CN102021208A - 一种快速积累微藻胞内油脂的方法 - Google Patents
一种快速积累微藻胞内油脂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102021208A CN102021208A CN2010105458713A CN201010545871A CN102021208A CN 102021208 A CN102021208 A CN 102021208A CN 2010105458713 A CN2010105458713 A CN 2010105458713A CN 201010545871 A CN201010545871 A CN 201010545871A CN 102021208 A CN102021208 A CN 102021208A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- grams per
- chlorella
- heterotrophism
- photoinduction
- algae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种快速积累微藻胞内油脂的方法，该方法包括异养培养、稀释、光诱导培养、微藻采收以及油脂提取等步骤。采用本发明方法可充分发挥微藻在光诱导阶段油脂快速积累的优势，为解决生物燃料(如柴油、航空煤油等)规模化制备过程中由于原料不足而导致的成本过高问题提供重要的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于生物能源领域和/或微藻生物技术领域，涉及一种快速积累微藻胞内油脂的方法。
背景技术
微藻能源发展前景广阔、优势独特已获国内外公认。迄今，世界各国在该领域的研发工作还停留在实验研究和中试论证的起步阶段(李元广、谭天伟、黄英明，微藻生物柴油产业化技术中的若干科学问题及其分析，中国基础科学，2009，5，64～70)，但均遇到技术不成熟而导致成本高这一瓶颈，因而微藻能源在全球尚未实现规模化制备。
掌握能源微藻的高效培养模式是实现微藻能源规模化制备的基础。现有生长快的藻种一般油脂含量较低，而含油量高的藻种生长大多比较缓慢。这一矛盾是能源微藻高效培养模式开发的现实障碍。微藻培养包括自养、异养和混合营养三种模式(Yanna Liang，Nicolas Sarkany，Yi Cui.Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic，heterotrophic and mixotrophic growth conditions.Biotechnology Letters，2009，31：1043～1049)。异养培养模式(Han Xu，Xiaoling Miao，Qingyu Wu.High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters.Journal of Biotechnology，2006，126：499～507)存在“不能直接利用太阳能、不能固定CO2、能耗大”等问题，因而难以用于能源微藻的大规模培养。美国1998年的ASP计划工作总结报告指出：相对低成本的开放式光自养培养是最有前景的培养模式(Sheehan J，Dunahay T，Benemann J，et al.A Look Back at the U.S.Department of Energy’s Aquatic Species Program---Biodieselfrom Algae.National Renewable Energy Laboratory，1998)。但是，开放式光自养存在的“培养密度低、易被污染、水分蒸发、受环境因素影响大”等问题，也使其难以满足能源生产的规模需求。
针对开放式光自养培养存在的问题，人们试图采用封闭式光生物反应器进行微藻的光自养培养。封闭式光生物反应器包括管道式、平板式、柱式等(Ogbonna J C，Tanaka H.Industrial-size photobioreactors.Chemical technology，1997，27(7)：43～49)，虽然具有细胞密度高、生长快等优点，但由于成本高、放大技术不成熟等原因，目前尚未应用于微藻的大规模培养。
此外，近年来人们试图采用封闭式光生物反应器和开放池组合进行微藻的光自养培养：即先利用密闭式光生物反应器实现微藻的高密度培养，再利用开放池降低生产成本。该模式基本具备“可利用太阳能、高密度、固定CO2、低成本、高效”的特征，但如何实现全过程的有效控制和***工程优化，还有待深入研究。
学者公认能源微藻培养模式应具备“可利用太阳能、高密度、固定CO2、低成本、高效”的特征，为实现这一目标，研究者先后又探索推出了“混合营养”、“先自养，后异养”等培养模式：
(1)混合营养模式：是指藻细胞利用光和有机物作为能源、再利用有机物和无机物作为碳源的培养方式(Lee YK，Ding SY，Hoe CH，Low CS.Mixotrophic growth of Chlorella sorokiniana in outdoor enclosed photobioreactor.Journal of applied phycology，1996，8：163～169)。在微藻的混合营养培养过程中，微藻的光合自养和化能异养可以同时进行。该模式可以通过与富含碳、氮等有机物废水处理结合而降低生产成本，但其最大问题是大规模培养过程中容易滋生大量杂菌，难以实现微藻的高密度培养。
(2)“先自养，后异养”模式：是先利用密闭式光生物反应器自养以固定CO2，后进行异养培养(Xiong W，Gao C，Yan D，et al.Double CO2 fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production.Bioresource Technology，2010，101：2287～2293)。该模式存在的最大问题是光诱导培养过程放大后无法做到无菌培养(Scott SA，Davey MP，Dennis JS，et al.Biodiesel from algae：challenges and prospects.Current Opinion inBiotechnology，2010，21：1-10)，由于微藻的异养培养要求藻种必须不带任何杂菌，因此该模式无法放大，不具有规模化应用价值。
综合上述几种微藻培养模式的优缺点，本发明设计了一种“异养-稀释-光诱导串联培养”模式，该模式满足了“可利用太阳能、高密度、固定CO2、低成本、高效”的要求。以小球藻为例，其流程如下：首先利用生物反应器异养培养小球藻以获得高密度细胞，待培养液中有机碳源消耗完毕后，用不含有机碳源的培养基稀释藻液，经短时间内(8～24h)的光照诱导，使藻细胞内的油脂快速大量积累。该模式中的异养阶段是在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行，目的是为了在短时间内获得较高密度的细胞；光诱导阶段可在任何可用于微藻光自养培养的***中进行，目的是通过光诱导作用提高胞内油脂的含量；异养阶段与光诱导阶段分开独立进行，异养阶段放出的藻液先用光诱导培养基进行稀释后再转入光诱导培养阶段。过程中需确保进入光诱导阶段的藻液中不含有机碳源，这样可避免光诱导阶段滋生过多的杂菌；而通过稀释作用可以确保光诱导阶段的藻细胞能获得充足的光照，实现胞内油脂含量的快速提高。该模式和上述其他模式相比，具有生产效率高、不存在因不同***的组合而造成的异养培养过程染菌问题(光自养培养过程有杂菌并不影响生长)、所用培养***的组合方式灵活和生产成本低等优点，可充分发挥小球藻在光诱导阶段油脂快速积累的优势，为解决生物柴油规模化制备过程中由于原料不足而导致的成本过高问题提供重要的技术手段。
发明内容
本发明提供了一种快速积累微藻胞内油脂的方法，该方法包括微藻异养培养的步骤，将异养培养所获得的微藻培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
本发明提供一种微藻油脂的生产方法，该方法包括微藻异养的步骤，将微藻的异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。该方法能够实现胞内油脂的快速积累，具有占地面积少、面积产率高、相对微藻光自养而言因细胞密度高而带来的采收成本低(光诱导时的细胞密度较高，一般为2～5g/L)，因而大大提高了生产效率，降低了生产成本。
在一个具体实施方式中，所述的微藻选自：绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides，Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila，Haematococcus pluvialis，Haematococcus lacustris，Scenedesmus obliquus，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele，Tetraselmis verrucosa，Micractinium pusillum；
硅藻门的Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa；
蓝藻门的Anabaena variabilis；
金藻门的Poterioochromonas malhamensis；
甲藻门的Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii；
裸藻门的Euglena gricilis；
红藻门的Galdieria sulphuraria。
在一个具体实施方式中，所述微藻选自绿藻门小球藻属的藻类。尤其是，所述微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides和Chlorella zofingiensis。
在一个具体实施方式中，所述微藻选自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)和椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。
在一个具体实施方式中，所述微藻异养的步骤包括：在生物反应器中加入pH为4.0～10.0的培养基，按工作体积的0.1～30％接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、连续培养或半连续培养，培养温度为10～50℃，控制pH小于10.0，控制溶氧在1％以上。
在一个具体实施方式中，所述藻液稀释包括用培养基将异养获得的藻液稀释至细胞密度为0.1～50克/升，所述培养基不含有机碳源，其pH为4.0～10.0。
在一个具体实施方式中，所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱导装置中进行光诱导，连续光照或间歇光照，培养温度为5～50℃，光照强度为0.1～150klx，光诱导培养周期为1～150小时。
在一个具体实施方式中，异养培养基由氮源、有机碳源以及少量无机盐、微量元素和水组成；光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。
在一个具体实施方式中，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器或薄膜立袋与吊袋光生物反应器等任何可用于微藻光自养培养的装置中进行，光照条件为自然光或人工光照射。
在一个具体实施方式中，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：KNO35～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH2PO4 0.3～0.9克/升、Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升、MgSO4·7H2O 0.2～1.0克/升、CaCl20.05～0.3克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.05克/升；微量元素0.5～4ml，其中微量元素的组成为H3BO3 5～15克/升，ZnSO4·7H2O 5.0～10.0克/升，MnCl2·H2O 1.0～2.0克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.5～1.5克/升，CuSO4·5H2O 1.0～2.0克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.1～0.9克/升；水。在一个具体实施方式中，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升，尿素2～8克/升，KH2PO4 1～2克/升，Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升，MgSO4·7H2O 1～2克/升，CaCl2 0.05～0.1克/升，柠檬酸三钠0.1～2.0克/升，Fe-EDTA溶液0.5～1mL，A5溶液1～5mL；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 20～30克/升和EDTA 20～40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5～4.0克/升，MnCl2·4H2O 1.0～2.0克/升，ZnSO4·7H2O 0.1～0.6克/升，CuSO4·5H2O 5～10克/升，Na2MoO4 0.01～0.05克/升；水。
在一个具体的实施方式中，所述油脂分离提取方法采用有机溶剂提取法。
在另一具体实施例中，所述微藻培养方法还包括提取微藻油脂的步骤。
本申请还提供一种油脂生产方法，该方法包括异养培养微藻的步骤，将异养培养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
本申请的油脂生产方法中使用到的微藻、培养基以及培养条件等如本文上文以及下文具体实施方式部分所详述。
用本发明公开的异养-稀释-光诱导串联技术培养小球藻，首先在密闭式生物反应器中高密度异养培养小球藻，待培养液中有机碳源消耗完毕后，用不含有机碳源的培养基稀释藻液，经短时间内(8～24h)的光照诱导，可使藻细胞内的油脂含量快速大量积累，油脂含量在短时间内(例如8～24小时)比异养阶段的藻细胞提高约一倍(异养阶段胞内油脂含量一般不超过10％，经光诱导后可达20～30％)。
附图简述
图1显示在50L生物反应器/3L平板式光生物反应器串联***中采用异养-稀释-光诱导串联培养蛋白核小球藻快速积累油脂的结果(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图2显示5T发酵罐串联至户外30L平板和60L大盆连续培养普通小球藻光诱导阶段户外自然光强和自然温度的变化曲线。
图3显示5T发酵罐串联至户外30L平板培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图4显示5T发酵罐串联至户外60L大盆培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图5显示5T发酵罐串联至户外20m2跑道池和3.14m2圆池连续培养普通小球藻光诱导阶段户外自然光强和自然温度的变化曲线。
图6显示5T发酵罐串联至户外20m2跑道池培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图7显示5T发酵罐串联至户外3.14m2圆池培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图8显示500mL摇瓶/3L圆柱式光反应器串联培养椭圆小球藻胞内主要生化成分的变化曲线。
具体实施方案
适用于本申请的微藻包括但不限于绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides，Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila，Haematococcus pluvialis，Haematococcus lacustris，Scenedesmus obliquus，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele，Tetraselmis verrucosa，Micractinium pusillum；
硅藻门的Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa；
蓝藻门的Anabaena variabilis；
金藻门的Poterioochromonas malhamensis；
甲藻门的Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii；
裸藻门的Euglena gricilis；
红藻门的Galdieria sulphuraria。
在优选的实施方式中，本发明采用绿藻门小球藻属的藻类来生产油脂。在更优选的实施方式中，本发明采用蛋白核小球藻、普通小球藻或椭圆小球藻来生产油脂。
1.微藻在生物反应器中的高密度异养培养
此步骤的目的是为了快速获得大量藻细胞，以供光诱导阶段快速合成积累各种活性成分，尤其包括油脂、色素、蛋白质、多糖等。
可采用本领域熟知的各种培养基来进行微藻异养培养。通常，异养培养基含有氮源、有机碳源、少量无机盐、微量元素和水。适用于微藻培养的氮源、有机碳源、无机盐、微量元素等是本领域周知的。例如，作为氮源，可使用的有尿素或各种硝酸盐，如KNO3等；作为有机碳源，可使用的有例如葡萄糖等。
这类培养基包括HA-SK培养基(中国专利ZL 200610024004.9)、Endo培养基(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic：autotrophic cultivation-an efficient method of producing Chlorella biomass for health foodand animal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366)等。
本发明所用的HA-SK培养基是基本上由KNO3、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自H3BO3，ZnSO4·7H2O，MnCl2·H2O，(NH4)6Mo7O24·4H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O中的一种或多种或全部。
本文所用的术语“基本上由……组成”表示本发明的组合物中除了含有主要组分KNO3、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时活性物质含量与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。本文所用的术语“由……组成”表示本发明的组合物由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是可以带有含量在通常范围内的杂质。
在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还可加入少量无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和磷酸盐等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。
在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H3BO3，ZnSO4·7H2O，MnCl2·H2O，(NH4)6Mo7O24·4H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O中的一种或多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。
本发明所采用的HA-SK培养基基本上由以下成分组成：KNO3 5～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH2PO4 0.3～0.9克/升、Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升、MgSO4·7H2O 0.2～1.0克/升、CaCl2 0.05～0.3克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.05克/升；微量元素0.5～4ml，其中微量元素的组成为H3BO35～15克/升，ZnSO4·7H2O 5.0～10.0克/升，MnCl2·H2O 1.0～2.0克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.5～1.5克/升，CuSO4·5H2O 1.0～2.0克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.1～0.9克/升；水。
在一个较佳的实施方案中，本发明的HA-SK培养基组合物宜由以下成分组成：KNO3 7克/升、葡萄糖40克/升、KH2PO4 0.6克/升、Na2HPO4·12H2O 2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.8克/升、CaCl2 0.2克/升、FeSO4·7H2O 0.03克/升；微量元素1.5mL，其中微量元素的组成为H3BO3 11～12克/升，ZnSO4·7H2O 8.5～9.5克/升，MnCl2·H2O 1.4～1.5克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8～0.9克/升，CuSO4·5H2O 1.5～1.6克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.45～0.55克/升；水1000mL。
本发明所用的Endo培养基基本上由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升，尿素2～8克/升，KH2PO4 1～2克/升，Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升，MgSO4·7H2O1～2克/升，CaCl2 0.05～0.1克/升，柠檬酸三钠0.1～2.0克/升，Fe-EDTA溶液0.5～1mL，A5溶液1～5mL；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 20～30克/升和EDTA 20～40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5～4.0克/升，MnCl2·4H2O 1.0～2.0克/升，ZnSO4·7H2O 0.1～0.6克/升，CuSO4·5H2O 5～10克/升，Na2MoO4 0.01～0.05克/升；水。
在一个较佳的实施方案中，所述Endo培养基由以下成分组成：葡萄糖40克/升，尿素6.0克/升，KH2PO4 1.5克/升，Na2HPO4·12H2O 5.0克/升，MgSO4·7H2O1.8克/升，CaCl2 0.05克/升，柠檬酸三钠0.4克/升，Fe-EDTA溶液0.8mL，A5溶液2.0mL，其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 25克/升和EDTA 33.5克/升，A5溶液配方为H3BO3 2.86克/升，MnCl2·4H2O 1.81克/升，ZnSO4·7H2O0.222克/升，CuSO4·5H2O 0.07克/升，Na2MoO4 0.021克/升；水。
在根据上述配方配制培养基后，可用常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为4.0～9.0，并在115～120℃下高压灭菌15～20分钟。可采用分批培养、补料分批培养、半连续培养(带放)或连续培养等四种方式实施异养培养。
当进行异养培养时，将相应配制好的培养基加入到生物反应器中，补加水至工作体积，通常装料系数为0.6～0.8，然后蒸汽灭菌(121℃，维持约20分钟)，当温度降至30～35℃时，按工作体积的1～15％接入微藻开始异养培养。
无论采用何种培养方式，在培养过程中，须控制适合的培养条件使微藻正常生长。通常，控制温度为20～35℃，例如28～30℃，溶氧不低于5％的空气饱和浓度，pH不高于9.0。在优选的实施例中，溶氧不低于10％的空气饱和浓度，pH不高于8.5。在其它优选的实施例中，溶氧不低于15％的空气饱和浓度，pH不高于8。
在培养过程中，pH不宜过高或过低，一般随着培养的进行，pH会慢慢上升(对于普通小球藻此现象特别明显)，pH过高会对藻细胞生长产生不利影响，所以应用酸(例如10％的硫酸)进行调节，使pH不高于9.0，较佳的pH应为6.5～7.5。
无论采用何种异养培养方式，转入光诱导的藻液，在更佳的方案中应使藻液中有机碳源例如葡萄糖含量为零或接近于零。
异养可以在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行。
2.高浓度藻液的稀释
此步骤的目的是为了使转入光诱导培养的小球藻高效地吸收光能，提高光能利用效率，同时降低藻细胞的死亡率。因为光强在藻液中呈“时、空、非线性”衰减，所以在高细胞密度下，反应器中藻细胞大部分处于暗区，几乎接受不到光照，这样藻细胞很容易死亡而且会影响光诱导的效率。
异养培养获得的高密度藻液应进行稀释操作，用水和不含有机碳源的培养基对高密度的藻液进行稀释，使细胞密度维持在0.1～10克/升，调节pH至5.0～8.0。在其它实施例中，稀释藻液，使细胞密度维持在1～8克/升。在优选的实施例中，使细胞密度维持在1.0～5.0克/升。在其它实施例中，使细胞密度维持在2～5克/升或者2～4克/升。稀释的藻液的pH可以调节为5.5～7.5，例如6.0～7.5等。
可采用各种已知的稀释培养基来稀释藻液。通常，可使用光诱导培养基进行稀释。光诱导培养基通常含有氮源、无机盐和水，相对于异养培养基不含有有机碳源。在优选的实施方案中，所述培养基的氮源浓度为0.1～10克/升，较佳为0.3～6克/升，更佳为0.5～5克/升。所述氮源可以与异养培养步骤中所用的氮源相同或不同。
在一个优选的具体方案中，异养培养获得的高密度藻细胞宜用氮源浓度为0.1～10克/升而不含有机碳源的初始培养基(例如，培养普通小球藻时采用不含葡萄糖的HA-SK培养基，培养蛋白核小球藻时采用不含葡萄糖的Endo培养基)进行适当稀释。
稀释采用的培养基无需高压灭菌，配制好后调节pH至5.0～8.0即可使用。
在具体实施方式中，对普通小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组成：KNO3 0.1～5克/升、MgSO4·7H2O、0.5～5.0克/升、CaCl2 0.01～0.06克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.06克/升、EDTA 0.020～0.052克/升。
对蛋白核小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组成：尿素0.1～5.0克/升、MgSO4·7H2O、0.5～5.0克/升、CaCl2 0.01～0.06克/升、FeSO4·7H2O0.01～0.06、EDTA 0.020～0.052克/升、柠檬酸钠0.02～0.5克/升。
3.光诱导培养
该步骤的目的是让微藻接受光照，通过光诱导使藻细胞快速大量合成积累各种活性成分。
如上所述高密度微藻培养液经稀释后，将所得稀释液转入光诱导装置中进行光诱导培养。添加的光诱导培养基如上文所述，温度控制在5～50℃，光照强度为0.11～150klx，连续光照或间歇光照，光诱导培养周期为1～150小时，通气量为0.1～2.0vvm。其中所述的光生物反应器包括所有的封闭式光生物反应器(摇瓶、管道式、平板式、柱式、薄膜立袋与吊袋等)和所有的开放式光生物反应器(跑道池、圆池和鼓泡式大盆等)。
通常，培养温度可控制在15～35℃的范围内，例如18～35℃、20～35℃、20～30℃等。通常，光照强度为1～70klx，例如，1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10klx等，可视具体生产情况而定。通常，通气量可控制为0.15～2.0vvm，例如，0.2～1.8、0.5～1.5、0.8～1.5、1.0～1.5vvm等。在其它实施方式中，培养温度控制在10～50℃，光照强度为1～10klx，通气量为0.05～2.0vvm。
在其它实施例中，光诱导培养周期为8～100小时，例如，根据实际的天气情况，光诱导培养周期可以为8～90小时、8～80小时、8～60小时、8～48小时、8～24小时不等；或者，光诱导培养周期可以为12～72小时、12～60小时、12～48小时、12～36小时、12～24小时不等或24～60小时、24～48小时不等。
在本申请中，“光诱导培养周期”包括了整个光诱导培养过程，例如，户外培养时光诱导培养周期包括夜晚没有光照的时间。
在本申请中，“光照时间”指使用本申请所述光照强度对微藻实施光诱导培养的时间，即该时间不包括夜晚没有光照的时间。在一些实施例中，光诱导培养步骤的光照时间为8～48小时，例如8～36小时、8～24小时、8～18小时、8～12小时、12～36小时、12～24小时不等，以及上述范围内的任意时长。
因此，本申请的光诱导培养步骤也包括光照时间为8～48小时范围内的光诱导培养步骤。可采用人工光照的方式进行光诱导培养，也可在户外利用自然光照的方式进行光诱导培养。
在光诱导过程中，当油脂含量达到最高值(不同微藻油脂含量达到的最大值不一样，可通过测定光诱导过程中胞内油脂含量曲线判断，小球藻一般为20～30％左右)时可结束光诱导培养，收获藻细胞进行后续的油脂的分离提取。
4.藻细胞采收、油脂的提取及藻体综合利用
光诱导培养结束后，对小球藻进行离心采收，获得湿藻体。藻细胞的采收方法包括但不限于高速离心、絮凝，气浮或过滤等技术；藻细胞破壁方法包括但不限于藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解等湿法破壁方法。
胞内油脂的提取测定方法包括但不限于有机溶剂萃取法，即：将藻体于80～105℃下干燥至恒重，研磨藻粉后采用氯仿甲醇标准萃取溶剂从干藻粉中提取油脂，萃取溶剂反复提取直至藻粉颜色变为白色，旋转蒸发去除溶剂。
上清液中的其他成分可逐步分离提取获得脂肪酸、叶绿素等，或直接将上清液中的所有成分与藻体沉淀混合喷雾干燥获得小球藻粉。
本发明中，可对培养所得的微藻进行综合利用，提取其中的色素、蛋白质、多糖等各种活性成分。活性成分的提取顺序并无特殊限制，但通常要满足先提取的步骤不能导致后提取的成分损失这一前提。
本文中涉及到藻细胞干重、油脂含量及胞内生化成分的测定方法如下：
藻细胞干重测定：在微藻(如小球藻)培养过程中取培养液V毫升，8000rpm离心10分钟，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(W1(克))中，在105℃烘箱中烘干至恒重W2(克)。藻体干重Cx可根据下式计算：Cx(克/升)＝(W2-W1)/V/1000。
油脂测定：取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞，在研钵中研磨至粉末状，称取适量藻粉(0.2～0.5g)小心转移至离心管中，加入适量萃取溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)于超声振荡器中超声振荡30min，8000rpm离心10min，将上清转移至已知重量的干燥旋转蒸发瓶中，重复上述步骤直至上清无色。合并上清后旋转蒸干，称重并计算油脂含量。
油脂含量(％)按下式计算：
油脂(％)＝(W2-W0)/W1×100
式中：W1——为藻粉重量，g；W0——为烘干至恒重的旋转蒸发瓶重量，g；W2——为油脂萃取液蒸干后蒸发瓶的重量，g。
碳水化合物的测定：参照药典2005版，选择蒽酮-硫酸显色反应，采用无水葡萄糖作为对照品，用比色法在625nm处测定。
蛋白质含量测定：微藻(如小球藻)细胞中总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(宁正祥.食品成分分析手册.北京：中国轻工业出版社，1998，76-78)。
叶绿体色素含量测定：微藻(如小球藻)叶绿体色素含量测定采用Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正后的方法(Lichtenthaler HK，Wellburn AR.Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts indifferent sovents.Biochemical Society Transactions，1983，11：591～592)。
灰分测定：微藻(如小球藻)灰分采用550℃灼烧至恒重测量，即国标GB6438-86法。
与现有的能源微藻培养积累油脂的方法相比，本发明的方法具有以下优点：可在短时间内获得高密度的微藻细胞，同时可在短时间内使微藻细胞内的油脂含量快速提高。本发明将微藻培养合成油脂分成藻细胞生长和油脂合成积累两个阶段，即异养培养和光诱导培养阶段。异养培养微藻的目的是为了快速获得大量的藻细胞，而光诱导培养的目的是为了诱导微藻细胞快速合成积累大量的油脂，采用异养-稀释-光诱导串联培养方式培养微藻提高了油脂的产率，一定程度上解决了能源微藻细胞生长和油脂合成不同时进行的矛盾，大大降低了成本，为解决生物燃料规模化制备过程中由于原料不足而导致的成本过高问题提供新的技术手段。
此外，本申请之前，本领域的普遍认识是只有通过光自养的模式才能够利用微藻来大规模生产油脂。然而，光自养培养与本发明的光诱导培养完全不同。光自养培养中，培养基不含有有机碳源，微藻利用大气中的CO2、水、光、和少量无机营养盐进行光合自养，维持自身的生长，一般接种密度较低(0.1g/L左右)，生长慢(有时候为了促进生长，还需要在培养过程中人工通入CO2)，培养周期长(一般要一周以上，户外光自养培养细胞密度难以达到较高水平)，尤其在大规模培养的时候，为了提供大规模培养所需的接种藻液，种子扩培需要的时间很长(一般需要1-2个月)，生产效率很低。而本申请的光诱导所用的培养基和光自养的培养基不一样，由于异养阶段藻液中含有丰富的无机盐和微量元素等营养成分，所以经过稀释后，所需的光诱导培养基比光自养培养基要简单很多，例如和文献上常见的微藻光自养培养基BG-11相比，稀释用的光诱导培养基中不需要添加磷酸盐、碳酸钠、柠檬酸铁铵以及微量元素，同时添加的硝酸盐用量也比光自养培养基用量要少很多。通过异养阶段的培养，可以在短时间内积累大量藻细胞，规模化培养时，通过稀释后，进入光诱导的藻细胞密度(以小球藻为例，密度范围在2～5g/L左右)比光自养培养方式的接种密度要高20倍以上，很好的解决了光自养培养方式接种密度低，种子扩培周期长等缺点，同时在较短时间的光照诱导周期内(一般8～24小时)，藻细胞密度几乎维持不变(即它已经不再生长)，胞内油脂含量却能够快速积累，含量成倍增长(由10％增加到20～30％左右)，这样相对光自养而言，占地面积大大缩小，面积产率大幅提高，整个培养周期明显缩短，采收成本降低，生产效率大大提高。
以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。除非另有所述，本发明采用的培养基中各组分含量均用克/升(g/L)表示。应理解，本申请中“含有”、“包含”也包括“由……组成”、“由……构成”的含义。
实施例1
在50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水至25L后灭菌，当温度降至30℃时按工作体积的12％接入蛋白核小球藻，开始异养培养。
异养培养条件：温度为30℃，初始转速为150r/min，空气流量为1vvm，pH小于8.0，培养过程中通过调节转速控制溶氧15％以上。
将异养培养过程中葡萄糖耗完的高密度藻液稀释到2.70g/L左右，并加入下述光诱导培养基，转入3L平板式光反应器中进行光诱导培养，温度30℃，光强8000lx，空气流量为1vvm。光诱导培养12h，细胞密度从2.70g/L降低到2.65g/L，油脂含量从9.70％上升至19.70％(见图1)。
异养培养基：
葡萄糖60.0克 尿素8.0克 MgSO4·7H2O 2.0克
KH2PO4 1.1克 Na2HPO4·12H2O 9.0克 CaCl2 0.02克
柠檬酸三钠1.8克
Fe-EDTA溶液1.0ml 微量元素溶液4.5ml 水1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 15克/升和EDTA1.4克/升，微量元素溶液配方为H3BO3 2.11克/升，MnCl2·4H2O 0.81克/升，ZnSO4·7H2O 0.11克/升，CuSO4·5H2O 10.0克/升，Na2MoO4 0.05克/升。
光诱导培养基：
尿素0.5克 MgSO4·7H2O 1.0克 柠檬酸三钠0.05克
CaCl2 0.01克 Fe-EDTA溶液0.4ml 水1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为15克/升和EDTA1.4克/升。
实施例2
在5T发酵罐中加入异养培养基和自来水至2.5T后灭菌，当温度降至30℃时，以500L发酵罐作为种子罐培养的普通小球藻，培养过程中根据细胞生长情况、发酵液中溶氧水平来调节罐压、通气量和搅拌转速，维持培养液中充足的氧含量，确保藻细胞的快速生长。
将前期补料分批异养培养过程中葡萄糖耗完的高密度藻液经光诱导培养基稀释后，转至30L平板式光反应器及60L鼓泡式大盆中在户外进行光诱导培养。光诱导培养条件：自然温度，温度在13～30℃，自然光照，光强在0～36klx(见图2)，空气流量为1vvm。光诱导培养8h后，30L平板式反应器中藻细胞密度从1.60g/L降低到1.46g/L，油脂含量从7.87％上升至13.27％，后进入夜晚，整个晚上藻细胞密度从1.46g/L降低至1.16g/L，降幅较白天明显，油脂含量也有小幅下降，从13.27％下降至12.93％，第二天白天经过4h的短暂光诱导后，藻细胞密度略有上升，从1.16g/L上升至1.18g/L，同时油脂含量迅速上升，从12.93％升高至18.58％(见图3)，图4为60L鼓泡式大盆中光诱导情况，数据显示变化规律与30L平板式光反应器的规律相类似。
将半连续异养培养结束后的高密度普通小球藻藻液，经光诱导培养基稀释后，转入3T跑道池及3.14m2斜叶搅拌式圆池在户外进行光诱导培养。光诱导培养条件：较低自然温度，温度在5～18℃，自然光照，光强在0～34klx(见图5)，空气流量为1vvm。因该批次5T发酵罐半连续培养结束时间在傍晚，所以藻细胞转入光诱导后即进入夜晚，光诱导阶段共进行了90h，前2天天气晴好，但是气温较低，放入藻液的当晚，最低气温只有5℃，后面两天最高气温为14℃，第三天开始天气转阴有小雨，气温开始小幅回升，第三天傍晚开始闷热潮湿，整个晚上伴有雷阵雨，第四天上午阴有小雨，午后雨停，结束培养并采收藻细胞。
由图6、7可以看出，一方面由于气温较低，不利于藻细胞的生长代谢；另一方面由于第三天开始陆续下雨，雨水稀释了藻液，造成了大池内细胞内浓度下降，所以整个光诱导过程藻细胞密度下降明显。
由于接种后的前12小时，正好是晚上，光合作用不能进行，所以色素和碳水化合物均大幅下降，油脂含量却显著升高，从12％升至18％左右，当晚户外温度较低，低温胁迫可能诱导藻细胞内油脂的合成积累，这也是藻细胞油脂代谢对外界环境变化的一种响应机制。后面两天温度都较低，最高气温不超过14℃，藻细胞胞内成分没有明显变化，第三天开始，虽然有雨水，但是气温显著回升，并且闷热潮湿，从实验数据来看，这种户外实际气候情况反而有利于光诱导过程藻体品质的提升，但是上升速度比较缓慢。在整个90h的户外光诱导过程中，尽管出现低温、阴雨及雷雨天气，但通过延长光诱导时间，藻体的品质也能得到大幅提升，最终油脂含量均大幅提升至20％左右。
异养培养基：
葡萄糖60.0克 硝酸钾10.0克 MgSO4·7H2O 0.2克
KH2PO4 0.3克 Na2HPO4·12H2O 8.8克 CaCl2 0.02克
Fe-EDTA溶液1.0ml 微量元素溶液3.5ml 水1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 15克/升和EDTA 1.4克/升，微量元素溶液配方为H3BO3 2.86克/升，MnCl2·4H2O 0.11克/升，ZnSO4·7H2O9.22克/升，CuSO4·5H2O 1.00克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.9克/升。
光诱导培养基：
硝酸钾0.5克 MgSO4·7H2O 0.6克
CaCl2 0.03克 Fe-EDTA溶液1.5ml 水1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为8克/升和EDTA10.4克/升。
实施例3：异养-稀释-光诱导串联培养过程中椭圆小球藻主要生化成分变化规律的研究
本实施例在500mL摇瓶/3L圆柱式光生物反应器水平测定椭圆小球藻异养-稀释-光诱导串联培养过程中主要生化成分的变化。
采用与实施例1和2类似的方式以异养-稀释-光诱导串联培养技术培养椭圆小球藻，500mL摇瓶，装液量200mL，28℃，150rpm，待藻细胞密度达到10g/L以上且葡萄糖耗尽时，转入3L圆柱式光生物反应器进行光诱导培养，藻细胞密度约2g/L，温度30℃，光强10Klx。异养和光诱导所采用的培养基和蛋白核小球藻的相应培养基一致。异养结束时藻细胞内油脂含量为13.94％，转入光诱导后12h，藻细胞油脂含量快速增加到23.91％(见图8)。
尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (10)
1.一种快速积累微藻胞内油脂的方法，其特征在于，该方法包括微藻的异养培养步骤，将异养培养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的微藻选自：
绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides，Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila，Haematococcus pluvialis，Haematococcus lacustris，Scenedesmus obliquus，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele，Tetraselmis verrucosa，Micractinium pusillum；
硅藻门的Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa；
蓝藻门的Anabaena variabilis；
金藻门的Poterioochromonas malhamensis；
甲藻门的Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii；
裸藻门的Euglena gricilis；和
红藻门的Galdieria sulphuraria。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养微藻的步骤包括在生物反应器中进行异养培养：在生物反应器中加入pH为4.0～10.0的培养基，按工作体积的0.1～30％接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、半连续培养或连续培养，培养温度为10～50℃，控制pH小于10.0，控制溶氧在1％以上。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述藻液稀释包括用培养基将异养培养获得的藻液稀释至细胞密度为0.1～50克/升，所述培养基不含有机碳源，其pH为4.0～10.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱导装置中进行光诱导，培养温度为5～50℃，连续光照或间歇光照，光照强度为0.1～150klx，光诱导培养周期为1～150小时。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，异养培养基由氮源、有机碳源以及少量无机盐、微量元素和水组成；光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器或薄膜立袋与吊袋用于微藻光自养培养的装置中进行，光源为自然光或各种人工光。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：KNO3 5～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH2PO4 0.3～0.9克/升、Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升、MgSO4·7H2O0.2～1.0克/升、CaCl2 0.05～0.3克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.05克/升；微量元素0.5～4ml，其中微量元素的组成为H3BO3 5～15克/升，ZnSO4·7H2O 5.0～10.0克/升，MnCl2·H2O 1.0～2.0克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.5～1.5克/升，CuSO4·5H2O1.0～2.0克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.1～0.9克/升；水。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升，尿素2～8克/升，KH2PO4 1～2克/升，Na2HPO4·12H2O 1.0～10.0克/升，MgSO4·7H2O 1～2克/升，CaCl2 0.05～0.1克/升，柠檬酸三钠0.1～2.0克/升，Fe-EDTA溶液0.5～1mL，A5溶液1～5mL；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4·7H2O 20～30克/升和EDTA20～40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5～4.0克/升，MnCl2·4H2O 1.0～2.0克/升，ZnSO4·7H2O 0.1～0.6克/升，CuSO4·5H2O 5～10克/升，Na2MoO4 0.01～0.05克/升；水。
10.一种油脂生产方法，其特征在于，所述方法包括异养培养微藻的步骤，将异养培养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105458713A CN102021208A (zh) | 2010-11-16 | 2010-11-16 | 一种快速积累微藻胞内油脂的方法 |
| PCT/CN2011/082261 WO2012065545A1 (zh) | 2010-11-16 | 2011-11-16 | 一种快速积累油脂和叶黄素的微藻培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105458713A CN102021208A (zh) | 2010-11-16 | 2010-11-16 | 一种快速积累微藻胞内油脂的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102021208A true CN102021208A (zh) | 2011-04-20 |
Family
ID=43862986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105458713A Pending CN102021208A (zh) | 2010-11-16 | 2010-11-16 | 一种快速积累微藻胞内油脂的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102021208A (zh) |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979498A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-02-23 | 华东理工大学 | 一种微藻高产率异养培养的方法 |
| WO2012065545A1 (zh) * | 2010-11-16 | 2012-05-24 | 华东理工大学 | 一种快速积累油脂和叶黄素的微藻培养方法 |
| WO2012100583A1 (zh) * | 2011-01-27 | 2012-08-02 | 华东理工大学 | 一种高产率的微藻培养方法 |
| CN103045478A (zh) * | 2011-10-14 | 2013-04-17 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种高密度高产脂率培养产油微藻的方法 |
| CN103103128A (zh) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种微藻高效富集培养的方法 |
| CN103571906A (zh) * | 2012-07-27 | 2014-02-12 | 上海泽元海洋生物技术有限公司 | 一种利用微藻高效生产虾青素的新方法 |
| CN103642694A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-19 | 嘉兴泽元生物制品有限责任公司 | 一种高产率的葡萄藻培养方法 |
| CN103756777A (zh) * | 2013-01-22 | 2014-04-30 | 浙江大学 | 利用湿藻生物质微波加热一步法制取生物柴油的方法 |
| CN103787941A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-14 | 青岛科海生物有限公司 | 一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法 |
| CN103981083A (zh) * | 2014-06-09 | 2014-08-13 | 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 | 一种微藻封闭式兼养培养法及其培养*** |
| CN104164366A (zh) * | 2013-05-16 | 2014-11-26 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种养殖微藻的方法 |
| CN104232560A (zh) * | 2013-06-09 | 2014-12-24 | 中国石油化工股份有限公司 | 养殖微藻的方法及生产油脂的方法 |
| CN104498362A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-08 | 甘肃德福生物科技有限公司 | 小球藻的生物质培养方法 |
| CN104628734A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-05-20 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种微藻叶绿素的脱除方法 |
| CN105132404A (zh) * | 2015-10-12 | 2015-12-09 | 山东大学 | 利用超声刺激微藻快速积累油脂的方法 |
| CN105316358A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-10 | 华东理工大学 | 使用ⅲ型nad激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法 |
| CN105331646A (zh) * | 2014-08-06 | 2016-02-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种提高微藻产油量的培养方法 |
| CN106520559A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-03-22 | 海南绿藻世界生物科技有限公司 | 一种小球藻高效率光自养培养方法 |
| CN109566393A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-05 | 浙江海洋大学 | 用于提取多糖的海藻的培养方法 |
| CN109810902A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-05-28 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种金藻的快速培养方法 |
| CN114456941A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-10 | 扬州大学 | 一种通过光调节降低光对微藻利用有机碳源的抑制提高其兼养生长速率的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1837351A (zh) * | 2006-04-12 | 2006-09-27 | 华东理工大学 | 高密度高品质培养小球藻的方法 |
-
2010
- 2010-11-16 CN CN2010105458713A patent/CN102021208A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1837351A (zh) * | 2006-04-12 | 2006-09-27 | 华东理工大学 | 高密度高品质培养小球藻的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李元广等: "异养-稀释-光诱导串联培养-微藻培养领域一项崭新的平台技术", 《庆祝中国藻类学会暨第十五次学术讨论会摘要集》, 15 November 2009 (2009-11-15), pages 241 * |
| 李元广等: "生物质能领域的热点研究方向-微藻生物柴油的研究概况及存在问题分析", 《2009全国可再生能源-生物质能利用技术研讨会论文集》, 27 April 2009 (2009-04-27), pages 44 * |
| 林学政等: "环境因子对微藻脂类的影响", 《黄渤海海洋》, vol. 17, no. 4, 30 December 1999 (1999-12-30), pages 54 - 59 * |
Cited By (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012065545A1 (zh) * | 2010-11-16 | 2012-05-24 | 华东理工大学 | 一种快速积累油脂和叶黄素的微藻培养方法 |
| CN101979498A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-02-23 | 华东理工大学 | 一种微藻高产率异养培养的方法 |
| CN101979498B (zh) * | 2010-12-01 | 2016-05-04 | 华东理工大学 | 一种微藻高产率异养培养的方法 |
| WO2012100583A1 (zh) * | 2011-01-27 | 2012-08-02 | 华东理工大学 | 一种高产率的微藻培养方法 |
| CN103045478A (zh) * | 2011-10-14 | 2013-04-17 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种高密度高产脂率培养产油微藻的方法 |
| CN103045478B (zh) * | 2011-10-14 | 2017-02-08 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种高密度高产脂率培养产油微藻的方法 |
| CN103103128A (zh) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种微藻高效富集培养的方法 |
| CN103571906A (zh) * | 2012-07-27 | 2014-02-12 | 上海泽元海洋生物技术有限公司 | 一种利用微藻高效生产虾青素的新方法 |
| EP2878676A4 (en) * | 2012-07-27 | 2016-05-25 | Univ East China Science & Tech | PROCESS WITH MICROALGEN FOR THE HIGHLY EFFICIENT MANUFACTURE OF ASTAXANTHINE |
| CN103756777A (zh) * | 2013-01-22 | 2014-04-30 | 浙江大学 | 利用湿藻生物质微波加热一步法制取生物柴油的方法 |
| CN103756777B (zh) * | 2013-01-22 | 2015-07-15 | 浙江大学 | 利用湿藻生物质微波加热一步法制取生物柴油的方法 |
| CN104164366A (zh) * | 2013-05-16 | 2014-11-26 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种养殖微藻的方法 |
| CN104164366B (zh) * | 2013-05-16 | 2017-10-03 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种养殖微藻的方法 |
| CN104232560B (zh) * | 2013-06-09 | 2020-08-18 | 中国石油化工股份有限公司 | 养殖微藻的方法及生产油脂的方法 |
| CN104232560A (zh) * | 2013-06-09 | 2014-12-24 | 中国石油化工股份有限公司 | 养殖微藻的方法及生产油脂的方法 |
| CN103642694A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-19 | 嘉兴泽元生物制品有限责任公司 | 一种高产率的葡萄藻培养方法 |
| CN103787941A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-14 | 青岛科海生物有限公司 | 一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法 |
| CN103981083B (zh) * | 2014-06-09 | 2016-03-16 | 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 | 一种微藻封闭式兼养培养法 |
| CN103981083A (zh) * | 2014-06-09 | 2014-08-13 | 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 | 一种微藻封闭式兼养培养法及其培养*** |
| CN105331646A (zh) * | 2014-08-06 | 2016-02-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种提高微藻产油量的培养方法 |
| CN104628734B (zh) * | 2014-12-25 | 2017-06-30 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种微藻叶绿素的脱除方法 |
| CN104628734A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-05-20 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种微藻叶绿素的脱除方法 |
| CN104498362A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-08 | 甘肃德福生物科技有限公司 | 小球藻的生物质培养方法 |
| CN105132404A (zh) * | 2015-10-12 | 2015-12-09 | 山东大学 | 利用超声刺激微藻快速积累油脂的方法 |
| CN105132404B (zh) * | 2015-10-12 | 2021-03-02 | 山东大学 | 利用超声刺激微藻快速积累油脂的方法 |
| CN105316358B (zh) * | 2015-10-14 | 2019-05-28 | 华东理工大学 | 使用ⅲ型nad激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法 |
| CN105316358A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-10 | 华东理工大学 | 使用ⅲ型nad激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法 |
| CN106520559A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-03-22 | 海南绿藻世界生物科技有限公司 | 一种小球藻高效率光自养培养方法 |
| CN106520559B (zh) * | 2016-12-28 | 2019-05-31 | 海南绿藻世界生物科技有限公司 | 一种小球藻高效率光自养培养方法 |
| CN109566393A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-05 | 浙江海洋大学 | 用于提取多糖的海藻的培养方法 |
| CN109810902A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-05-28 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种金藻的快速培养方法 |
| CN114456941A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-10 | 扬州大学 | 一种通过光调节降低光对微藻利用有机碳源的抑制提高其兼养生长速率的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102021208A (zh) | 一种快速积累微藻胞内油脂的方法 | |
| CN102154110B (zh) | 一种高产率的微藻培养方法 | |
| Liu et al. | Biology and industrial applications of Chlorella: advances and prospects | |
| Wu et al. | Lipid accumulating microalgae cultivation in textile wastewater: Environmental parameters optimization | |
| Scragg et al. | Growth of microalgae with increased calorific values in a tubular bioreactor | |
| Chen et al. | Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta | |
| Fan et al. | Sequential heterotrophy–dilution–photoinduction cultivation for efficient microalgal biomass and lipid production | |
| Chiu et al. | Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2 aeration | |
| Ogbonna et al. | Cyclic autotrophic/heterotrophic cultivation of photosynthetic cells: a method of achieving continuous cell growth under light/dark cycles | |
| CN102083957B (zh) | 具有高效去除二氧化碳特征性的微藻及其用途 | |
| Detweiler et al. | Evaluation of wavelength selective photovoltaic panels on microalgae growth and photosynthetic efficiency | |
| WO2012071983A1 (zh) | 一种微藻高产率异养培养的方法 | |
| CN102453682B (zh) | 一种海洋微藻及其培养方法和应用 | |
| CN103571906A (zh) | 一种利用微藻高效生产虾青素的新方法 | |
| CN104450525B (zh) | 一种微藻养殖和废气脱硝的联合方法 | |
| CN102094061B (zh) | 一种利用微藻生产叶黄素的方法 | |
| Wang et al. | Heterotrophic cultivation of Chlorella kessleri for fatty acids production by carbon and nitrogen supplements | |
| CN104152357A (zh) | 同时提高小球藻中叶绿素和蛋白质含量的高密度培养方法 | |
| Liu et al. | Growth and nutrient utilization of green algae in batch and semicontinuous autotrophic cultivation under high CO 2 concentration | |
| CN103642694A (zh) | 一种高产率的葡萄藻培养方法 | |
| WO2012065545A1 (zh) | 一种快速积累油脂和叶黄素的微藻培养方法 | |
| CN104232559B (zh) | 养殖微藻的方法及生产油脂的方法 | |
| Rinanti et al. | Growth response and chlorophyll content of Scenedesmus obliquus cultivated in different artificial media | |
| CN107460217A (zh) | 一种混合培养制备微藻油脂的方法 | |
| CN103184145B (zh) | 一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110420 |