溶液，将总生物碱溶于固定相和流动相的混合液中，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，收集流分即得，这是普通的pH-区带精制逆流色谱技术，本发明在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗脱出柱子时，交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。所谓交换流动相和固定相是前面作为流动相的溶剂在后面的操作中作为固定相，同样地，前面作为固定相的溶剂在后面的操作中作为流动相。
更为优选的方法包括：配制两相溶剂：将水和选自正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇中的两～三个溶剂混合，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
上述方法中的流动相和固定相可以根据不同的生物碱选取，参考文献即可，例如乙酸乙酯∶正丁醇∶水的混合溶剂。不同植物的总生物碱可以从市场购得，也可参考文献得到。
与pH-区带精制逆流色谱技术相同，本发明的方法也适合从总生物碱中分离可离子化的pKa值相差大于0.2的物质。
本发明还公开了一种从洋金花总生物碱中分离纯化东莨菪碱和阿托品的方法，即采用逆转双向洗脱的pH-区带精制逆流色谱法分离，包括：配制两相溶剂：乙酸乙酯∶正丁醇∶水体积比＝3.8-4.2∶0.8-1.2∶4.8-5.2，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将洋金花总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。目标物东莨菪碱和阿托品，它们的纯度都大于99％。
其中主机转速优选800-900rpm。
其中泵入流速优选0.8-1.5mL/min。
三乙胺加入A相后的浓度优选1.6％-0.50％，盐酸加入B相后的浓度为0.80％-0.15％。均为体积百分比。
而普通的pH-区带精制逆流色谱技术得到的产品纯度达不到要求，方法如下：将洋金花总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含三乙胺的上相溶剂的混合液中制成样品溶液。使逆流色谱仪柱子中充满固定相，顺时针转动主机，由进样阀进样，再将流动相从逆流色谱柱的首端泵入柱内，进行分离，每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱的尾端接收目标成分。所分离得到的阿托品和东莨菪碱的纯度只能分别达到96.91％和86.32％，并不能满足需求。所用的溶剂和浓度均与上述逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色谱法中相同。
洋金花总生物碱的制备方法可参考文献，也可用下列方法制备：将干燥的洋金花粉碎后以70％-100％的乙醇水或甲醇水溶液加热回流提取，将滤液减压浓缩成浸膏。然后用酸水溶解后以二氯甲烷萃取除脂溶性杂质，再碱化后以二氯甲烷萃取得洋金花总生物碱。
本发明的制备方法优点在于：在同等硬件设备基础上提高分离效果，显著提高所得化合物的纯度，操作方便，一次分离即可得到高纯度产品。
另外，黄连药材中除小檗碱和巴马亭外的其他五种主要生物碱由于含量较少，分离难度大，本发明又公开了采用逆转双向洗脱的pH-区带精制逆流色谱法从黄连总生物碱中一次性分离纯化黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱和木兰碱的方法，包括：配制两相溶剂：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水体积比＝0.8-1.2∶4.8-5.2∶0.8-1.2∶4.8-5.2，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将黄连总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，根据流分的紫外吸收或pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。目标物黄连碱，药根碱，非洲防己碱，表小檗碱，木兰碱，它们的纯度都大于98％。
其中主机转速优选800-900rpm。
其中泵入流速优选0.8-1.5mL/min。
三乙胺加入A相后的浓度优选1.6％-0.50％，盐酸加入B相后的浓度优选0.80％-0.15％。均为体积百分比。
而采用普通的pH-区带精制逆流色谱技术则产品纯度达不到要求，方法如下：将黄连总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含三乙胺的上相溶剂的混合液中制成样品溶液。使逆流色谱仪柱子中充满固定相，顺时针转动主机，由进样阀进样，再将流动相从逆流色谱柱的首端泵入柱内，进行分离，根据流分的紫外吸收或pH变化在色谱柱的尾端接收目标成分。对上述几种生物碱不能达到有效分离。所用的溶剂和浓度均与上述逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色谱法中相同。
黄连总生物碱的制备方法可参考文献，也可用下列方法制备：将干燥的黄连粉碎后以70％-100％的乙醇水或甲醇水溶液加热回流提取，将滤液减压浓缩成浸膏。然后用酸水溶解，过滤，沉淀为小檗碱和巴马亭部位，滤液以二氯甲烷萃取除脂溶性杂质，再碱化后以二氯甲烷萃取得黄连总生物碱。
附图说明
图1是对洋金花总生物碱进行分离纯化的时间-纯度-pH图(流分随pH的改变得到两个高纯度的化合物，其中compound 1是阿托品，compound 2是东莨菪碱。)
图2是对黄连总生物碱进行分离纯化的时间-UV图，(其中1是黄连碱，2是药根碱，3是非洲防己碱，4是表小檗碱，5是木兰碱)。
具体实施方式
实施例1
从洋金花药材中提取总生物碱：500g干燥洋金花粗粉用2L的95％乙醇回流提取三次，每次两小时。合并提取液并减压回收成浸膏。所得提取物用500mL 1％HCl溶液溶解，抽滤，滤液用500mL CH2Cl2萃取三次，除去脂溶性杂质。水层用10％NaOH溶液碱化至pH9-10。用500mL CH2Cl2萃取四次，合并四次CH2Cl2萃取液回收得到总生物碱。
配制溶剂***：两相溶剂***按乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝4∶1∶5，(体积比)，配制600mL的两相溶剂，静置分层。在上相中加入0.50％三乙胺为A相，在下相中加入0.15％HCl为B相。将上述总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含TEA的上相溶剂的混合液中制成样品溶液。
操作步骤：用B相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，转速为850rpm。通过进样阀进样，然后以1.0mL/min的流速，从逆流色谱柱首端泵入A相。220分钟后，停止泵入A相，改为将B相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，转速不变。每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
以HPLC分析：Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)。柱温：30℃。流动相：甲醇∶水＝20∶80(体积)(水中含containing 20mmol醋酸钠，0.30％四氢呋喃，0.02％TEA，醋酸调节pH到6.00)，检测波长216nm，流速1.0mL/min。结果如图1所示，化合物1为阿托品，化合物2为东莨菪碱。东莨菪碱和阿托品纯度均可达到99％以上。
实施例2
黄连总生物碱前处理：1g黄连总生物碱浸膏500mL 1％HCl溶液溶解，抽滤，滤液用10％NaOH溶液碱化至pH 9-10。用500mL CH2Cl2萃取四次，合并CH2Cl2萃取液回收得到目标部位。
配制溶剂***：两相溶剂***按正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶5∶1∶5，(体积比)，配制600mL的两相溶剂，静置分层。在上相中加入0.50％三乙胺为A相，在下相中加入0.15％HCl为B相。将上述总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含TEA的上相溶剂的混合液中制成样品溶液。
操作步骤：用B相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，转速为850rpm。通过进样阀进样，然后以1.0mL/min的流速，从逆流色谱柱首端泵入A相。250分钟后，停止泵入A相，改为将B相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，转速不变。根据洗脱液的紫外吸收或pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
以HPLC分析：Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)。柱温：30℃。流动相：乙腈和水(水中含0.06％TEA)梯度洗脱，(乙腈：0-20min，20％，20-25min，20％-23％，25-50min，23％-30％)，检测波长265nm，流速1.0mL/min。结果如图2所示，1是黄连碱，2是药根碱，3是非洲防己碱，4是表小檗碱，5是木兰碱，纯度均可达到98％以上。
Claims (9)
1.一种采用逆转双向的pH-区带精制逆流色谱法从总生物碱中分离纯化生物碱的方法，包括：配制流动相和固定相，将总生物碱溶于流动相和固定相的混合溶剂中，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，其特征是：在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗脱出柱子时交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。
2.权利要求2的方法，包括：配制两相溶剂：将水和选自正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇中的两～三个溶剂混合，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5分钟或根据流分的紫外吸收及pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
3.一种采用逆转双向的pH-区带精制逆流色谱法从洋金花总生物碱中分离纯化东莨菪碱和阿托品的方法，包括：配制两相溶剂：乙酸乙酯∶正丁醇∶水体积比＝3.8-4.2∶0.8-1.2∶4.8-5.2，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将洋金花总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
4.权利要求3的方法，其中洋金花总生物碱是将洋金花经乙醇提取，CH2Cl2萃取后得到。
5.一种采用pH-区带精制逆流色谱法从黄连总生物碱中分离纯化黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱和木兰碱的方法，包括：配制两相溶剂：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水体积比＝0.8-1.2∶4.8-5.2∶0.8-1.2∶4.8-5.2，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将黄连总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，根据流分的紫外吸收或pH变化在色谱柱的首端接收目标成分。
6.权利要求5的方法，其中黄连总生物碱是将黄连药材经乙醇提取，所得浸膏酸水溶解CH2Cl2萃取后得到。
7.权利要求2、3或5的方法，其中主机转速为800-900rpm。
8.权利要求2、3或5的方法，其中泵入流速为0.8-1.5mL/min。
9.权利要求2、3或5的方法，其中三乙胺加入A相后的浓度为1.6％-0.50％，盐酸加入B相后的浓度为0.80％-0.15％，为体积百分比。
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