CN102046802A - 来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法 - Google Patents

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Abstract

提供了来自酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的多肽和编码多肽的核酸序列。还提供了使用来自酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的多肽和核酸序列用于糖基化和/或翻译后修饰蛋白的方法。

Description

来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法
优先权要求
本申请要求于2008年2月27日提交的名为“来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法”的美国临时专利申请系列号61/031,984的提交日期的权益。
政府权利
依据美国能源部与***能源联盟(Battelle Energy Alliance，LLC)之间的合同编号DE-AC07-99ID13727和合同编号DE-AC07-05ID14517，美国政府拥有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及生物技术。更具体地说，本发明涉及来自酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的分离的和/或纯化的多肽和编码多肽的核酸序列以及它们的使用方法。
背景
直到最近为止人们认为细菌通常不糖基化它们的蛋白。虽然已经有一些已报道的例子，但是这些作为罕见的异常现象而不予考虑(Borman2006)。现在正变得更为接受的是细菌确实糖基化它们的蛋白，可能是以比真核生物更多的方式，尽管这种观点还没有广泛传播(
Figure BPA00001207041700011
等人2001)。在最近的一篇综述文章中，叙述了糖基化已显示出协助蛋白稳定性、调节例如可溶性的物理性质、防止蛋白水解、改变活性特征、以及靶向分泌(Upreti等人2003)。1994年，一小组从酸热脂环酸杆菌纯化出一种淀粉酶并且显示所述淀粉酶在活性生长过程中是细胞结合的、非糖基化的和不可溶的(Schwerman等人1994)。当培养物进入稳定期时，所述细胞释放多种可溶的糖基化形式的淀粉酶进入培养基(Schwerman等人1994)。没有进行比较不同形式淀粉酶活性的尝试。
发明公开内容
本发明的实施方案涉及酸热脂环酸杆菌基因组的纯化的和/或分离的核苷酸序列、或者其同源物或片段。在本发明的一个实施方案中，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或者其同源物或片段中的至少一个。在本发明的另一个实施方案中，所述同源物选自由对SEQ IDNO.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310中的至少一个具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列所组成的组。
本发明的实施方案可以进一步涉及一种分离的和/或纯化的核酸序列，所述核酸序列包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽选自由对SEQ IDNO.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、和309中的至少一个具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
本发明的实施方案还涉及由包括酸热脂环酸杆菌基因组的核苷酸序列的核苷酸序列或者其同源物或片段所编码的分离的和/或纯化的多肽。在一个实施方案中，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID No.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310中的至少一个具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或者其同源物或片段中的至少一个的核苷酸序列。在又一实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、和309的氨基酸序列。还在一实施方案中，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：对SEQ ID No：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309中的至少一个具有至少90％的序列同一性的多肽。
在本发明的实施方案中，所述多肽可以是嗜酸的和/或嗜热的。在其他的实施方案中，所述多肽可以是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
方法的实施方案包括使用第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，所述第二多肽选自由对SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
方法的另外的实施方案包括调节蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、和/或第一多肽的分泌的方法，所述方法包括通过第二多肽来糖基化或翻译后修饰第一多肽，所述第二多肽选自由对SEQ ID No：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
方法的另外的实施方案包括将产生或编码一种重组的、纯化的、和/或分离的核苷酸序列的细胞和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽放在包括等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95摄氏度的温度和/或等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0的pH的环境中，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID No：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列中的至少一个具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；所述多肽选自由对SEQ IDNo：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的序列中的一个具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
考虑到在此所包含的教导内容，本发明的这些方面及其他方面将对熟练的技术人员变得明显。
附图简述
图1分别描绘了在SEQ ID NO：1(RAAC00164)与ref|YP_001223775.1|、ref|YP_729290.1|、ref|ZP_01084440.1|、ref|ZP_01079150.1|、以及ref|ZP_01471594.1|(SEQ ID No：3-7)之间的序列比对，这些序列都具有表1中SEQ ID NO：1指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图2分别描绘了SEQ ID NO：18(RAAC00517)与ref|ZP_00589533.1|、ref|ZP_01386435.1|、ref|YP_378533.1|、ref|ZP_00513158.1|以及ref|YP_374173.1|(SEQ ID NO：20-24)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：18指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图3分别描绘了SEQ ID NO：35(RAAC00650)与ref|YP_001127183.1|、ref|ZP_02038504.1|、ref|YP_001647987.1|、ref|YP_001377114.1|以及ref|NP_835081.1|(SEQ ID No：37-41)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：35指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图4分别描绘了SEQ ID NO：52(RAAC00991)与ref|ZP_02327412.1|、ref|YP_001487207.1|、ref|ZP_01172765.1|、ref|NP_831314.1|以及ref|NP_844008.1|(SEQ ID NO：54-58)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID NO：52指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图5A和5B分别描绘了SEQ ID NO：69(RAAC01110)与ref|YP_001519856.1|、ref|YP_711688.1|、ref|ZP_01331931.1|、ref|YP_001076955.1|以及ref|YP_336440.1|(SEQ ID NO：71-75)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：69指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图6A和6B分别描绘了SEQ ID NO：86(RAAC01166)与gb|AAR99615.1|、gb|ABM68334.2|、ref|ZP_01372248.1|、ref|YP_519555.1|以及ref|ZP_02234077.1|(SEQ ID NO：88-92)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：86指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图7分别描绘了SEQ ID NO：103(RAAC01167)与ref|ZP_01515212.1|、ref|YP_001277643.1|、ref|ZP_02291400.1|、ref|YP_001633727.1|以及ref|YP_001434357.1|(SEQ ID NO：105-109)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：103指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图8A和8B分别描绘了SEQ ID NO：120(RAAC01170)与ref|YP_001324592.1|、ref|YP_342776.1|、ref|NP_780975.1|、ref|YP_001636830.1|以及ref|YP_001299026.1|(SEQ ID NO：122-126)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：120指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图9分别描绘了SEQ ID NO：137(RAAC01248)与ref|ZP_02170160.1|、ref|ZP_01171895.1|、ref|YP_076646.1|、ref|YP_590910.1|以及ref|ZP_02175410.1|(SEQ ID NO：139-143)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：137指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图10A和10B分别描绘了SEQ ID NO：154(RAAC01348)与ref|ZP_01665289.1|、ref|ZP_01643350.1|、gb|AAW77167.1|、ref|YP_452722.1|以及ref|ZP_02241787.1|(SEQ ID NO：156-160)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：154指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图11分别描绘了SEQ ID NO：171(RAAC01377)与ref|YP_147952.1|、ref|YP_520670.1|、ref|YP_001395809.1|、ref|YP_001309701.1|以及ref|YP_001643660.1|(SEQ ID NO：173-177)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：171指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图12分别描绘了SEQ ID NO：188(RAAC01611)与ref|YP_146214.1|、ref|YP_001124463.1|、ref|NP_865262.1|、ref|YP_426013.1|以及ref|ZP_01885526.1|(SEQ ID NO：190-194)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：188指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图13A和13B分别描绘了SEQ ID NO：205(RAAC01612)与ref|YP_146215.1|、ref|YP_001124464.1|、ref|YP_074948.1|、ref|YP_001039503.1|以及ref|NP_621770.1|(SEQ ID NO：207-211)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：205指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图14A和14B分别描绘了SEQ ID NO：222(RAAC01926)与ref|YP_001038202.1|、ref|ZP_01667587.1|、ref|ZP_01575301.1|、ref|YP_001211020.1|以及ref|YP_516465.1|(SEQ ID NO：224-228)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：222指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图15分别描绘了SEQ ID NO：239(RAAC01998)与ref|NP_348940.1|、ref|NP_721244.1|、dbj|BAC75700.1|、ref|ZP_00605123.1|以及ref|YP_015329.1|(SEQ ID No：241-245)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：239指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图16分别描绘了SEQ ID NO：256(RAAC02011)与ref|YP_754819.1|、ref|YP_184322.1|、ref|NP_577787.1|、ref|NP_142068.1|以及ref|NP_125751.1|(SEQ ID NO：258-262)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：256指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图17A和17B分别描绘了SEQ ID NO：273(RAAC02381)与ref|NP_622177.1|、ref|YP_848858.1|、ref|YP_001374688.1|、ref|NP_470039.1|以及ref|ZP_01929325.1|(SEQ ID No275-279)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：273指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图18分别描绘了SEQ ID NO：290(RAAC02421)与ref|ZP_01721811.1|、ref|NP_241897.1|、ref|YP_001486101.1|、ref|ZP_01170532.1|以及ref|ZP_02327994.1|(SEQ ID NO：292-296)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：290指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
图19分别描绘了SEQ ID NO：309(RAAC01168)与ref|YP_001663880.1|、ref|YP_001181332.1|、ref|YP_675143.1|、ref|YP_002352821.1|以及ref|YP_001114454.1|(SEQ ID NO：311-315)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No：309指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“：”。
实施发明的最佳方式
本发明的实施方案包括与嗜热嗜酸菌酸热脂环酸杆菌的蛋白的糖基化和/或翻译后修饰有关的基因以及相关蛋白。与这些过程有关的基因的编码序列是从酸热脂环酸杆菌的基因组测序所产生的序列信息中来确定。这些基因和蛋白可能代表酸热脂环酸杆菌或其他生物体的代谢工程的目标。与蛋白的糖基化和/或翻译后修饰相关的在酸热脂环酸杆菌的基因组中发现的核酸序列、以及由此编码的氨基酸的非限制性实例在表1中列出。糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白可能是但不限于以下类别：UDP β-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶以及其他。
本发明的实施方案部分地涉及包括酸热脂环酸杆菌的基因和/或蛋白的基因序列和/或蛋白序列。所包括的基因和蛋白是那些在蛋白的糖基化和/或翻译后修饰中起作用的基因和蛋白。细胞内酶活性在本质上可能是嗜热的和/或嗜酸的并且类似基因的一般实例描述于文献中。基因、序列、酶以及因子的类别包括但不局限于表1列出的那些。
本发明涉及如下核苷酸序列：包括酸热脂环酸杆菌的基因组的分离和/或纯化的核苷酸序列，选自SEQ ID No：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或其片段之一的序列。
本发明同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于它们包括以下至少之一：a)SEQ ID No：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或其片段之一的序列的至少一个的核苷酸序列；b)与如在a)中所定义的核苷酸序列同源的核苷酸序列；c)与如在a)或b)中所定义的核苷酸序列互补的核苷酸序列和它们对应的RNA的核苷酸序列；d)能够在严格条件下与如在a)、b)或c)中所定义的序列杂交的核苷酸序列；e)包含如在a)、b)、c)或d)中所定义的序列的核苷酸序列；以及f)由例如在a)、b)、c)、d)或e)中所定义的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。
根据本发明，核苷酸、多核苷酸或核酸序列将被理解为既表示处于单体和二聚体(所谓的串联)形式的双链或单链DNA又表示所述DNA的转录产物。
本发明的方面涉及这样的核苷酸序列：可能从分离方法起始或从基因工程的方法起始对其进行分离、纯化或部分地纯化，所述分离方法诸如例如离子交换层析、通过基于分子大小排除、或通过亲和性、或者可替代的基于不同溶剂溶解度的分级分离技术，所述基因工程的方法诸如扩增、克隆和亚克隆，对于本发明的序列来说，由载体携带是可能的。
根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列片段将被理解为指定的酸热脂环酸杆菌基因组的任何核苷酸片段，并且以非限制性实例的方式可以包括所起源的序列的长度为至少8、12、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000或更长的连续核苷酸。
根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列的特定片段将被理解为指定的酸热脂环酸杆菌基因组的任何核苷酸片段，所述片段在与酸热脂环酸杆菌基因组序列的对应片段进行比对或比较之后具有至少一个不同性质的核苷酸或碱基。
在本发明的意义上的同源的分离和/或纯化的核苷酸序列被理解为表示与根据本发明的核苷酸序列的碱基具有至少一定百分比同一性的分离的和/或纯化的核苷酸序列，所述百分比同一性为至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％或99.7％，这个百分比是纯统计的，并且在这两条核苷酸序列任意长度和全长之间分布差异是可能的。
在本发明的意义上的特定的同源核苷酸序列被理解为表示具有如以上所定义的特定片段的至少一条核苷酸序列的同源核苷酸序列。所述“特定的”同源序列可以包括例如与代表酸热脂环酸杆菌的基因组的变体的基因组序列或其片段的序列相对应的序列。因而这些特定的同源序列能够对应于与酸热脂环酸杆菌菌株内的突变有关的变异，并且特别对应于至少一个核苷酸的截短、替换、缺失和/或增添。所述同源序列能够同样地对应于与遗传密码的简并性有关的变异。
术语“序列同源性的程度或百分比”是指如在本申请中所定义的“在最优比对之后在两条序列之间序列同一性的程度或百分比”。
两条氨基酸或核苷酸序列当如以下文所述进行最大对应比对时，如果在这两条序列中的氨基酸或核苷酸残基的序列是相同的，则称它们是“相同的”。在两种(或多种)肽或多核苷酸之间的序列比较通常是通过比较在区段或“比较窗口”的两条最佳比对的序列的序列而进行，以识别和比较局部区域的序列相似性。通过Smith和Waterman，Ad.App.Math 2：482(1981)的局部同源性算法，通过Neddleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(在Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)，或者通过目测可进行用于比较的序列的最优比对。
通过比较在比较窗口的两条最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”(或者同一性的程度)，其中在所述比较窗口中的肽或多核苷酸序列的部分可以包括相比于参考序列(它不包括增添或缺失)的增添或缺失(即空位)，以用于这两条序列的最优比对。百分比的计算是通过确定相同的氨基酸残基或核酸碱基在两个序列中都存在的位置的数目以得出匹配的位置的数目，用匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，并且将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。
以上所给出的序列同一性的定义是将被本领域熟练技术人员使用的定义。所述定义本身不需要任何算法的帮助，所述算法仅对实现序列的最优比对而不是序列同一性的计算有帮助。
从以上所给出的定义，由此可知，对于两条比较序列之间的序列同一性存在定义明确的唯一值，所述值对应于最佳比对或最优比对所获得的值。
BLAST N或BLAST P“BLAST 2序列”为在网站worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html中可得到的软件，并且被发明人以及通常被熟练技术人员习惯性地用于比较和确定两条序列之间的同一性，在上述软件中，依赖于要比较的序列长度的空位值(gap cost)被所述软件直接选择(即对于长度大于85的替换矩阵BLOSUM-62，为11.2)。
本发明的序列的互补核苷酸序列被理解为表示如下的任何DNA：其核苷酸与本发明的序列的核苷酸是互补的，并且其方向是颠倒的(反义序列)。
在严格条件下与根据本发明的核苷酸序列杂交被理解为表示以如下方式所选择的温度和离子强度的条件下的杂交：所述方式为使得温度和离子强度允许保持在互补DNA的两个片段之间的杂交。
通过举例说明的方式，目的是限定以上所述的核苷酸片段的杂交步骤的非常严格性的条件有利地如以下所述。
在65℃的优选温度，在SSC缓冲液，对应于0.15M NaCl和0.05M柠檬酸钠的1x SSC的存在下进行杂交。洗涤步骤例如可以如下进行：在室温下的2x SSC，接着是用在65℃下的2x SSC，0.5％SDS；2x 0.5x SSC，0.5％SDS的两次洗涤；在65℃各持续10分钟。
使用例如42℃的温度在2x SSC缓冲液的存在下的中度严格性条件，或者例如37℃的温度在2x SSC缓冲液存在下的较低严格性的条件，分别要求在这两条序列之间杂交的总体上较少量的互补。
用于具有近似350个碱基大小的多核苷酸的以上所述的严格杂交条件将由本领域的熟练技术人员根据Sambrook等人，1989的教导进行修改以适合于更大或更小尺寸的寡核苷酸。
允许获得根据本发明的同源序列的方法中可被用作引物或探针的那些核苷酸序列是在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中，这些方法如聚合酶链式反应(PCR)、核酸克隆和测序是本领域熟练技术人员公知的。
在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中，在允许存在SEQID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310、其片段之一、或如以下所定义的要被鉴别的其变体之一的方法中可被用作引物或探针的那些核苷酸序列被再次优选。
可以例如通过特异性扩增如PCR，或者在用适当的限制性内切酶消化根据本发明的核苷酸序列之后获得根据本发明的核苷酸序列片段，这些方法具体在Sambrook等人，1989年的著作中描述。同样能够根据本领域的普通技术人员所熟知的方法通过化学合成获得此类代表性片段。
修饰的核苷酸序列将被理解为表示根据本领域熟练技术人员公知的技术通过诱变获得的任何核苷酸序列，并且包含关于根据本发明的正常序列的修饰，例如在多肽表达的调节序列和/或启动子序列中的突变，特别地导致所述多肽的表达率的改变或导致复制周期的调节。
修饰的核苷酸序列同样将被理解为表示编码如下文所定义的修饰的多肽的任何核苷酸序列。
本发明涉及包括酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的核苷酸序列的核苷酸序列，其特征在于所述分离的和/或纯化的核苷酸序列选自序列SEQID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或其片段之一。
本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于它们包含选自以下的核苷酸序列：a)SEQ ID No.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或它们的片段之一或它们的片段之一的核苷酸序列的至少一个；b)如在a)中所定义的序列的特定片段的核苷酸序列；c)与在a)或b)中所定义的序列具有至少80％同一性的同源核苷酸序列；d)如在a)、b)或c)中所定义的序列的互补核苷酸序列或与如在a)、b)或c)中所定义的序列相对应的RNA的序列；以及e)由如在a)、b)、c)或d)中所定义的序列修饰的核苷酸序列。
在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列之中的是SEQ ID No.13-17、30-34、47-51、64-68、81-85、98-102、115-119、132-136、149-153、166-170、183-187、200-204、217-221、234-238、251-255、268-272、285-289、302-306、319-323、336-340、353-357、370-374、387-391、404-408、421-425、438-442、455-459、472-476、489-493、506-510、523-527、540-544、557-561、574-578、591-595、608-612、625-629、642-646、659-663、676-680、693-697、710-714、727-731、744-748、761-765、778-782和321-325或其片段的核苷酸序列，和对SEQ ID No.2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310或其片段的序列的至少一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、或99.7％的同一性的同源性的任何其他分离的和/或纯化的核苷酸序列。所述同源序列能够包括例如与酸热脂环酸杆菌的基因组序列对应的序列。以相同的方式，这些特定的同源序列能够对应于与酸热脂环酸杆菌菌株内的突变有关的变异并且特别地对应于至少一个核苷酸的截短、替换、缺失和/或增添。正如对于本领域的任何普通的技术人员是明显的，用标准技术和例如BLAST的公共可得到的计算机程序，此类同源物容易被创造和识别。如此，应该认为以上所指的每种同源物在此被列出并且被完全地描述。
本发明的实施方案包括由根据本发明的核苷酸序列或其片段所编码的分离的和/或纯化的多肽，所述片段的序列由片段表示。氨基酸序列与能够根据SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列的至少一个的三个可能的读码框中之一编码的分离的和/或纯化的多肽相对应。
本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的多肽，其特征在于它们包括选自氨基酸序列SEQ ID No.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309或其片段之一的至少一个的多肽。
氨基酸序列SEQ ID No.8-12、25-29、42-46、59-63、76-80、93-97、110-114、127-131、144-148、161-165、178-182、195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、280-284、297-301、314-318、331-335、348-352、365-369、382-386、399-403、416-420、433-437、450-454、467-471、484-488、501-505、518-522、535-539、552-556、569-573、586-590、603-607、620-624、637-641、654-658、671-675、688-692、705-709、722-726、739-743、756-760、773-777以及316-320或其片段的分离的和/或纯化的多肽，或者是与SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309或其片段的序列的至少一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％或99.7％的同一性的同源性的任何其他分离的和/或纯化的多肽是在根据本发明的实施方案的分离的和/或纯化的多肽中。正如对于本领域的任何普通的技术人员将是明显，用标准技术和例如BLAST的公共可得到的计算机程序，这些同源物容易被创造和识别。如此，应该认为以上所指的每种同源物在此被列出并且被完全描述。
本发明的实施方案还涉及多肽，其特征在于它们包括选自以下的多肽：a)根据本发明的氨基酸序列的多肽的至少5个氨基酸的特定片段；b)与如在a)所定义的多肽同源的多肽；c)如在a)或b)中所定义的多肽的特定的生物学活性片段；以及d)由在a)、b)或c)中所定义的多肽修饰的多肽。
在本说明书中，术语多肽、肽和蛋白质是可互换的。
在本发明的实施方案中，根据本发明的分离的和/或纯化的多肽可以是糖基化的、聚乙二醇化的和/或其他方式的翻译后修饰的。在另外的实施方案中，糖基化、聚乙二醇化、和/或其他的翻译后修饰可以在体内或体外发生，和/或可以使用化学技术来实施。在另外的实施方案中，任何糖基化、聚乙二醇化和/或其他的翻译后修饰可能是N-连接的或O-连接的。
在本发明的实施方案中，任何一种根据本发明的分离的和/或纯化的多肽在等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度可以具有酶活性或功能活性，和/或在等于、低于或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH条件下可以具有酶活性或功能活性。在本发明的其他实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或其他的翻译后修饰可能为根据本发明的分离的和/或纯化的多肽所需要，所述多肽在等于或低于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH、或者在等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度具有酶活性或功能活性。
本发明的方面涉及如下多肽：其通过从自然来源中纯化而被分离或获得，否则通过遗传重组或可替代地通过化学合成获得，并且它们可因此包含如将在下文所描述的非天然氨基酸。
根据本发明的实施方案的“多肽片段”被理解为指定的包含至少5个连续的氨基酸、优选10个连续的氨基酸或者15个连续的氨基酸的多肽。
在本发明中，特定的多肽片段被理解为指定的由根据本发明的特定片段核苷酸序列所编码的连续的多肽片段。
“同源多肽”将被理解为指定的具有关于天然多肽的某些修饰的多肽，具体而言，所述修饰为例如至少一个氨基酸的缺失、增添或替换，截短，延长，嵌合体融合，和/或突变。在所述同源多肽之中，其氨基酸序列与根据本发明的多肽的氨基酸的序列具有至少80％或90％同源性的多肽是优选的。
“特定的同源多肽”将被理解为指定的如以上所定义的并具有根据本发明的多肽的特定片段的同源多肽。
在替换的情况中，一个或多个连续或者非连续的氨基酸被“等同的”氨基酸代替。表述“等同的”氨基酸在此是针对指定的能够被碱基结构的氨基酸之一替换、然而没有实质上改变对应肽的生物活性的任何氨基酸，并且这样使得它们将被下文定义。正如对于本领域的任何普通的技术人员将是明显的，用标准的分子生物学技术和例如BLAST的公共可得到的计算机程序，此类替换容易被创造和识别。如此，应该认为以上所指的每种替换在此被列出并且被完全描述。在氨基酸序列SEQ ID NO.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309中的此类替换的实例可以包括氨基酸序列SEQ ID No.8-12、25-29、42-46、59-63、76-80、93-97、110-114、127-131、144-148、161-165、178-182、195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、280-284、297-301、314-318、331-335、348-352、365-369、382-386、399-403、416-420、433-437、450-454、467-471、484-488、501-505、518-522、535-539、552-556、569-573、586-590、603-607、620-624、637-641、654-658、671-675、688-692、705-709、722-726、739-743、756-760、773-777以及316-320的那些分离的和/或纯化的多肽。这些等同的氨基酸可以通过依赖于它们与所替换的氨基酸的结构同源性或依赖于能够被执行的在不同多肽之间生物活性的比较测验的结果来确定。
通过非限制性实例的方式，将提及能够被执行而不导致对应的修饰的多肽的生物活性的广泛改变的替换的可能性，例如亮氨酸被缬氨酸或异亮氨酸代替，天冬氨酸被谷氨酸代替，谷氨酰胺被天冬酰胺代替，精氨酸被赖氨酸代替等等，在相同条件下反向替换自然地是可想象的。
在另外的实施方案中，替换被限制为在具有相似的识别的酶活性的其他蛋白中不保守的氨基酸中的替换。例如，本领域任何普通技术人员可比对在相似的生物体中有相同功能的蛋白，并且确定哪些氨基酸在那种功能的蛋白中是一般保守的。可用来产生这样的比对的程序的一个实例是由与NCBI提供的数据库结合的wordlwideweb.charite.de/bioinf/strap/。此类多肽的实例可以包括但不限于那些在氨基酸序列SEQ ID No.8-12、25-29、42-46、59-63、76-80、93-97、110-114、127-131、144-148、161-165、178-182、195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、280-284、297-301、314-318、331-335、348-352、365-369、382-386、399-403、416-420、433-437、450-454、467-471、484-488、501-505、518-522、535-539、552-556、569-573、586-590、603-607、620-624、637-641、654-658、671-675、688-692、705-709、722-726、739-743、756-760、773-777以及316-320中发现的多肽。
因此，根据本发明的一个实施方案，可以在具有那种功能的蛋白中一般保守的位置制造替换或突变。在另外的实施方案中，核酸序列可以被突变或替换以使得它们编码的氨基酸是未改变的(简并性替换和/或突变)，和/或被突变或替换以使得任何生成的氨基酸替换或突变发生在具有那种功能的蛋白中一般保守的位置。此类核酸序列的实例包括但不限于在SEQID No.13-17、30-34、47-51、64-68、81-85、98-102、115-119、132-136、149-153、166-170、183-187、200-204、217-221、234-238、251-255、268-272、285-289、302-306、319-323、336-340、353-357、370-374、387-391、404-408、421-425、438-442、455-459、472-476、489-493、506-510、523-527、540-544、557-561、574-578、591-595、608-612、625-629、642-646、659-663、676-680、693-697、710-714、727-731、744-748、761-765、778-782以及321-325的或其片段的核酸序列中发现的核酸序列。
特定的同源多肽同样对应于由如以上所定义的由特定的同源核苷酸序列所编码的多肽，并且因此在本定义中包括突变的多肽或与可以在酸热脂环酸杆菌中存在的变体相对应的多肽，以及特别地与至少一个氨基酸残基的截短、替换、缺失和/或增添相对应的多肽。
根据本发明的实施方案的“多肽的特定的生物学活性片段”将被具体理解为指定的特定的多肽片段，如以上所定义那样，具有根据本发明的多肽的至少一个特征。在某些实施方案中，所述肽能够表现作为表1列出的蛋白类型的至少一种。
根据本发明的实施方案的多肽片段能够与酸热脂环酸杆菌中天然存在的分离或纯化的片段相对应，或者与能够通过蛋白水解酶如胰蛋白酶、或糜蛋白酶或胶原酶或通过化学试剂如溴化氰(CNBr)对所述多肽的切割而获得的片段相对应。此类多肽片段同样能够就如通过化学合成、从根据本发明的表达载体转化的宿主中容易地制备，所述表达载体包含允许表达所述片段的核酸，所述片段被置于适当的调节元件和/或表达元件的控制之下。
根据本发明的实施方案的多肽的“修饰的多肽”被理解为指定的通过将在以下描述的遗传重组或化学合成而获得的具有关于正常序列的至少一个修饰的多肽。这些修饰或许能够或许不能够对特异性和/或活性的起源、或结构构象的起源、定位、和根据本发明的多肽的膜***的能力的起源的氨基酸有影响。因此，产生具有等同的、提高的或降低的活性以及等同的、更窄的或更宽的特异性的的多肽是可能的。在所述修饰的多肽中，有必要提及如下多肽：其中多达5个或更多个氨基酸能够被修饰、在N-端或C-端的末端被截短、或者甚至被缺失或增添。
允许对待说明的真核细胞或原核细胞的所述调控的方法是本领域普通技术人员公知的。同样被很好地理解的是使用编码所述修饰的多肽的核苷酸序列用于所述调控例如通过根据本发明并且在以下描述的载体将是可能的。
前述的修饰的多肽可以通过使用组合化学获得，在所述组合化学中，在模型、细胞培养物或微生物上测验多肽之前***地改变多肽的部分例如以选择最具活性或具有寻找的特性的化合物是可能的。
化学合成同样具有能够利用非天然氨基酸或非肽键的优点。
因此，为了提高根据本发明的多肽的寿命持续时间，利用非天然氨基酸例如D形式或其他的氨基酸同源物例如特别是含硫形式可能是令人感兴趣的。
最后，将根据本发明的多肽的结构、其特定的或修饰的同源形式整合到多肽类型或其他类型的化学结构中将是可能的。因此，提供在N端和C端的末端不被蛋白酶识别的分子可能是令人感兴趣的。
编码根据本发明的多肽的核苷酸序列同样是本发明的部分。
本发明同样涉及可作为引物或探针使用的核苷酸序列，其特征在于所述序列选自根据本发明的核苷酸序列。
被很好地理解的是本发明在各种实施方案中同样涉及由核苷酸序列编码的酸热脂环酸杆菌的特定的多肽，所述多肽能够通过从天然多肽中纯化、通过遗传重组或通过化学合成通按本领域熟练技术人员公知以及如以下具体描述的方法而获得。以相同的方式，直接针对由所述核苷酸序列所编码的所述特定多肽的标记或未标记的单克隆抗体或多克隆抗体也被本发明包括。
本发明的实施方案另外涉及根据本发明的核苷酸序列作为引物或探针来检测和/或扩增核酸序列的用途。
因此，可使用根据本发明的实施方案的核苷酸序列来扩增核苷酸序列，特别是通过PCR技术(聚合酶链式反应)(Erlich，1989；Innis等人，1990；Rolfs等人，1991；以及White等人，1997)。
这些寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸引物有利地具有至少8个核苷酸、优选至少12个核苷酸、以及甚至更优选的至少20个核苷酸的长度。
可以有利地采用靶核酸的其他扩增技术作为PCR的替代。
本发明的核苷酸序列、特别是根据本发明的引物同样能够在扩增靶核酸的其他方法中采用，例如：TAS技术(基于转录的扩增***)，由Kwoh等人在1989年描述；3SR技术(自主序列复制)，由Guatelli等人在1990年描述；NASBA技术(基于核酸序列的扩增)，由Kievitis等人在1991年描述；SDA技术(链置换扩增)(Walker等人，1992)；TMA技术(转录介导的扩增)。
本发明的多核苷酸还能够在用作探针的核酸的扩增或修饰技术中采用，例如：LCR技术(连接酶链式反应)，由Landegren等人在1988年描述并且由Barany等人在1991年改进，所述技术采用热稳定连接酶；RCR技术(修复链式反应)，由Segev在1992年描述；CPR技术(循环探针反应)，由Duck等人在1990年描述；用Q-β复制酶的扩增技术，由Miele等人在1983年描述并且特别地由Chu等人在1986年、Lizardi等人在1988年改进，然后由Burg等人以及Stone等人在1996年改进。
在待检测的靶多核苷酸可能是RNA例如一种mRNA的情况中，借助根据本发明的至少一种引物采用扩增反应之前或者借助本发明的至少一种探针采用检测步骤之前，使用逆转录酶类型的酶以便从包含在所述生物样品中的RNA获得cDNA是可能的。获得的cDNA将因此用作在根据本发明的扩增或检测步骤中所采用的一种或多种引物或者一种或多种探针的靶。
将以这样的方式选择所述检测探针：使得它与靶序列或从靶序列中产生的扩增子杂交。通过序列的方式，这样一种探针将有利地具有至少12个核苷酸的序列、特别地至少20个核苷酸的序列以及优选地至少100核苷酸的序列。
本发明的实施方案还包括可作为根据本发明的探针或引物使用的核苷酸序列，其特征在于它们用一种放射性化合物或非放射性化合物标记。
所述未标记的核苷酸序列可以直接作为探针或引物使用，尽管所述序列普遍用一种放射性同位素(32P、35S、3H、125I)或用一种非放射性分子(生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴脱氧尿苷、荧光黄素)标记以获得可用于许多应用的探针。
核苷酸序列的非放射性标记的实例描述于例如法国专利号78.10975中，或者被Ureda等人或Sanchez-Pescador等人在1988年描述。
在后一种情况中，使用在专利FR-2422956和FR-2518755中所述的标记方法中的也将是可能的。
杂交技术能够以各种方式进行(Matthews等人，1988)。最普遍的方法包括将细胞的核酸提取物固定在支持体(如硝酸纤维素、尼龙、聚苯乙烯)上，并且包括在定义明确的条件下固定的靶核酸与探针一起孵育。在杂交后，清除过量的探针并且通过适当方法(与所述探针相关的放射活性、荧光或酶活性的测量)检测形成的杂交分子。
本发明在各种实施方案中同样包括根据本发明的核苷酸序列，其特征在于它们被共价或非共价地固定在支持体上。
根据利用依据本发明的核苷酸序列的另一个有利方式，后者能够固定在支持体上使用并且可因此用来通过特异性杂交捕获从待测验的生物样品中获得的靶核酸。如果必要，将所述固相支持体从所述样品中分离，然后在第二探针即用一种可容易检测的元素标记的所谓的检测探针的帮助下检测在所述捕获探针与所述靶核酸之间所形成的杂交复合物。
本发明的另一方面是用于序列的克隆和/或表达的载体，其特征在于它包含根据本发明的核苷酸序列。
根据本发明的载体特征在于它们包含允许所述核苷酸序列在确定的宿主细胞中整合、表达和/或分泌的元件，它们同样是本发明的部分。
所述载体那么可以包含启动子、翻译起始和终止的信号以及适当的转录调节区域。载体能稳定地保持在所述宿主细胞中，并且能够任选地具有指定所述翻译的蛋白分泌的特殊的信号。可以根据所用的宿主细胞的功能来选择这些不同的元件。为此目的，可以将根据本发明的核苷酸序列***到所选宿主内的自主复制载体或所选宿主的整合载体中。
将根据本领域熟练技术人员目前使用的方法来制备此类载体，并且将自其产生的克隆通过标准方法可能引入到适当的宿主中，所述标准方法诸如例如脂质转染、电穿孔和热激。
根据本发明的载体是例如质粒或病毒来源的载体。用于表达本发明的多肽的载体的一个实例是杆状病毒。
这些载体对于转化宿主细胞以便克隆或表达本发明的核苷酸序列而言是有用的。
本发明同样包括被根据本发明的一种载体转化的宿主细胞。
这些细胞可以通过将已***到如以上所定义的载体中的核苷酸序列引入到宿主细胞中、然后在允许复制和/或表达所述转染的核苷酸序列的条件下培养所述细胞来获得。
所述宿主细胞可以选自原核或真核***，诸如例如：细菌细胞(Olins和Lee，1993)；同样还有酵母细胞(Buckholz，1993)；以及植物细胞，例如拟南芥；以及动物细胞，特别是哺乳动物细胞(Edwards和Aruffo，1993)的培养物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；同样还有其中利用应用杆状病毒的方法是可能的昆虫的细胞，例如sf9昆虫细胞(Luckow，1993)。
本发明的实施方案同样涉及包含所述根据本发明的所述转化的细胞之一的生物。
表达酸热脂环酸杆菌的一种或多种基因或基因的部分的根据本发明的转基因生物的获得，可以根据本领域熟练技术人员公知的方法如通过病毒或非病毒转染，在例如大鼠、小鼠或兔中进行。在具有普遍存在性或者对一种组织类型选择性的强启动子的控制下，通过转染多个拷贝的所述基因获得表达一种或多种所述基因的转基因生物是可能的。通过以下获得转基因生物同样将是可能的：在胚细胞株中的同源重组，将这些细胞株转移到胚，在生殖线水平选择这些受感染的嵌合体，并且使所述嵌合体生长。
根据本发明的转化细胞和转基因生物在用于制备重组多肽的方法中是可利用的。
现今，通过基因工程、使用由根据本发明的表达载体所转化的细胞或者使用根据本发明的转基因生物相对大量地生产重组多肽是可能的。
用于制备重组形式的本发明的多肽的方法的特征在于它们采用了根据本发明的载体，和/或由根据本发明的载体所转化的细胞，和/或包含根据本发明的所述转化的细胞之一的转基因生物，这些方法本身包含在本发明中。
如在此使用的“转化”和“转化的”涉及将核酸引入细胞中，无论是原核的还是真核的。进一步，如在此使用的“转化”和“转化的”不需要涉及生长控制或生长失调。
在用于制备重组形式的本发明的多肽的所述方法之中，采用载体和/或由所述载体转化的细胞和/或包含所述转化的细胞之一的转基因生物的制备方法，包含根据本发明的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码酸热脂环酸杆菌的多肽。
根据本发明的变体可以包括产生与“载体”蛋白相融合的重组多肽(嵌合蛋白)。这个***的优点是它可以允许重组产物的稳定和/或蛋白水解的减少，在体外复性过程中溶解度的增加，和/或当融合伙伴对特定配体具有亲和性时纯化的简化。
更具体地说，本发明涉及用于制备本发明的多肽的方法，包括以下步骤：a)在允许表达根据本发明的核苷酸序列的重组多肽的条件下培养转化的细胞；b)如果需要的话，回收所述重组多肽。
当用于制备本发明的多肽的方法采用根据本发明的转基因生物时，所述重组多肽就从所述生物中被提取出来。
本发明还涉及能够通过如之前所描述的本发明的方法获得的多肽。
本发明还包括用于制备合成多肽的方法，其特征在于它使用根据本发明的多肽的氨基酸序列。
本发明同样涉及通过根据本发明的方法获得的合成多肽。
根据本发明的多肽同样能够通过在肽合成领域中常规的技术制备。这种合成可以在均相溶液中或在固相中进行。
例如，可以借助于由Houben-Weyl在1974年所描述的在均相溶液中的合成技术。
这种合成方法包括按所需顺序对连续氨基酸进行两个两个地连续缩聚，或者包括按适当顺序对之前形成并且已包含几个氨基酸的氨基酸和片段、或可替代地之前以这种方式制备的几个片段进行缩聚，应当理解的是有必要事先保护由这些氨基酸或片段所携带的所有的反应性官能团，除了一端的胺官能团和另一端的羧基之外或者反之亦然，根据在肽合成中公知的方法，所述胺官能团和羧基在正常情况下必须参与肽键的形成，特别是在活化羧基官能团之后。
还可以借助于由Merrifield所描述的技术。
根据Merrifield方法，为了制备肽链，借助于非常多孔的聚合树脂，链的第一C端氨基酸被固定在所述树脂上。这种氨基酸通过它的羧基被固定在树脂上并且它的胺官能团受到保护。这样将要形成所述肽链的氨基酸被一个接一个地固定在已形成并连在树脂上的肽链部分的氨基上，所述氨基每次都事先被脱保护。当已经形成整个的所述希望肽链时，将形成肽链的不同氨基酸的保护基团清除，并在酸的帮助下将所述肽从所述树脂中分离。
本发明另外涉及杂合多肽，所述杂合多肽具有根据本发明的至少一种多肽和能够在人或动物中诱导免疫反应的多肽的序列。
有利地，所述抗原决定簇是这样的：它能够诱导体液反应和/或细胞反应。
对于这样的决定簇来说，包括糖基化、聚乙二醇化、和/或其他方式的翻译后修饰的形式的根据本发明的多肽将是可能的，使用所述多肽目的在于获得能够诱导直接针对多个表位的抗体的合成的免疫原性组合物。
这些杂合分子可以部分地被形成根据本发明的多肽载体分子或其片段，所述分子或其片段与可能的免疫原性部分特别是白喉毒素、破伤风毒素、乙型肝炎病毒的表面抗原(专利FR 7921811)、脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或者任何其他病毒或细菌的毒素或抗原的表位有关。
用于合成杂合分子的方法包括在基因工程中用于构建编码对所寻找的多肽序列的杂合核苷酸序列的方法。例如，有利地引用由Minton在1984年描述的用于获得编码融合蛋白的基因的技术是可能的。
编码杂合多肽和根据本发明的杂合多肽的所述杂合核苷酸序列特征在于它们是通过表达所述杂合核苷酸序列而获得的重组多肽，它们同样是本发明的一部分。
本发明同样包括载体，其特征在于它们包含所述杂合核苷酸序列之一。由所述载体转化的宿主细胞、包含所述转化的细胞之一的转基因生物以及使用所述载体、所述转化的细胞和/或所述转基因生物来制备重组多肽的方法同样是本发明的一部分。
根据本发明的多肽、以下所述的根据本发明的抗体以及根据本发明的核苷酸序列，可以有利地在用于在能够包含酸热脂环酸杆菌的样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法中采用。按照根据本发明的多肽、抗体以及核苷酸序列的特异性，将使用的这些方法具体能够检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌。
根据本发明的多肽可有利地被用于在能够包含酸热脂环酸杆菌的样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)将这份样品与根据本发明的多肽或其片段之一相接触(在允许所述多肽与可能存在于所述生物样品中的抗体之间的免疫反应的条件下)；b)显示可能形成的抗原抗体复合物。
任何常规方法可被用来对可能形成的抗原抗体复合物进行检测。
通过举例的方式，优选的方法带来作用为根据通过免疫荧光的ELISA技术的免疫酶促方法或放射免疫方法(RIA)或其等同方法。
因此，本发明同样涉及根据本发明的、借助充分的标记如酶促、荧光的或放射性的类型标记的多肽。
此类方法包括例如以下步骤：将根据本发明的确定量的多肽组合物放在微滴定板的孔中，向所述孔中加入递增稀释度的血清或不同于之前所定义的必须被分析的生物样品，孵育微滴定板，向微滴定板的孔中加入直接针对猪免疫球蛋白标记了的抗体，这些抗体已借助酶进行了标记，所述酶选自能够水解底物改变底物至少在确定的波长例如在550nm发光的吸收的酶，通过与对照试验进行比较来检测水解的底物的量。
根据本发明的多肽允许制备单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体的特征在于它们特异性地识别根据本发明的多肽。有利的是，根据由Kohler和Milstein在1975年描述的技术从杂交瘤制备所述单克隆抗体是可能的。例如，通过用与所述免疫反应的佐剂相关联的、根据本发明的多肽或DNA免疫动物特别是小鼠，然后在已事先固定了用作抗原的多肽的亲和柱上纯化包含在免疫了的动物血清中特异性抗体来制备所述单克隆抗体是可能的。根据本发明的多克隆抗体也可以通过在已事先固定了用作抗原的多肽的亲和柱上纯化包含在动物血清中的抗体来制备，所述动物通过免疫的方式受到酸热脂环酸杆菌或者根据本发明的多肽或片段攻击。
本发明同样涉及单克隆或多克隆抗体或者它们的片段、或者嵌合抗体，其特征在于它们能够特异性识别根据本发明的多肽。
对于本发明的抗体来说，用与之前对本发明的核酸探针所述相同的方式如酶的、荧光的或放射性类型的标记来标记它们同样是可能的。
本发明另外涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)将所述样品与根据本发明的单克隆或多克隆抗体相接触(在允许所述抗体与可能存在于所述生物样品中的酸热脂环酸杆菌的多肽之间免疫反应的条件下)；b)显示可能形成的抗原抗体复合物。
本发明同样涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在于它采用根据本发明的核苷酸序列。
更具体而言，本发明涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)如果需要的话，从待分析的样品中分离DNA；b)借助根据本发明的至少一种引物或一对引物特异性扩增所述样品的DNA；c)显示扩增产物。
例如，这些可以利用根据本发明的核酸探针通过分子杂交技术来检测。这种探针将有利地用非放射性元素(冷探针)或放射性同位素标记。
出于本发明的目的，“生物样品的DNA”或“包含在生物样品中的DNA”将被理解为表示在所考虑的生物样品中存在的DNA或可能在逆转录酶类型的酶对所述生物样品中存在的RNA作用后所获得的cDNA。
本发明的另外的实施方案包括一种方法，其特征在于它包括以下步骤：a)将根据本发明的核苷酸探针与生物样品相接触，如果需要，包含在所述生物样品中的DNA在允许所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下之前已变得容易杂交；b)显示在所述核苷酸探针与所述生物样品的DNA之间所形成的杂交体。
本发明还涉及根据本发明的一种方法，其特征在于它包括以下步骤：a)将固定在根据本发明的支持体上的核苷酸探针与生物样品相接触，如果需要所述样品的DNA在允许所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下之前已变得容易杂交；b)将在支持体上固定的所述核苷酸探针与包含在生物样品的DNA之间所形成的杂交体，如果需要在将没有与所述探针杂交的所述生物样品的DNA清除后，与根据本发明的标记了的核苷酸探针相接触；c)显示在步骤b)中所形成的新的杂交体。
根据之前所定义的检测和/或鉴定的方法的有利的实施方案，其特征在于，在步骤a)之前，首先借助根据本发明的至少一种引物扩增所述生物样品中的DNA。
方法的实施方案包括用第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，所述第二多肽选自由对SEQ ID No.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
方法的另外的实施方案包括调节蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征和/或第一多肽的分泌的方法，所述方法包括通过第二多肽来糖基化或翻译后修饰所述第一多肽，所述第二多肽选自由对SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
方法的另外的实施方案包括将产生或编码一种重组的、纯化的、和/或分离的核苷酸序列的细胞和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽放在包括等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95摄氏度的温度和/或等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0的pH的环境中，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID No：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列中的至少一个具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；所述多肽选自由对SEQ IDNo.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的序列中的至少一个具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
本发明提供了已被遗传处理具有改变的产生表达蛋白的能力的细胞。特别的，本发明与革兰氏阳性微生物相关，例如具有感兴趣蛋白的提高表达的杆菌种类，其中一种或多种染色体基因被失活，和/或其中一种或多种染色体基因已经从所述杆菌染色体中删除。在另外一些实施方案中，一种或多种天然的染色体区域已经从相应的野生型杆菌宿主染色体中删除。在另外的实施方案中，所述杆菌是脂环酸杆菌属的某个种或者是酸热脂环酸杆菌。
在另外的实施方案中，在等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度和/或在等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH时糖基化和/或翻译后修饰一种多肽的方法，是通过一种重组的、纯化的、和/或分离的核苷酸序列和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽实施的，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列的至少一个具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，所述多肽选自由对SEQ ID No.1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的序列中的一个具有至少90％的序列同一性的多肽所组成的组。
在本发明的实施方案中，根据本发明的任何一种分离的和/或纯化的多肽在等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度下可以具有酶活性或功能活性，和/或在等于或低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH下可以具有酶活性或功能活性。在本发明的其他实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或其他的翻译后修饰可能为根据本发明的分离的和/或纯化的多肽所需要，所述多肽在等于或低于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH、或者在等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度具有酶活性或功能活性。
在以下用作说明的实施例中对本发明进行了另外详细的描述。尽管所述实施例可能仅代表本发明的选择的实施方案，但应该理解以下实施例是用作说明的而非限制。
实施例
实施例1：使用来自酸热脂环酸杆菌的核苷酸和氨基酸序列的糖基化
在SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310中提供了从酸热脂环酸杆菌中分离的并且分别编码SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的多肽的核苷酸序列。使用本领域中的标准技术将SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的核苷酸序列放到表达载体中。然后将所述载体提供给细胞，如细菌细胞或真核细胞例如Sf9细胞或CHO细胞。结合存在于细胞中的正常构件，包含SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的所述载体产生了SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的多肽。然后分离和/或纯化SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的多肽。于是SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的分离的和/或纯化的多肽各自表现出具有表1提供的一种或多种活性。
SEQ ID No：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309的分离的和/或纯化的多肽与其他蛋白或细胞组分联合显示出具有使其他蛋白糖基化的活性。
实施例2：使用来自酸热脂环酸杆菌的核酸和氨基酸序列调节蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征，和/或第一多肽的分泌
通过糖基化或其他翻译后修饰，实施例1的多肽和核苷酸序列用于翻译后修饰一种或多种其他蛋白。与具有相同或相似的氨基酸序列的未经修饰的蛋白对比，所述修饰的蛋白显示具有改变的蛋白稳定性、溶解性、降解性、活性特征、和/或分泌。
实施例3：酸热脂环酸杆菌的糖基化蛋白
多肽RAAC02676(SEQ ID NO：307)是通过以下的方案获得的。在小麦***木聚糖上培养酸热脂环酸杆菌并且在三天之后收集。将培养物离心以去除细胞并且用0.22微米的滤器过滤所得的上清液以去除任何残留的碎片。通过10,000道尔顿分子量截留膜的超滤作用将经过过滤的上清液浓缩到大约1mL。将所得的浓缩的过滤上清液通过以下另外纯化：将蛋白捕获在阳离子交换柱上，用盐梯度洗脱它们，重新加载到第二个阳离子交换柱上并且用第二种盐梯度洗脱它们。将样品汇集并且在12％SDS-PAGE的凝胶上进行电泳。将单独的条带从凝胶上切下来并且使其经历凝胶内胰蛋白酶消化。然后将所述肽片段洗脱，并且在C-18柱子上分离，并通过电喷射注射进入离子阱质谱仪。通过MASCOT运行质谱，它将观测到的谱线与从已知蛋白序列产生的理论谱线相比较。MASCOT允许使用者指明可能存在于蛋白上的特定修饰，并且找出与这些修饰一致的谱线。MASCOT鉴别出许多从RAAC02676消化的肽，如以下表2提供的，所述肽可能被糖基化。
如在表2中可见，查询号94、96、221、332、333、337和400返回RAAC02676上预期的糖基化。表2中的所有片段是SEQ ID NO：307(RAAC02676)的片段。在SEQ ID NO：308中提供了根据确定的位点的RAAC02676的糖基化形式。
表2
Figure BPA00001207041700311
Figure BPA00001207041700321
Figure BPA00001207041700331
实施例4：来自酸热脂环酸杆菌的蛋白的糖蛋白染色
在小麦***木聚糖上培养酸热脂环酸杆菌并且三天后收集。将培养物离心去除细胞，并且用0.22微米的滤膜过滤所得的上清液以去除任何残留的碎片。通过10,000道尔顿分子量截留膜的超滤作用将经过过滤的上清液浓缩到大约1mL。使用标准方案，将这种浓缩材料的几条泳道与已知是糖基化的和未糖基化的蛋白的阳性和阴性对照一起在12％SDS-PAGE的凝胶上电泳。所述凝胶被纵向地切成两半，其中一半使用Simply Blue Safe Stain染色，而另一半使用来自Sigma的糖蛋白检测试剂盒。阳性和阴性对照都用Simply Blue染料染色，只有阳性对照用糖蛋白染料染色，用以显示所述染色方案正确地工作。在Simply Blue染色的胶上，所述酸热脂环酸杆菌蛋白的泳道揭示在大约120千道尔顿的一条带，这是酸热脂环酸杆菌的一种细胞外蛋白的预期分子量。在糖蛋白染色的胶上的所述相同位置显示粉红色的条带，指示对于糖基化蛋白的阳性结果。
当已经在某些实施方案中描述本发明时，在本公开的精神和范围内可以进一步修改本发明。因此，本申请旨在覆盖使用其一般原理的本发明的任何变化、使用或改编。此外，本申请旨在覆盖对本公开的背离当出现在本发明所属领域中已知的或习惯性的实践之内时，这些背离落在所附权利要求书及其法律等同物的限制之内。
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Claims (38)

1.一种分离的或纯化的核酸序列，包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽对SEQ ID No.1具有至少90％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或低于大约pH 8时具有酶活性。
3.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或高于大约35摄氏度的温度具有酶活性。
4.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述核酸序列存在于载体中。
5.一种分离的或纯化的多肽，包括对SEQ ID No.1具有至少90％的序列同一性的多肽。
6.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或低于大约pH 8时具有酶活性。
7.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或高于大约35摄氏度的温度具有酶活性。
8.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
9.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽具有糖基转移酶活性。
10.一种在等于或高于大约35摄氏度的温度或者在等于或低于约8的pH时糖基化或翻译后修饰第一多肽的方法，所述方法包括：
提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括对SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；
用所述的重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或低于大约pH 8。
12.根据权利要求10所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或高于大约35摄氏度的温度。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有糖基转移酶活性。
15.一种调节所述蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、或第一多肽的分泌的方法，所述方法包括：
提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括对SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；
用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或低于大约pH 8。
17.根据权利要求15所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或高于大约35摄氏度的温度。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有糖基转移酶活性。
20.一种分离或纯化的核酸序列，包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽选自由对SEQ ID No 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％序列同一性的多肽所组成的组。
21.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或低于大约pH 8时具有酶活性。
22.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或高于大约35摄氏度的温度具有酶活性。
23.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述核酸序列存在于载体中。
24.一种分离的或纯化的多肽，包括选自由以下组成的组的多肽：对SEQ ID NO：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和309具有至少90％序列同一性的多肽。
25.如权利要求24所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或低于大约pH 8时具有酶活性。
26.如权利要求24所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或高于大约35摄氏度的温度具有酶活性。
27.如权利要求24所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
28.如权利要求24所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽具有选自由UDP β-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组的活性。
29.在等于或高于大约35摄氏度的温度或者在等于或低于大约8的pH时糖基化或翻译后修饰第一多肽的一种方法，所述方法包括：
提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列中的至少一个具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；
用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
30.根据权利要求29所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或低于大约pH 8。
31.根据权利要求29所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或高于大约35摄氏度的温度。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有选自由UDP β-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组的活性。
34.一种调节所述蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、或第一多肽的分泌的方法，所述方法包括：
提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列：对SEQ ID NO：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291和310的序列中的至少一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；
用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或低于大约pH 8。
36.根据权利要求34所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于或高于大约35摄氏度的温度。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有选自由UDP β-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组的活性。
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