CN102037965A - 壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用。本发明壳聚糖制剂能显著降低水稻条斑病的发生率和病斑的大小，且能显著提高水稻幼苗中苯丙氨酸解氨酶，过氧化物酶和多酚氧化酶的活性，从而增强水稻的抗病能力。采用本发明壳聚糖制剂防治水稻细菌性条斑病简单易行，成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护技术的生物防治领域，尤其涉及壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用。
背景技术
细条病亦是水稻上一种重要的细菌性病害，1918年由菲律宾首次报道并被误以为水稻细菌性条纹病(Bacterail stripe of rice)长达数年。水稻细菌性条斑病最初以Xanthomonas translucents f.sp.oryzea，误将其认为白叶枯病。其后，Goto对此病菌和稻谷类黑颖病菌的几个变种作了比较研究后提出用Xanthomonas translucents f.sp.oryzea代替Xanthomonas oryzicola.随后，Bradbury(1971)又将其修正为Xanthomonas translucents f.sp.oryzicola.最终，Dye重新命名为Xanthomonas camperstris pv.oryzicola。1990年Swing等根据病原的表型、基因型、化学分类资料重新承认水稻黄单胞菌这个种(Xanthomonas oryzae)，该种包括了分别引起白叶枯病和细条病黄单胞杆菌白叶枯致病型(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和细菌性条斑病致病型(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)2个变种。至此该菌的地位才得以稳固。
目前是我国继稻瘟病、纹枯病和白叶枯病后的第四大水稻病害，也是我国水稻上唯一的检疫性病害。由于近年来感病的杂交水稻面积推广和稻种的南繁、调运，致使此病迅速蔓延，病区不断扩大，常年发生面积在460万公顷以上。现已成为水稻特别是籼稻上的重大病害。由于缺乏优良的抗病品种，该病在我国湖南、广东、广西和海南等地的危害已经超过水稻白叶枯病。到目前为止，还没有发现有效的化学制剂来防治水稻细菌性条斑病，应用较广的铜制剂对该病害的效果也不好。因此发明新的有效的生化试剂来抵抗这种病害非常有必要。
壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，通常将脱乙酰度大于55％的甲壳素称作壳聚糖，其学名为聚氨基葡萄糖，化学名(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，广泛存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中。
壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用。壳聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及无毒副作用，其分子内含有-OH和-NH2-活性基团，易与多种有机物发生反应，目前广泛应用在工业、农业、医药、化工、环境保护和水处理等领域。
发明内容
本发明提供了一种壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用，解决了现有药剂少、防效差的问题。
壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用。
本发明还提供了壳聚糖在提高水稻抗细菌性条斑病性能、降低水稻细菌性条斑病发病率和病害程度以及抑制水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)生长中的应用。
本发明还提供了一种防治植物细菌条斑病的药剂，该种药剂分别以壳聚糖为主要成份，添加常规的药用赋形剂，如水、乙酸等，制成水剂、粉剂等剂型。
所述的壳聚糖的脱乙酰度优选大于85％，易获得，成本低。
本发明还提供了一种上述药剂的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖粉末溶于体积百分比为1％的乙酸溶液中，然后添加水配制成浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液。NaOH调节pH至6.0，使得壳聚糖溶解，其用量和浓度可以根据需要进行调整。
采用上述壳聚糖溶液不仅在离体条件下能抑制Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)的生长，而且在水稻活体上能有效降低条斑病的发生率和严重程度。
壳聚糖对水稻无毒害作用，而且能显著减少了水稻细菌性条斑病的发病率以及病斑直径，同时还能增强其抗细菌性条斑病的性能。
附图说明
图1为实施例3中不同浓度的壳聚糖溶液对Xoc BLS-01生长的影响；
图2为实施例5中浓度为0.20mg/mL的壳聚糖对水稻病害发生率的影响；
图3为实施例5中浓度为0.20mg/mL的壳聚糖对水稻病斑直径的影响；
具体实施方式
实施例1制备壳聚糖溶液
将脱乙酰度为85％的壳聚糖粉末溶解于体积百分比为1％的乙酸中，配制成浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液，用NaOH调节pH至6.0，在室温下摇24小时，用高压灭菌锅121℃灭菌20分钟，待用。实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。
实施例2离体条件下检测壳聚糖对Xoc BLS-01生长的影响
本实施例的菌株Xoc BLS-01由浙江大学生物技术研究所提供，该菌株为试验材料，其特性对试验结果没有影响。本实施例采用计数法检测壳聚糖对Xoc BLS-01生长的影响，具体方法如下：
Xoc BLS-01在琼脂培养基中，28℃培养48小时，用无菌水制得菌悬液(109CFU/mL)。10倍梯度稀释，吸取各浓度的Xoc菌悬液10μL到平板上，处理后的平板置于28℃温箱培养48小时。实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照，每个处理设六个重复。实验重复两次。
实施例3检测壳聚糖不同浓度时的抑菌活性
在实施例1制得的5mg/mL的壳聚糖溶液里加入无菌的去离子水配制成浓度为0.05，0.10，和0.20mg/mL的壳聚糖溶液。在各处理中接种Xoc菌悬液(108CFU/mL)，160r/min、28℃条件下振荡培养4小时，收集样本按实施例2检测菌体数。实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。
如图1所示，壳聚糖溶液在不同浓度时对Xoc BLS-01表现出显著的抑菌活性，而且随着浓度的增加抑菌活性逐渐增强。与对照相比，壳聚糖溶液在浓度0.05mg/mL时细胞数量下降了1.88Log CFU/mL，在浓度0.10mg/mL时细菌数量下降了2.05Log CFU/mL，然而在0.20mg/mL时细菌数量下降了3.96，因此壳聚糖溶液在0.2mg/mL时抑菌活性最高。
实施例4检测壳聚糖在不同接种时间下的抑菌活性
吸取实施例1制得的5mg/mL的壳聚糖溶液100μL，加入4.9mL无菌去离子水配制浓度为0.20mg/mL的壳聚糖溶液。同实施例3，在各处理中接种Xoc菌悬液(108CFU/mL)，160r/min、28℃条件下振荡培养0，2，4，6，12，24小时后检测Xoc BLS-01的生长情况。实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。
结果显示，作为对照的无菌去离子水中接种Xoc BLS-012小时后细胞数量下降了0.06Log CFU/mL，接下来菌量保持稳定。而处理组壳聚糖溶液中Xoc细菌数量显著下降，在0～12小时内逐渐降低，在24小时内细菌数量比12小时有所增加。与对照相比，接种2小时后，壳聚糖溶液中的细胞数量减少了2.74Log CFU/mL，在接种12小时后，壳聚糖溶液中的细胞数量减少了5.87Log CFU/mL(见表1)。
表1壳聚糖溶液不同接种时间对Xoc BLS-01的抑菌活性
实施例5壳聚糖处理过的水稻幼苗上接种Xoc BLS-01
在温室条件下测定了壳聚糖对水稻条斑病的发生率和严重程度的抑制作用。具体方法如下：
1、将水稻种子播种于盛有稻田土壤的塑料盆(直径8.5cm，高7.5cm)内，每盆10粒种子，每处理重复4次；
2、Xoc菌株BLS-01在营养琼脂液体培养基中过夜培养，并调节浓度至108CFU/mL；
3、5个星期后，用浓度为0.20mg/mL的壳聚糖溶液喷洒到水稻幼苗，每盆喷洒5ml，用等量灭菌蒸馏水喷洒做对照试验；
4、风干后，将上述步骤2的菌液喷洒接种到步骤3中的水稻幼苗上，每盆喷洒5mL；
5、用塑料袋覆盖所有接种过的幼苗24h以保持高湿环境，在生长箱中培养，温度设置为28℃，相对湿度90％，每天光照黑暗交替，光照16h，黑暗8h；
6、接种后7d，观察和记录病害发生率和病斑的平均直径大小，整个试验重复2次。
试验结果表明：在没有喷洒壳聚糖的对照处理中，水稻幼苗在接种条斑病菌5d后表现出病害症状，经壳聚糖处理后，病害症状出现推迟了1d。在对照处理中，水稻幼苗在接种后7d病害发病率达到81.46％，平均病斑直径为29.6mm(见图2和图3)；然而，经壳聚糖处理后，水稻幼苗接种7d后病害发生率减少43.80％，病斑直径减少53.61％(见图2和图3)，与对照相比差异显著。并且经壳聚糖处理后，水稻条斑病的发生率和病斑直径在接种7d后保持稳定。未经接种条斑病病菌的水稻幼苗则不表现病害症状。
实施例6壳聚糖处理对水稻苗酶活性的影响
水稻幼苗酶活性的测定具体方法如下：
1.根据实施例5水稻叶片在接种条斑病菌后的0，12，24，48，72，96，120h后采集，每盆水稻幼苗采集1g叶片(鲜重)，-70℃保存。
2.酶液提取：将1中采集的样品每份称取0.5g水稻叶片，加入3ml磷酸缓冲液(50mmol/L；pH 7.8；含0.2mol/L EDTA，1％PVP)研磨均匀。12000rpm离心20min。取上清用于测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)，过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性。
3.PAL活性的测定：在试管中依次加入0.05mol/L的硼酸缓冲液(pH8.8)1mL，蒸馏水1mL，上述步骤2中的酶液1mL。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液代替。均匀混合，30℃水浴30min后加1mL 6mol/L的HCl终止反应。测290nm波长下的吸光值OD290。以每克鲜重每分钟内的OD改变0.01为一个酶活性单位。
4.POD活性的测定：在试管中依次加入0.05mol/L磷酸缓冲液2.9mL，2％的双氧水1mL，上述步骤2中的酶液1mL，0.05mol/L愈创木酚1mL。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液代替。均匀混合后立即在470nm波长下比色，测定2min。
5.PPO活性的测定：在试管中依次加入0.05mol/L磷酸缓冲液1.5mL，邻苯二酚1.5mL，上述步骤2中的酶液20μL。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液代替。均匀混合，30℃水浴30min后加1mL 6mol/L的HCl终止反应。测420nm波长下的吸光值OD420。以每克鲜重每分钟内的OD改变1为一个酶活性单位。
实验结果显示：经壳聚糖处理过的水稻幼苗，三种酶的活性在接种条斑病菌后的初始阶段与对照没有明显的差别，但是在接种条斑病菌24h后都显著的高于对照，且在48h时达到最高峰，此时，壳聚糖处理过的水稻幼苗PAL，POD和PPO活性分别比对照提高了21.02％，6.74％和19.71％(见表2)。
表2壳聚糖处理对水稻酶活性的影响
由此得出结论：壳聚糖能明显的提高水稻幼苗叶片中PAL，POD和PPO三种酶的活性，从而使水稻对条斑病的抵抗作用增强，达到防治水稻细菌性条斑病的效果。
Claims (4)
1.壳聚糖在防治水稻细菌性条斑病中的应用。
2.壳聚糖在提高水稻抗细菌性条斑病性能中的应用。
3.壳聚糖在降低水稻细菌性条斑病发病率和病害程度中的应用。
4.壳聚糖在抑制水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)生长中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060121055A1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-06-08 | Becton, Dickinson And Company, Inc. | Compositions with enhanced immunogenicity |
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-
2011
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20060121055A1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-06-08 | Becton, Dickinson And Company, Inc. | Compositions with enhanced immunogenicity |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIN LI ET AL.: "Antibacterial activity of two chitosan solutions and their effect on rice bacterial leaf blight and leaf streak", 《PEST MANAGEMENT SCIENCE》 * |
| 马鹏鹏等: "壳聚糖对植物病害的抑制作用研究进展", 《天然产物研究与开发》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111202095A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-05-29 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种用于防治水稻细菌性条斑病的组合物及其制备方法与应用 |
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