CN101991832B - 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 - Google Patents
一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101991832B CN101991832B CN201010531346A CN201010531346A CN101991832B CN 101991832 B CN101991832 B CN 101991832B CN 201010531346 A CN201010531346 A CN 201010531346A CN 201010531346 A CN201010531346 A CN 201010531346A CN 101991832 B CN101991832 B CN 101991832B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medicine
- pulmonary fibrosis
- volatile oil
- lung
- radix
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
一种治疗特发性肺纤维化的药物,是以干姜、五味子、瓜蒌仁、桂枝、柴胡、半夏、党参、炙甘草、生姜和大枣为原料药,制成任何一种常用的口服剂型。本发明药物具有祛除外邪,平调寒热,宣肃肺气,止咳平喘的功效,可用于治疗特发性肺纤维化。动物试验结果显示,本发明药物可以减轻I PF大鼠肺组织的异常改变,能不同程度调节大鼠肺纤维化模型体内的自由基代谢,提高GSH-Px与S0D的活性,降低MDA和NO含量,有效降低血清中PDGF、TGF-β1和TNF-a水平,对博莱霉素所致肺损伤和纤维化具有防治作用。临床试验证实,本发明药物治疗特发性肺纤维化总有效率达到88.5%。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗间质性肺疾病的药物,特别是涉及一种以中药为原料药制备的治疗特发性肺纤维化的药物。本发明还涉及该药物的制备方法。
背景技术
间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)又被称为弥漫性间质性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease,DPLD),是指一大组不同性质的肺部疾病。其组织学特点为病变弥漫分布于双肺,主要侵犯周边肺组织,如肺泡、肺泡间隔、小气道和小血管以及肺间质结构。急性期以肺泡壁多种细胞浸润、肺泡腔蛋白渗出为主,在亚急性期以肉芽肿为主,慢性期呈现弥漫性间质纤维化,严重者出现“蜂窝肺”。
间质性肺疾病可分为原发性和继发性两种,特发性肺纤维化(IPF)属于原发性,是弥漫性间质性肺疾病的常见类型。它是指原因不明并以普通型间质性肺炎(UIP)为特征性病理改变的一种慢性炎症性间质性肺疾病,主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化(UIP不同于特发性间质性肺炎(IIP)的其它类型,如特发性脱屑性间质性肺炎/呼吸性细支气管炎伴间质性肺病(DIP/RBILD)、特发性非特异性间质性肺炎(NSIP)和急性间质性肺炎(AIP))。IPF的临床表现以进行性呼吸困难、喘息、气短、干咳、喘憋等为主,以限制性通气功能障碍、低氧血症等肺功能障碍为特征,HRCT显示以两下肺、肺周边网格条索状、磨玻璃状、结节状、甚或蜂窝状改变为特征。
国外资料显示,特发性肺纤维化(IPF)患病率为男性20.2/10万人口,女性7.4/10万人口,欧洲和日本报道的患病率为3~8/10万人口,我国尚无确切的患病率统计。特发性肺纤维化的男女发病比例为2∶1,好发年龄为40~70岁,疾病进行性恶化,生存期为2~5年。近年来我国发病率和死亡率明显上升。
近几年来,通过对间质性肺疾病的基础和临床研究,学者们较一致地认为,无论是皮质激素或免疫抑制剂以及其它治疗,其治疗间质性肺疾病的疗效都不满意。在急性期、亚急性期,西医以抗炎、激素等的应用加以治疗,钟南山院士指出,“对于慢性已形成纤维化的病例,糖皮质激素疗效较差。”《特发性肺(间质)纤维化诊断和治疗指南(草案)》(2002年7月)对间质性肺疾病的治疗主要有糖皮质激素、免疫抑制剂,非肯定治疗有红霉素、N-乙酰半胱氨酸、干扰素、毗非尼酮、秋水仙碱等药物。但以上所有治疗都不能改善间质性肺疾病患者的预后和生存期。
目前广泛用于治疗各种纤维化疾病的药物,包括各种参与纤维化发生的特异性细胞因子拮抗剂、治疗性单克隆抗体都不能有效地阻止纤维化的发展,更不能降低组织纤维化疾病死亡率。基因组和蛋白质组学研究使我们了解到,组织纤维增生性疾病病因众多,机制复杂,属于典型的多基因、多表型疾病,这是目前正在临床使用的各种抗纤维化药物效果不佳的主要原因。因此认为,只有那些能够干预多通道、多靶点的药物才会获得满意的治疗效果。
特发性肺纤维化至今病因未明。根据多年临床观察,发现患者大都起因于感受外邪。外邪入侵,首先犯表,在中医六经辨证中,为首先侵犯太阳经;太阳表证的治疗应该用汗法。在现代社会,大多数人对于邪气犯表大都采用静脉滴注药物或使用不对证的OTC药物治疗,汗法在实际临床中都未能使用或未能正确使用,因而入侵的邪气发生传变。循经顺传则传入少阳,治疗则应该和解少阳。然而亦有未能完全传入者,则太阳表证亦同时并在。肺在人体五脏中位置最上,又为娇脏,邪气入侵太阳,未有不并见肺脏受邪之表现者。肺脏受邪,咳嗽、气喘定会出现。按照中医望、闻、问、切四诊合参,特发性肺纤维化在临床基本上表现为咳嗽、咳吐浊唾涎沫、气喘胸闷、情绪微烦、口苦、咽干、头晕头痛、多汗、纳差,有的伴有发热,有的伴有恶心呕吐,舌红苔厚,脉弦或弦细。仔细分析这些症状,发现既有少阳证的表现,又兼有太阳证的表现。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗特发性肺纤维化的药物,该药物具有祛除外邪,平调寒热,宣肃肺气,止咳平喘的功效,可用于治疗特发性肺纤维化。
提供一种上述药物的制备方法,是本发明的另一发明目的。
中医认为,肺主气,司呼吸。肺纤维化的病程呈现慢性表现,此类患者大多有气虚之象。久病必虚,故在治疗上应以扶正为当务之急。其次,此类患者在漫长的疾病过程中,由于气虚无力御邪、祛邪,往往多种邪气久留,寒热错杂,虚实并见。《素问·痹论》指出:“风寒湿三气杂至,合而为痹也......皮痹不已,复感于邪,内舍于肺......凡痹之客五脏者,肺痹者,烦满喘而呕。”邪气痹阻于肺,肺气失宣,肺络不通,诸症变生。故在治疗上宜祛除外邪,平调寒热,兼扶正气。肺气得宣,肺络得通,诸症得除,而阴阳自复,则疾病自除。
基于上述机理,本发明的药物是由以下重量份数的中药为原料药制备获得的:
干姜 5~10 五味子 12~18
瓜蒌仁 15~20 桂枝 10~15
柴胡 20~30 半夏 8~12
党参 12~18 炙甘草 8~12
生姜 5~15 大枣 15~20。
上述药物优选的原料药重量份数为:
干姜 6~8 五味子 15~18
瓜蒌仁 15~20 桂枝 12~15
柴胡 20~25 半夏 9~12
党参 12~15 炙甘草 9~10
生姜 6~12 大枣 16~18。
以上各种原料药的用量是发明人经过大量摸索总结得出的,实践证明,各种原料药在上述重量范围内都具有较好的疗效。
可以采用中药制剂的常规方法,将本发明上述药物制备成任何一种药剂学上的常规口服剂型,但是这些剂型并不能用于限制本发明的保护范围。需要强调的是,在制备任何一种剂型前,都需要先制备得到本发明药物的活性组分。
将上述各原料药制成本发明药物活性组分的具体制备方法包括以下步骤:
a)将所述重量份数的半夏粉碎成细粉,备用;
b)以80wt%的乙醇溶液提取所述重量份数的五味子三次,收集药渣备用,合并乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;
c)将所述重量份数的柴胡与干姜粉碎后,以水蒸气提取法收集挥发油,收集水提液备用,所得挥发油用饱和水溶液法制成挥发油β环糊精包合物;
d)取所述重量份数的瓜蒌仁、桂枝、党参、炙甘草、生姜和大枣,加入步骤b)的药渣、步骤c)的水提液,加水煎煮两次,合并两次煎液,过滤,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液,减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥,粉碎,得干浸膏2;
e)合并干浸膏1和干浸膏2,加入上述半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得到本发明药物的活性组分。
其中,步骤b)中以乙醇溶液提取药物时,第一次提取1.5h,第二、三次提取1h。
步骤d)中加水煎煮药物时,每次加水为药物的8倍重量,煎煮1.5h。
所述挥发油的水蒸气提取是将药物粉碎,过24~35筛,加入8倍药物重量的水浸泡1h,提取8h,收集挥发油。
所述挥发油β环糊精包合物的制备是按照β环糊精∶挥发油=8∶1、β环糊精∶水=1∶6的重量配比,将挥发油与β环糊精、水在35℃下搅拌1h,分离得到挥发油β环糊精包合物。
进一步地,本发明的药物还可以是由以下重量份数的中药为原料药制备获得的:
干姜 5~10 五味子 12~18
瓜蒌仁 15~20 桂枝 10~15
柴胡 20~30 黄芩 8~15
半夏 8~12 党参 12~18
炙甘草 8~12 天花粉 10~15
桔梗 10~15 香附 6~15
生姜 5~15 大枣 15~20。
上述药物优选的原料药重量份数为:
干姜 6~8 五味子 15~18
瓜蒌仁 15~20 桂枝 12~15
柴胡 20~25 黄芩 9~12
半夏 9~12 党参 12~15
炙甘草 9~10 花粉 12~15
桔梗 10~12 香附 8~12
生姜 6~12 大枣 16~18。
将上述各原料药制成本发明药物活性组分的具体制备方法包括以下步骤:
a)将所述重量份数的半夏粉碎成细粉,备用;
b)将所述重量份数的五味子和桔梗以80wt%的乙醇溶液提取三次,收集药渣备用,合并乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;
c)将所述重量份数的柴胡与干姜粉碎后,以水蒸气提取法收集挥发油,收集水提液备用,所得挥发油用饱和水溶液法制成挥发油β环糊精包合物;
d)取所述重量份数的瓜蒌仁、桂枝、黄芩、党参、炙甘草、天花粉、香附、生姜和大枣,加入步骤b)的药渣、步骤c)的水提液,加水煎煮两次,合并两次煎液,过滤,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液,减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥,粉碎,得干浸膏2;
e)合并干浸膏1和干浸膏2,加入上述半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得到本发明药物的活性组分。
其中,步骤b)中以乙醇溶液提取药物时,第一次提取1.5小时,第二、三次提取1小时。
步骤d)中加水煎煮药物时,每次加水为药物的8倍重量,煎煮1.5小时。
所述挥发油的水蒸气提取是将药物粉碎,过24~35目筛,加入8倍药物重量的水浸泡1h,提取8h,收集挥发油。
所述挥发油β环糊精包合物的制备是按照β环糊精∶挥发油=8∶1、β环糊精∶水=1∶6的重量配比,将挥发油与β环糊精、水在35℃下搅拌1h,分离得到挥发油β环糊精包合物。
本发明药物的活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料,如崩解剂、润滑剂、粘合剂等,以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型,如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等。
本发明药物中,柴胡味苦性平,入肝胆经,透泄少阳之邪,并能疏泄气机之郁滞,使少阳半表之邪得以疏散,为君药。黄芩苦寒,清泄少阳半表之热,为臣药。柴胡之升散,得黄芩之降泄,二者相伍,是和解少阳的基本结构。胆气犯胃,胃失和降,以半夏、生姜和胃降逆止呕;邪从太阳传入少阳,源于正气本虚,故用桂枝祛太阳之邪,用党参、大枣益气健脾,后二者一来可以扶正以驱邪,二来可益气以抵御邪气内传,使正气旺盛,则邪无内传之机。五味子、干姜温肺散寒,则咳喘自止,痰涎自化;瓜蒌仁宽胸理气,则胸闷得除;天花粉、桔梗利咽,则咽干得解;炙甘草助党参、大枣扶正,并能调和诸药。诸症合用,具有祛除外邪,平调寒热,宣肃肺气,止咳平喘的功效,可用于治疗特发性肺纤维化。
附图说明
图1是空白对照组大鼠肺组织HE染色光镜观察图;
图2是模型对照组大鼠第7天肺组织HE染色光镜观察图;
图3是模型对照组大鼠第14天肺组织HE染色光镜观察图;
图4是模型对照组大鼠第21天肺组织HE染色光镜观察图;
图5是本发明药物大剂量组大鼠第7天肺组织HE染色光镜观察图;
图6是本发明药物大剂量组大鼠第14天肺组织HE染色光镜观察图;
图7是本发明药物大剂量组大鼠第21天肺组织HE染色光镜观察图;
图8是阳性对照组大鼠第7天肺组织HE染色光镜观察图;
图9是阳性对照组大鼠第14天肺组织HE染色光镜观察图;
图10是阳性对照组大鼠第21天肺组织HE染色光镜观察图。
具体实施方式
实施例1
a)取2Kg半夏,粉碎成细粉备用;
b)取3Kg五味子,加入30L的80%乙醇溶液中,加热提取1.5h,过滤,收集滤液,药渣中加80%乙醇溶液25L,加热提取1h,过滤,收集滤液,药渣中再加入80%乙醇溶液25L,加热提取1h,过滤,留下药渣备用,合并三次乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;
c)取柴胡6.5Kg、干姜2.5Kg,粉碎过24~35目筛,加入75L水中,先浸泡1h,再以水蒸气提取法提取8h,收集挥发油,留取水提液备用;按照β环糊精∶挥发油=8∶1、β环糊精∶水=1∶6的重量比,将挥发油和β环糊精加入35℃的水中,持续搅拌1h,静置分层,分去水层后,干燥得到挥发油β环糊精包合物;
d)取瓜蒌仁4Kg、桂枝3Kg、党参4.5Kg、炙甘草3Kg、生姜3Kg和大枣4Kg混合,加入步骤b)的药渣和步骤c)的水提液,补水150L,加热煎煮1.5h,过滤,药渣中再加150L水,加热煎煮1.5h,过滤,合并两次煎液,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液,减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥并粉碎后,得干浸膏2;
e)合并干浸膏1和干浸膏2,再加入上述的半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得药物活性组分;
f)取药物活性组分1份、蔗糖1份、糊精0.5份,加入80%乙醇适量,干燥制成颗粒剂。
实施例2
a)取2.5Kg半夏,粉碎成细粉备用;
b)取4Kg五味子、3Kg桔梗,加入60L的80%乙醇溶液中加热提取1.5h,过滤,收集滤液,药渣中加80%乙醇溶液50L,加热提取1h,过滤,收集滤液,药渣中再加入80%乙醇溶液50L,加热提取1h,过滤,留下药渣备用,合并三次乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;
c)取柴胡6Kg、干姜1.5Kg,粉碎过24~35目筛,加入60L水中,先浸泡1h,再以水蒸气提取法提取8h,收集挥发油,留取水提液备用;按β环糊精∶挥发油=8∶1、β环糊精∶水=1∶6的重量比,将挥发油和β环糊精加入35℃的水中,持续搅拌1h,静置分层,分去水层后,干燥得到挥发油β环糊精包合物;
d)取瓜蒌仁4.5Kg、桂枝3Kg、黄芩2.5Kg、党参4Kg、炙甘草2Kg、天花粉3Kg、香附2Kg、生姜2Kg和大枣4.5Kg混合,加入步骤b)的药渣和步骤c)的水提液,补水200L,加热煎煮1.5h,过滤,药渣中加200L水加热煎煮1.5h,过滤,合并两次煎液,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液,减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥并粉碎后,得干浸膏2;
e)合并干浸膏1和干浸膏2,再加入上述的半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得药物活性组分。
f)将药物活性组分粉碎,加入10%微晶纤维素作为润滑剂,混匀后装入胶囊壳中制成胶囊剂。
实施例3
取3Kg半夏粉碎成细粉;取4.5Kg五味子、3.5Kg桔梗,按照实施例1步骤b)方法得到干浸膏1和药渣;取柴胡6.5Kg、干姜1.5Kg,按照实施例2步骤c)方法得到水提液和挥发油β环糊精包合物;取瓜蒌仁5Kg、桂枝2.5Kg、黄芩3Kg、党参3Kg、炙甘草2Kg、天花粉3.5Kg、香附3Kg、生姜1.5Kg和大枣5Kg混合,加入上述药渣和水提液,按照实施例2步骤d)方法得到干浸膏2;合并干浸膏1和干浸膏2,再加入上述的半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得药物活性组分。
将药物活性组分粉碎,加入5%微晶纤维素,混匀,以70%乙醇作为润湿剂制成颗粒,加入1%的硬脂酸镁,混匀,压片,包薄膜衣(薄膜衣配方为70%羟丙基甲基纤维素、15%增塑剂聚乙二醇-6000、15%润滑剂滑石粉)制成片剂。
实施例4
取2.5Kg半夏粉碎成细粉;取4Kg五味子,按照实施例1步骤b)方法得到干浸膏1和药渣;取柴胡5Kg、干姜2Kg,按照实施例2步骤c)方法得到水提液和挥发油β环糊精包合物;取瓜蒌仁4Kg、桂枝3.5Kg、党参4Kg、炙甘草2.5Kg、生姜2.5Kg和大枣4Kg混合,加入上述药渣和水提液,按照实施例1步骤d)方法得到干浸膏2;合并干浸膏1和干浸膏2,再加入上述的半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得药物活性组分。
取药物活性组分,加入20%的羧甲基纤维素钠,混匀,与聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000=3∶1的混合基质混合,加热熔融后,滴入液体石蜡冷凝液中凝聚成滴丸,取出,吸取冷凝液并干燥后制成滴丸。
试验例1
本发明药物干预博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织形态学的实验研究
特发性肺纤维化在肺组织病理学上表现为寻常型间质肺炎,是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱为主,最终导致肺纤维化为特征的进行性下呼吸道***疾病。目前尚无特效的治疗方法。本实验通过动物实验考察本发明药物对实验性肺纤维化大鼠肺组织病理形态的影响及肺泡灌洗液细胞成分类别的变化情况并比较各组大鼠肺系数,为客观评价本发明药物对肺纤维化的防治作用提供病理形态学依据。
1、实验材料
本发明实施例2药物活性组分。以药物活性组分含量计算,本发明药物大剂量组浓度为0.32g/ml,中剂量组为0.16g/ml,小剂量组为0.08g/ml(相当于人临床日用剂量体重比例的15,7.5和3.75倍)。
博莱霉素A5(BLM),商品名:平阳霉素;哈尔滨博莱制药有限公司生产,批号:090607,规格:8mg/支,用时加1.6ml生理盐水溶解。
醋酸***片:天津太平洋制药有限公司生产,批号:090707,规格:5mg/片。用时将醋酸***片研成粉末,加蒸馏水溶解,配制成0.6mg/ml混悬液备用,给药量10ml/kg·bw,相当于人临床日用剂量48mg体重比例的7.5倍。
磷酸盐缓冲溶液(pH6.8):1/15mol/L磷酸氢二钠溶液49.60ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50.40ml混合均匀配制而成。用于GiemSa染色液的配制。临用前现配。
姬姆萨染色原液(Giemsa):取姬姆萨染料1g、甘油66ml、甲醇66ml。将姬姆萨染料放入研钵中,先加入少量甘油研磨溶解,分次倒入剩余的甘油,转移入烧杯中,置56℃水浴中2h,冷却后再加入66ml甲醇混合均匀,于室温中静置1~2周。用滤纸过滤,贮存于棕色瓶中备用。
姬姆萨染色液:取磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)9份与姬姆萨染色原液1份混匀配成。现用现配。
2、实验方法
2.1实验动物及分组
清洁级健康Wistar大鼠144只,雌雄各半,体重200±20g,由山西省中医院实验动物中心提供,动物合格证号SCXK(晋)2009-10,于实验前一周一次性购进,按清洁级标准饲养于安静、温暖且避强光的环境中,自由饮水进食。
将144只大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、阳性对照组(C组)、本发明药物大(D组)、中(E组)、小(F组)剂量组,每组各24只。
2.2模型制作
按Szapiel法建立模型:20%乌拉坦5ml/kg·bw腹腔注射麻醉大鼠,仰卧固定于大鼠实验台上,消毒后切开颈部皮肤,逐层分离,充分暴露气管,除空白对照组的其他各组用1ml注射器缓慢注入稀释的博莱霉素溶液,计量为5ml/kg,空白对照组注入等容量生理盐水,注射后立即将动物直立并旋转,使药物均匀散布于双肺内,然后缝合皮肤,创口消毒,置于实验室内保温喂养,待其自行苏醒,实验期间动物自由饮水和进食。
2.3给药方法
造模后第二天开始灌胃给药,本发明药物大、中、小剂量组分别给予相应浓度(0.32g/ml、0.16g/ml、0.08g/ml)的药液灌胃给药,剂量均为10ml/kg·bw,相当于人临床日用剂量体重比例的15、7.5和3.5倍;阳性对照组用醋酸***混悬液(浓度0.6mg/ml)灌胃给药,剂量为10ml/kg·bw,相当于人临床日用剂量48mg体重比例的7.5倍;空白对照组与模型对照组均给予等量生理盐水灌胃,1次/天。给药周期21天。
2.4取材方法
大鼠在造模7、14、21d后分三次取材,前后期各随机杀检10只,中期杀检4只对照验证,称重,20%乌拉坦溶液(5ml/kg)腹腔注射麻醉后固定到大鼠解剖台,打开腹腔和胸腔,腹主动脉取血,室温静置2h,冷冻低速离心机分离血清(3000r/min,10min),充分剥离气管和肺,迅速摘取双肺,在预冷的生理盐水中快速洗去血液,左肺固定HE染色、右肺称重计算肺系数,并制备10%肺组织匀浆,离心分离上清匀浆液,-70℃冷冻保存,待检。
2.5一般情况观察
观察记录造模后实验各组大鼠每日的进食状况、体重变化、呼吸及外表征象等。
2.6支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞成分分析
灌洗左肺,夹闭右肺主支气管,对左肺行支气管肺泡灌洗,一次注入冷生理盐水2ml,反复四次,收集支气管肺泡灌洗液,4℃离心(1500r/min,15min),取沉淀细胞以PBS洗两次,而后1mlPBS重悬细胞。45ul细胞悬液加5ul4%台盼蓝,按常规方法计数细胞总数;100ul细胞悬液,细胞甩片机做细胞切片,Giemas染色后分类计数。
2.7光镜标本制作
取大鼠左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h后,将肺尖至肺底部组织横切成3mm厚的薄片,4%多聚甲醛固定72h,乙醇梯度脱水(50%乙醇2min,75%乙醇2min,80%乙醇2min,95%乙醇2min,100%乙醇2min),二甲苯透明,石蜡定向包埋,连续切片,厚度6um,选择每块标本连续切片中的第5片,HE染色(具体由中国辐射防护研究院病理室完成),进行定性及半定量观察。
2.8光镜病理学检查
按Szapiel法确定肺泡炎(-~+++级)程度和肺纤维化(-~+++级)程度。
肺泡炎分为四级:
0级:无肺泡炎;
1级:轻度肺泡炎,表现为肺泡间隔因单核细胞浸润增宽,仅限于局部和近胸膜部,面积小于全肺的20%,肺泡结构正常;
2级:中度肺泡炎,表现为病变范围占全肺的20~50%,近胸膜部较重;
3级:重度肺泡炎,呈弥漫性分布,病变范围大于50%,偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变。
肺纤维化分为四级:
0级:无纤维化;
1级:轻度纤维化,病变范围小于20%,纤维化累及胸膜及胸膜下的肺间质,肺泡的结构发生紊乱;
2级:中度纤维化,病变范围占全肺的20~50%,纤维化区域从胸膜延伸,仍属局部病变;
3级:重度肺纤维化:病变范围大于50%,肺泡融合损伤可见大小不等的囊气腔,肺实质结构紊乱。
3、统计学处理
4、结果
4.1一般状态
4.1.1外观形态变化
空白对照组大鼠活泼好动,饮食饮水正常,皮毛光泽,体重逐渐增加,呼吸平稳。模型对照组造模一周内精神萎靡,饮食饮水少,行动迟缓,皮毛无光泽、呼吸急促,体重增加不明显。两周后饮食饮水逐渐增加,体重开始缓慢上升。阳性对照组早期效果较好,后期出现皮毛坚竖,懒动,状态不如早期,但好于模型对照组。本发明药物大剂量组皮毛尚可,饮食饮水较好,体重增加明显,呼吸匀称。
4.1.2造模前后各组大鼠体重变化情况
观察大鼠第0、7、14、21d体重,结果见表1-1。与空白对照组相比,模型对照组大鼠的体重下降最显著(P<0.01);其余各组大鼠体重也有不同程度的下降;与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组大鼠体重上升趋势明显,具有显著统计学差异(P<0.05)。
注:与空白组比较,△P<0.05,▲P<0.01;与模型组比较,☆P<0.05,★P<0.01
4.1.3各组肺系数比较
根据公式:肺系数=肺重量(g)/身体重量(kg)计算肺系数,由表1-2可以看出,空白对照组各期肺系数无明显变化,模型对照组大鼠各期肺系数均明显高于同期空白对照组(P<0.01或0.05),阳性对照组、本发明药物各剂量组大鼠各期肺系数均高于同期空白对照组大鼠,但明显低于同期模型对照组大鼠(P<0.01或0.05),其中,阳性对照组和本发明药物大中剂量组肺系数均有改善趋势,与小剂量组比较有显著性差异(P<0.05),但三组间比较无统计学差异(P>0.05)。
注:与空白对照组比较,▲P<0.01,△P<0.01;与模型组比较,★P<0.01,☆P<0.05。
4.1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及分类
与空白对照组相比,7、14d时模型对照组大鼠BALF中细胞总数均明显升高(P<0.01),以7d时达到高峰,14d时开始下降,21d时基本恢复正常。与模型对照组相比,7、14d时本发明药物各剂量组的降低作用较为显著(P<0.01),14d时本发明药物中剂量组的降低作用最为显著(P<0.01),21d基本恢复正常。
细胞分类结果提示,空白对照组BALF中细胞分类以肺泡巨噬细胞(AM)为主。与空白对照组相比,7、14d时模型对照组大鼠AM百分比均明显下降(P<0.01或0.05),21d时逐渐恢复至正常。与模型对照组相比,7、14d时本发明药物各剂量组均可提高IPF大鼠AM百分比,其中7d时本发明药物高中剂量组的作用较为显著(P<0.01或P<0.05),14d时本发明药物中剂量组的作用最为显著(P<0.05),21d时基本恢复至正常。与空白对照组相比,7、14d时模型对照组大鼠中性粒细胞(PMN)和淋巴细胞(LYM)百分比均明显上升(P<0.01),21d时逐渐恢复至正常。与模型对照组相比,7、14d时本发明药物各剂量组均可降低IPF大鼠PMN和LYM百分比,其中7d时本发明药物高中剂量组对PMN百分比的降低作用较为显著(P<0.01),14d时本发明药物中剂量组对PMN和LYM百分比的降低作用最为显著(P<0.05),21d时基本恢复正常,见表1-3。
4.2肺组织病理形态学变化
4.2.1大体观察
空白对照组7、14、21d时双肺呈粉红色,表面光滑,弹性好。模型对照组7d时双肺可见密集的点状出血灶并黑色瘀斑,肺体积增大;14d时双肺呈灰白色,局部可见大小不等的结节样改变及陈旧性出血点,肺组织较硬;21d时双肺苍白,体积缩小,触及较硬,表面结节样改变及条索状凹沟。与模型对照组比较,7d时阳性对照组及本发明药物大中小剂量组两肺外观病理变化明显好于模型对照组,两肺稍暗红,弹性尚可,其中大中剂量组明显好于阳性对照组、小剂量组;14~21d时,大中剂量组大部分动物两肺颜色稍暗,双肺弹性尚可,偶可见部分肺叶有散在的点状灰色斑块,但好于阳性对照组与小剂量组,而阳性对照组及小剂量组略好于模型对照组。
4.2.2HE染色光镜观察
空白对照组:肺组织结构清晰,肺泡间隔未见增厚,无充血水肿、炎症及纤维化表现,肺泡腔内无明显渗出(见图1)。
模型对照组:第7d时肺泡炎明显,肺泡腔及肺间质均可见大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞、淋巴细胞为主,肺泡间隔水肿,轻度增宽(见图2)。第14d时肺泡炎程度有所减轻,肺泡间隔增厚以巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主,成纤维细胞增生,肺泡腔变窄,间质胶原纤维增生呈带状,发生纤维化(见图3)。第21d时纤维化进一步加重,肺泡结构破坏或消失,大量炎症细胞浸润,肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主(见图4)。
阳性对照组:肺泡炎及肺纤维化程度较模型对照组减轻,第7d时炎性细胞浸润较模型对照组明显减少(见图8)。14d时呈轻中毒肺泡炎改变,肺泡间隔增厚,病变程度较同期模型对照组轻,肺组织结构基本完整(见图9)。第21d时呈轻微肺纤维化改变,病变范围较局限,胸膜和肺泡间隔胶原纤维沉积呈束状(见图10)。
本发明药物各剂量组:大中剂量组肺泡炎及肺纤维化程度均较模型对照组明显减轻。第7d时肺组织炎性细胞浸润区域较模型组减少(见图5);第14d时呈轻中度肺泡炎改变,肺组织结构较模型组完整,成纤维细胞增殖减轻,病变程度较同期模型对照组轻(见图6);第21d时轻中度纤维化改变,病变范围局限,胸膜和肺泡间隔胶原纤维沉积呈束状(见图7)。小剂量组的肺泡炎及肺纤维化程度与模型对照组比较略微减轻,但无统计学意义(P>0.05)。
五组大鼠(除空白对照组)的肺泡结构破坏及病变程度由重到轻的顺序如下:
第7d:模型对照组、小剂量组、中剂量组、阳性对照组、大剂量组。
第21d:模型对照组、小剂量组、阳性对照组、中剂量组、大剂量组。
4.3病理形态学半定量分析结果
光镜观察,空白对照组未出现肺泡炎、肺纤维化的病理改变。模型对照组明显出现肺泡炎至肺纤维化的病理改变。本发明药物大中剂量组明显好于小剂量组和阳性对照组。依据Szapiel法确定肺泡炎(-~+++级)的程度和肺纤维化(-~+++级)的程度,具体结果分析见表1-4。
表1-4各组大鼠肺泡炎和肺间质纤维化病理学分析结果(n=10)
经Radit分析,肺泡炎程度比较,由重到轻顺序为模型对照组、小剂量组、中剂量组、阳性对照组、大剂量组、空白对照组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。肺纤维化程度比较,由重到轻顺序为模型对照组、小剂量组、阳性对照组、中剂量组、大剂量组、空白对照组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
5、结论
本实验通过对造模后大鼠肺病理形态学观察,BLM致肺纤维化大鼠第1~7d主要以AM和PMN为主的炎性细胞浸润,伴有毛细血管增生,成纤维细胞明显增多,肺泡间隔增宽;第8~21d肺泡结构破坏,肺间质纤维化形成,毛细血管闭塞。其病理特征改变与文献报道一致。
5.1本发明药物对IPF大鼠体重及肺系数变化的影响
IPF大鼠发病过程中,由于肺组织呼吸功能障碍,继发引起机体营养物质消化、吸收出现严重障碍,体内分解代谢大于合成代谢,机体出现生长缓慢。大鼠体重结果显示:空白对照组体重正常增加,模型对照组大鼠伴随肺组织创伤的自我修复,体重增长缓慢,本发明药物组大鼠体重较模型对照组不同程度显著增加,同时改善肺组织受BLM损伤后的炎症增生情况,减轻肺系数,改善实验大鼠的肺脏功能。结果表明:本发明药物对由BLM诱导的机体***脏器损伤修复和一般功能状态的损害具有一定的保护作用。
5.2本发明药物对IPF大鼠BALF中细胞成分的干预
与空白对照组相比,7、14d时模型对照组大鼠BALF中细胞总数均明显升高(P<0.01),以7d时达到高峰,细胞百分构成比发生变化,AM细胞比例下调,PMN上升;14d时细胞总数开始下降,细胞构成比转以LYM和AM比例加大;21dBALF中细胞总数已经恢复至正常水平,可见少量LYM和AM。与模型对照组相比,本发明药物高中剂量组和阳性对照组在恢复细胞百分比,降低PMN,恢复AM百分比上趋势最为显著(P<0.01或P<0.05)。
5.3本发明药物对IPF大鼠的形态学观察
功能与结构是一对相互作用的统一体,异常的结构必然会导致功能的不正常,功能长期处于不正常状态,又会造成严重的结构改变。肺纤维化时组织结构的异常表现为炎症细胞浸润,肺泡结构破坏或消失,肺泡间隔增宽,成纤维细胞增生。本实验从肺脏组织结构及其形态学角度对本发明药物的治疗效果进行观察比较。结果表明,本发明药物治疗后模型大鼠肺部的炎症程度减轻,肺泡结构完整,间质胶原沉淀减少,证实本发明药物能够改善IPF大鼠异常的肺组织结构,从而使功能的改善成为可能。而从肺组织灌洗液细胞成分改变方面来看,本发明药物可改善IPF大鼠肺组织中异常的细胞成分平衡状态,也证实了这一点,说明本发明药物从功能与结构两方面均可以减轻I PF大鼠的肺组织的异常改变。
实验结果显示,在肺纤维化发生的早期阶段,***与本发明药物(大中剂量)均有较好的改善肺泡炎症的作用,对维持肺泡的正常结构以及肺泡实质细胞的结构有很好的作用。但随着疾病的发展,到中后期,本发明药物(大中剂量)的疗效明显好于阳性对照组,说明本发明药物抗纤维化的长期疗效优于阳性对照组,这可能与长期使用***能降低机体免疫力、妨碍机体组织的修复等副反应有关。可见本发明药物是防治肺纤维化的一种有效药物,且呈现一定的量效关系。
试验例2
本发明药物干预肺纤维化大鼠肺组织自由基损伤的实验研究
氧自由基在肺纤维化的发病过程中起着重要的作用。生理条件下,机体内抗氧化酶系如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)以及一氧化氮合成酶(i NOS)能及时调节和清除氧自由基。其中丙二醛(MDA)是细胞脂质过氧化的主要代谢产物,可直接攻击组织生物膜中的不饱和脂肪酸,引起组织氧化损伤与异常修复。细胞外基质代谢紊乱是造成肺纤维化病变的主要病因之一,而肺脏发生疾病时,机体清除活性氧自由基的功能发生障碍,体内活性氧自由基异常增加,从而影响细胞外胶原蛋白等基质的重构。
为了进一步探讨本发明药物抗肺纤维化的作用机制和可能途径,本实验研究了本发明药物对博来霉素A5诱导肺纤维化大鼠肺组织中GSH-Px、SOD、MDA和NO含量的影响。
1、实验材料
GSH-Px、SOD、MDA、NO及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供(批号:GSH-Px为20090721,SOD为20090721,MDA为20090722,NO为20090722,考马斯亮兰为20090725)。
2、实验方法
2.1标本采集
实验动物及分组、模型制作、给药方法同试验例1。
分别于造模后第7、21d,各组分别随机选取10只大鼠,20%乌拉坦腹腔注射麻醉,固定于大鼠实验解剖台上,剪开颈部皮肤并打开胸腔,剥离气管和肺脏,摘取双肺,放入冷生理盐水中漂洗除去浮血,滤纸吸干,取右肺下叶适量组织,在冰浴上剪成碎块,加入9倍预冷的生理盐水,冰浴中快速研磨制成10%组织匀浆,在4℃离心10min,转速为3000r/min,取上清液进行测定,-70℃冷冻保存。
2.2检测方法
严格按照试剂盒说明书步骤,进行GSH-Px及SOD活性、MDA及NO含量的测定。
3、统计学处理
4、结果
4.1大鼠肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量测定
空白对照组大鼠中期和晚期肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量稳定;与空白对照组相比,模型对照组大鼠肺组织中GSH-Px含量均明显降低(P<0.01),其余各组也有不同程度降低,说明模型复制成功;与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组均可显著升高肺纤维化大鼠肺组织中GSH-Px含量(P<0.05)。结果见表2-1。
注:与空白对照组比较:▲P<0.01,△P<0.05;与模型对照组比较:★P<0.01,☆P<0.05;
4.2大鼠肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)含量测定
与空白对照组相比,7、21d时模型对照组大鼠肺组织中SOD含量均明显降低(P<0.01),其余各组大鼠也有不同程度降低,说明模型复制成功。与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组均可显著升高IPF大鼠肺组织中SOD含量(P<0.05),21d时,本发明药物大剂量组的升高作用最为显著(P<0.01)。结果见表2-2。
注:与正常组比较,★P<0.01,☆P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
4.3大鼠肺组织中丙二醛(MDA)含量测定
与空白对照组相比,7、21d时模型对照组大鼠肺组织中MDA含量均明显升高(P<0.01),其余各组也有不同程度升高,说明模型复制成功。与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组均可显著降低PF大鼠肺组织中MDA含量(P<0.05)。结果见表2-3。
注:与正常组比较,★P<0.01,☆P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
4.4大鼠肺组织中一氧化氮(NO)含量测定
与空白对照组相比,7、21d时模型对照组大鼠肺组织中NO含量均明显升高(P<0.01),其余各组也有不同程度增高,说明模型复制成功;与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组可显著降低肺纤维化大鼠肺组织中NO的含量(P<0.05),21d时,本发明药物大剂量组的降低作用最为显著(P<0.01)。结果见表2-4。
注:与空白对照组比较,★P<0.01;☆P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
5、结论
在肺纤维化的形成机理中,氧自由基损伤及其作用机制的研究逐渐受到众多学者的重视。生理条件下,机体内抗氧化酶系如SOD、GSH-Px以及iNOS能及时调节和清除自由基。氧自由基如果释放过多,或是机体清除氧自由基能力下降,氧自由基就会损伤组织细胞,而肺脏是易受损的靶器官之一。因此,在寻求治疗I PF有效药物的研究中,增强机体的抗氧化能力,尤其是清除氧自由基的能力,已成为衡量疗效的标准之一。
肺纤维化发病机制至今尚不清楚,许多实验表明,在肺纤维化发病过程中存在着下呼吸道氧化/抗氧化失衡。活性氧如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质,包括肺泡炎症坏死,肺组织纤维化病变等。有关资料显示:活性氧自由基异常增加可引起细胞内DNA的氢链断裂、碱基降解和主链解旋,所有核酸成分均可受到自由基的攻击,这种损伤可被一些特殊机制修复,但也可造成永久性损伤。所以,当细胞DNA受损伤时,可造成细胞生物学活性改变,甚至导致基因突变、肿瘤与细胞死亡。自由基攻击脱氧核糖时可导致链断裂,但这类损伤可被DNA的修复***所修复,然而,修复过的DNA突变率却远大于正常DNA的突变率。
已有研究证明,活性氧自由基对蛋白质具有明显的损伤效应,在病理情况下,自由基对蛋白质的损伤作用主要是修饰氨基酸残基,引起结构和空间构象变化,导致肽链断裂、聚合与交联。近年来衰老、癌症与辐射损伤时患者血液中存在无活性SOD已有报告,可能是内源性氧自由基损伤SOD结构所致。研究表明,自由基是通过对抗蛋白酶及α1-抗胰蛋白酶结构中的甲硫氨酸残基的特异作用使其失活。许多酶和受体分子上的活性基——巯基是氧自由基攻击的靶基因,自由基和巯基反应,可使酶和受体等的生物学活性降低,功能受损。活性氧还可对生物多糖、透明质酸、不饱和脂肪酸等发生损伤作用,氧自由基使单糖发生自氧化,从而促进蛋白质交联,导致蛋白聚合,可使基底膜增厚,引起一系列疾病发生。不饱和脂肪酸是生物膜磷脂中的重要成分,若它受活性氧攻击,则红细胞、线粒体、微粒体、溶酶体等膜性结构均可被破坏。
活性氧自由基损伤在博莱霉素造模后对肺纤维化的形成起关键性作用。在正常的生理条件下,自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制。但是,当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化-抗氧化***失衡时,组织就会发生不可逆性损伤。目前认为,下呼吸道氧化/抗氧化失衡的发生可能与中性粒细胞等炎性细胞在下呼吸道聚集有密切的关系。当肺组织受到损伤发生炎症时,中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞会聚集在下呼吸道,引起肺脏氧负荷过重,机体清除自由基的功能发生障碍,体内自由基增加,从而引起细胞外基质的正常重构。中性粒细胞可释放大量的氧自由基、花生四烯酸代谢产物和蛋白水解酶等,造成炎症持续和肺组织的损伤。
SOD能清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基,是机体有效清除活性氧的重要抗氧化酶类之一,被称为生物体抗氧化***的第一道防线,它的活性增加,可阻止氧自由基的连锁反应,清除氧自由基,保护细胞免受损伤,因此它可以反映机体清除氧自由基的能力。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解酶,它特异的催化还原型谷胱甘肽等还原性多肽对过氧化氢的还原反应,可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。机体通过酶***与非酶***均可产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和酸和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物,如:醛基、酮基、羟基或新的氧自由基等。氧自由基不但通过生物膜中的多不饱和酸和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤,而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物,引起细胞损伤。MDA是过氧化脂质降解产物,其含量常可反映机体内脂质过氧化的程度。因而测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度。同时,当活性氧过量生成时,体内的防卫功能往往也受到抑制,使SOD等酶的消耗增加,组织中活力降低。
一氧化氮合酶iNOS可以催化左旋精氨酸生成瓜氨酸和NO,是生成NO的关键酶。低浓度的NO能够增强线粒体的还原活性。而高浓度NO则能增加肺部亚硝酸盐的积聚。本实验结果表明,IPF大鼠肺组织中iNOS的活性明显升高,这说明BLM作用于大鼠可以产生NO而参与氧化损伤肺组织。纤维化病人成纤维细胞能合成NO,而正常人成纤维细胞则不能合成NO。这也从另一方面解释肺纤维化病变过程的氧化损伤。用本发明药物治疗肺纤维化大鼠后,肺组织i NOS有一定程度的降低,提示该药在一定程度上能降低NO的生成。
虽然,自由基为正常生命活动的许多重要反应所必须,它参与生物活性物质的合成(如花生四烯酸合成***素),解毒反应,吞噬细胞杀灭细菌的活动等,但是过量的氧自由基对机体具有广泛的损伤效应。
本实验结果显示,本发明药物能不同程度调节大鼠肺纤维化模型体内的自由基代谢,提高模型大鼠体内抗氧化酶GSH-Px与SOD的活性,降低MDA和NO的含量,其中以本发明药物大剂量组效果较好,呈现一定的量效关系。但同模型对照组比较,阳性对照组和本发明药物各剂量组肺组织液中GSH-Px、SOD活性增强均有不同程度的差异(P<0.01或0.05),说明本发明药物能改善体内的自由基代谢,但模型大鼠体内自由基代谢仍存在不同程度的异常。肺纤维化模型大鼠体内GSH-Px与SOD的活性显著降低,MDA与NO含量显著升高,这可能是诱发肺纤维化的病机之一。经过本发明药物治疗后,肺纤维化模型大鼠体内的GSH-Px和SOD活性显著升高,MDA和NO含量显著下降,说明本发明药物能够增加氧自由基清除剂的含量,降低氧自由基代谢产物的损害,达到调节氧化/抗氧化***平衡的作用,对博莱霉素致大鼠肺损伤具有一定的保护作用,从而缓解肺泡炎程度,减轻大鼠肺纤维化病变。
试验例3
本发明药物干预肺纤维化大鼠血清细胞因子表达的实验研究
在肺纤维化的发病机制研究中,各种细胞因子的作用也越来越为学者所重视,进而提出了细胞因子网络的概念。已有研究表明,多种生长因子参与肺炎症反应及肺纤维化过程,其中转化生长因子-β1(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF)等对调控肺成纤维细胞***、增殖及胶原蛋白的合成与降解起十分重要的作用。同时有研究报道,肿瘤坏死因子-a(TNF-a)为肺纤维化中重要的前炎症因子和致纤维化因子,它们通过不同环节,使肺泡纤维母细胞增生,并分泌大量胶原,导致肺纤维化的形成。
TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂之一。肺纤维化发病过程中,炎症和损伤都可以诱导TGF-β1的活化和表达。活化的TGF-β1通过其受体和Smad途径增加细胞外基质的形成,从而进一步诱发肺纤维化。TGF-β1被认为是肺纤维化病理过程中起重要作用的细胞因子之一,在肺纤维化发生的细胞因子网络中占据重要地位。研究表明,TGF-β1在肺纤维化的发生和发展过程中其重要作用。
本发明药物具有抗博来霉素诱发的肺纤维化作用,本实验采用经典夹心法酶联免疫吸附测定实验模型大鼠血清中的含量,观察本发明药物对肺纤维化大鼠细胞因子网络表达的干预情况,从细胞因子的角度进一步探讨本发明药物抗肺纤维化作用的机理。
1、实验材料
TNF-a ELISA试剂盒:批号:20091205;武汉博士德生物技术有限公司;
Rat PDGF ELISA试剂盒:批号:20091205;武汉博士德生物技术有限公司;
TGF-β1 ELISA试剂盒:批号:20091205;武汉博士德生物技术有限公司;
Bio-Tek ELX8000自动酶标仪。
2、实验方法
2.1标本采集
实验动物及分组、模型制作、给药方法同试验例1。
分别于造模后第7、21d随机选取各组10只大鼠,用20%乌拉坦腹腔注射麻醉,固定,暴露腹腔,用5ml注射器于腹主动脉取血4ml,室温静置2h,4℃离心机3000r/min,时间15min,分离血清,存放于-70℃冰箱,待测。
2.2检测方法
TNF-a采用ABC-ELISA法检测,根据试剂盒提供的方法步骤进行反应,终止反应后用酶标仪在450nm处测吸光值(OD),结果与标准曲线比较,确定TNF-a含量。
PDGF采用ELISA法进行检测,将样本血清稀释5000倍,严格按照试剂盒说明书操作步骤进行反应,终止反应后用酶标仪在450nm处测吸光值(OD),结果与标准曲线比较,确定PDGF含量。
TGF-β1采用ABC-ELISA法检测,根据试剂盒提供的方法步骤进行反应,终止反应后用酶标仪在450nm处测吸光值(OD),结果与标准曲线比较,确定TGF-β1含量。
3、统计学处理
4、结果
4.1各实验组大鼠血清在不同时间点的TNF-a含量
空白对照组中期和晚期血清中TNF-a含量基本保持不变;与空白对照组比较,模型对照组在各时间点血清中TNF-a含量均显著增高(P<0.01),本发明药物大中剂量组不同程度增加,说明造模成功;与模型对照组比较,本发明药物大中剂量组大鼠血清中TNF-a的水平显著降低(P<0.05);第8~21d,血清中TNF-a水平有持续降低趋势,具有统计学差异(P<0.01)。详见表3-1。
注:与空白对照组比较,★P<0.01,☆P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
4.2各实验组大鼠血清在不同时间点的PDGF含量
空白对照组中期和晚期血清中PDGF含量波动不大;与空白对照组相比,模型对照组血清中PDGF含量在各时间点均显著增加(P<0.01),阳性对照组、本发明药物大中小剂量组在各时间点上血清PDGF含量均不同程度增加,说明造模成功。与模型对照组相比,本发明药物大中剂量组血清PDGF含量降低有显著性差异(P<0.05)。详见表3-2。
注:与空白对照组比较,★P<0.01,☆P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
4.3各实验组大鼠血清在不同时间点的TGF-β1含量
空白对照组在中期和晚期血清中TGF-β1的含量变动不大;与空白对照组比较,模型对照组中期和晚期血清中TGF-β1含量均显著增高(P<0.01),阳性对照组、本发明药物大中小剂量组中期和晚期血清中TGF-β1含量轻度增加(P>0.05),说明模型复制成功。与模型对照组比较,本发明药物大中小剂量组中期和晚期血清TGF-β1含量具有统计学差异(P<0.05)。详见表3-3。
注:与空白对照组比较,★P<0.01,☆P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;
5、结论
5.1细胞因子与肺间质纤维化
细胞因子在人体内发挥着重要作用,可以介导自然免疫、调节特异性免疫应答、诱导凋亡和刺激造血等。研究表明,细胞因子网络在I PF的发生发展过程中发挥着重要作用,这些细胞因子介质能影响疾病过程中成纤维细胞的活化、增殖及胶原的沉积。
TNF-a又称为前炎症细胞因子,是启动抗菌抗炎的关键因子,在肺纤维化的发生发展过程中起着重要的作用。TNF-a具有多种生物活性,组织损伤后,巨噬细胞募集到损伤组织周围而被激活,释放大量TNF-a,一方面加重炎性反应,另一方面能促进纤维母细胞增生,并分泌大量的胶原,在纤维结合素的共同作用下,形成初期的肺泡炎症,最后导致肺纤维化的形成。
TNF-a也可以诱导肺泡II型上皮细胞分泌多种转化生长因子,加重肺组织损伤和肺间质炎症的病变程度,可以诱导肺成纤维化细胞等靶细胞的增殖与分化。静脉注射TNF-a可引起弥漫性肺泡炎症损伤,以肺泡上皮细胞和内皮细胞坏死为主。TNF-a能间接通过TGF-β1或PDGF诱导途径促进成纤维细胞增生、分化和胶原转录,大量的TNF-a可诱导肺泡上皮细胞凋亡,而肺泡和细支气管上皮细胞凋亡可能会引起肺纤维化反应,Kuwano等在IPF患者肺组织的活检标本中发现细支气管及肺泡上皮细胞中有凋亡标记物。作为一种潜在的前炎症细胞因子,TNF-a一直被认为在肺纤维化中起着重要作用。在肺纤维化患者的血清中,TNF-a的表达明显高于正常人,而用***/***龙治疗后,可明显降低TNF-a的水平,显著改善肺纤维化病人的生存质量。说明TNF-a的异常增加与肺组织损伤及肺纤维化的形成有密切联系。
PDGF是由A链和B链两条多肽链组成的二聚体,通过靶细胞膜上的PDGF受体发挥作用,其主要生物学效应之一是促细胞***,PDGF能刺激多种细胞如血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的***增生,通过刺激胶原合成和胶原酶的活化作用调节胞外基质的更新,最终DNA合成和细胞裂解、增殖。实验早期,博莱霉素对上皮细胞、内皮细胞损伤的同时,也刺激其合成分泌PDGF等细胞因子,早期这些细胞因子的出现可能会有利于上皮细胞、内皮细胞修复。病灶内肺泡巨噬细胞等所产生的PDGF可以穿越受损伤的上皮细胞及其膜屏障而进入肺泡间质,来自肺泡腔以及肺泡间隔内巨噬细胞等产生的PDGF可共同趋化***,促进其增殖、分化。PDGF对成纤维细胞具有强烈的趋化作用和致有丝***活性,它不仅能促进分离的成纤维细胞增殖,而且使其I、III、IV型前胶原合成增加。体内外实验也证实,PDGF能促进肺成纤维细胞增生和胶原蛋白合成。
TGF-β超家族是一类具有生物学活性的多肽,在细胞生长和分化过程中重要作用。在参与肺纤维化的细胞因子中。TGF-β是研究最深入、作用最重要的细胞因子,并被认为是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂。它能作用于多个环节,刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积,抑制基质降解酶的活性以及增加基质降解酶抑制剂的活性。在哺乳动物中,TGF-β有三种亚型,其中TGF-β1是其最早被分离出来,同时也是最重要的亚型。实验性肺纤维化病变中有高水平的TGF-β1,同时伴有I、III型胶原的mRNA表达增高。抗TGF-β1血清可使纤维化肺组织内羟脯氨酸含量减少,肺纤维化程度减轻。研究表明,TGF-β1主要作用于胶原的转录和翻译过程,能诱导前胶原mRNA产生,从而促进胶原蛋白的形成和沉积。提示在肺间质纤维化形成过程中,TGF-β1具有重要作用,通过治疗来降低TGF-β1水平,有助于肺间质纤维化的防治。
目前,大多数学者都认为有众多细胞因子参与了肺纤维化的发生过程,PDGF和TGF-β1是参与肺纤维化的细胞因子网络中比较重要的两个因子,二者之间的关系非常密切。黄群华指出,不同类型细胞的PDGF-a受体对巨噬细胞源性的TGF-β1、IL-1等细胞因子的诱导作用可能产生上调及下调两种不同的结果;而PDGF-β受体则不受以上两种细胞因子的影响。Ludwica从***性硬化病伴间质性肺炎患者肺中分离培养出肌成纤维细胞,先用TGF-β1预处理,再经PDGF刺激,结果发现肌成纤维细胞的有丝***能力增强,他认为这可能是经TGF-β1诱导产生了PDGF-a受体的结果。另外,Gleen等在探讨组织损伤修复的机理时发现,PDGF作为一种有效的趋化因子,对损伤处巨噬细胞、成纤维细胞有较强的趋化作用,并能刺激这些细胞产生内源性生长因子,其中包括TGF-β1,刺激新胶原的合成,从而促进伤口愈合。由此认为,PDGF的作用是通过TGF-β1来实现的。吴浩等的研究表明,PDGF的主要来源是巨噬细胞,在肺纤维化的早、中期发挥重要作用,而TGF-β1主要由***自身产生,在肺纤维化的中、后期发挥重要作用,促细胞外基质合成,使肺纤维化进行性进展。
5.2本发明药物对肺纤维化大鼠模型血清细胞因子网络改变的影响
生理状态下,大鼠血清PDGF和TGF-β1的表达在各时间点变动不大,博莱霉素造模后,7d时PDGF含量达到峰值,第8~21d虽有所降低,但仍处于高水平;7d时TGF-β1的表达开始显著升高,第8~21d仍有所上升,提示PDGF和TGF-β1在博莱霉素致肺纤维化过程中具有重要作用,抑制PDGF和TGF-β1的表达是可能是防治肺纤维化的途径之一。本实验同时观察到,各时间点模型对照组大鼠血清中的TNF-a表达显著高于空白对照组,而在第7d,阳性对照组、本发明药物各组均有显著降低(P<0.01或0.05)血清中TNF-a水平的作用,8~21d时,本发明药物大中剂量组血清中TNF-a仍有明显降低(P<0.01或0.05),而阳性对照组和本发明药物小剂量组却无显著降低(P>0.05)。说明博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中,TNF-a的水平的升高在肺泡炎、肺纤维化发生过程中发挥着重要的作用;本发明药物在早期肺泡炎阶段有与阳性相似的抑制TNF-a分泌的作用,随着疾病的进一步发展,本发明药物大中剂量组的抑制肺纤维化病变效果明显优于阳性对照组,且呈现一定的量效关系。由此推断,本发明药物对肺纤维化大鼠肺组织的保护作用,可能与其能降低血清中TNF-a等致炎、致纤维化的细胞因子表达水平有密切关联。
本发明药物各组在各时间点上均能有效降低血清中PDGF、TGF-β1和TNF-a的水平,对博莱霉素所致肺损伤和纤维化具有防治作用。因此,降低肺纤维化大鼠血清中PDGF、TGF-β1和TNF-a等细胞因子水平可能是本发明药物防治肺纤维化大鼠肺组织病变的机制之一。而且我们还观察到,大剂量组的作用优于小剂量组,在降低TGF-β1的水平方面,大剂量组的作用还优于中剂量组,似乎呈一定的量效关系,有待于以后的进一步研究。
试验例4
为进一步考察本发明药物的临床疗效和安全性,选择了44例特发性肺纤维化患者对本发明药物的疗效进行临床观察。
临床资料
44例患者中,男25例,女19例,年龄48~82岁,平均(65.1±8.99)岁,均符合中华医学会呼吸病学分会2002年4月制定的特发性肺(间质)纤维化诊断和治疗指南(草案):1)隐匿起病或进行性呼吸困难为主症,或伴有干咳;2)肺部特征性吸气性velcro音;3)杵状指和/或紫绀;4)胸部高分辨CT表现为双下肺和胸膜下为主的网状改变或伴蜂窝样改变,可伴有极少量磨砂玻璃样阴影。5)肺功能示限制性通气障碍和/或弥散性功能障碍,动脉血气示低氧血症或运动后低氧血症;6)肺活体组织检查示肺间质病变。具有1)、2)、4)、5)项即可做出临床诊断。其中通过纤支镜肺活检(TBLB)确诊1例,其余均为临床诊断。自发病到就诊时间最短3个月,最长5年。进入试验的患者均为初次就诊或诊断明确但未正规治疗。
将病人随机分为治疗组和对照组,治疗组26例,男15例,女11例,平均年龄66.1岁;对照组18例,男10例,女8例,平均年龄64.6岁;两组治疗前年龄、性别、病情均衡比较差异无显著性(P>0.05)。
治疗方法
治疗组:给予本发明实施例2胶囊剂,每日3次,每次4粒,口服,连续服用两个月,共60d。
对照组:给予***0.5mg·kg(理想体重)口服4周;然后每日0.25mg·kg(理想体重)口服8周,之后减量至每日0.125mg·kg(理想体重)口服,维持1~1.5年,但试验观察两个月。
两组患者有低氧血症者给予吸氧,并发肺部感染者应用抗生素控制感染。
疗效评价
两组患者治疗前及治疗后3个月主要监测呼吸困难等症状,以胸部影像学评价临床治疗效果。参照《特发性肺(间质)纤维化诊断和治疗指南(草案)》的疗效标准评定疗效。
1、显效治疗3个月后,如果符合下列2个或2个以上条件则认为显效。
1)症状减轻(咳嗽、呼吸困难);2)X线或HRCT显示肺间质改变减轻;3)肺功能改善:符合下列2个或2个以上条件,TLC或VC增加≥10%,SaO2上升≥4%,PaO2运动时上升≥4mmHg。
2、有效治疗3个月后符合下列2个或2个以上条件,则认为治疗有效。
1)TLC或VC增加<10%,SaO2上升<4%,PaO2运动时上升<4mmHg。
3、无效治疗3月后,如出现下列情况,则认为治疗无效或失败。
1)症状加重(咳嗽、呼吸困难);2)胸部X线或HRCT显示肺间质改变加重,尤其出现蜂窝肺或肺动脉高压征象;3)肺功能恶化,符合下列2个或2个以上条件,TLC或VC下降≥10%,SaO2下降≥4%或AaDO2≥4mmHg。
疗效观察
对两组患者治疗后的疗效进行比较,结果见表4-1、4-2。
表4-1治疗前后两组患者症状疗效比较
注:1)与对照组比较(采用Ridit分析),u=3.3678,P=0.0009。
由表4-1可知,治疗组显效15例,有效8例,总有效率88.5%,95%CI(95%可信区间)=63.8%~98.7%;对照组显效3例,有效3例,总有效率33.3%,95%CI=11.5%~55.1%;两组综合疗效比较u=3.3678,P=0.0009,差异有非常显著性意义,且两组总有效率的95%C I不重叠。治疗组无效患者的相对危险性是对照组的0.07倍(OR为比数比,可看作为相对危险性,其95%CI=0.01~0.31);治疗组每治疗2人,可较对照组减少1例无效患者(NNT为净治疗人数),其95%可信区间为1.20~3.75。
表4-2治疗前后两组患者血沉、肝功变化
注:与对照组治疗后比较,1)t=-2.1815,P<0.05;2)t=-3.1722、-2.7579,P<0.01。
治疗组治疗前后血沉变化有显著性差异(t′=5.7493,P<0.001),而对照组治疗前后不显示显著性差异(t′=0.5094,P>0.05);治疗后两组有显著性差异(t=-2.1815,P<0.05)。临床中可以引起血沉加快的疾病很多,如风湿热、急性传染病、肺炎、胆囊炎、白血病、心肌梗死以及一些恶性肿瘤等等,所以血沉测定不是疾病的特异性检验方法,但可以用来大致推测疾病的发展及观察治疗效果,且据研究资料显示,血沉与免疫反应具有相关性。该观察显示,治疗组对免疫反应具有显著的抑制作用,提示该疾病的机理可能与免疫反应有关,治疗药物的作用机理也可能与调节免疫反应有关。本发明药物治疗特发性肺纤维化的过程中,血沉的变化确实反映了疾病的变化和治疗效果,这在诊治指南中未有提及。
肝功两项中,治疗组ALT治疗前后无显著性差异(t′=0.6599,P>0.05),AST治疗前后有显著性差异(t=2.1478,P<0.05),而临床意义并不大,说明:1)本发明药物具有良好的安全性。2)ALT与AST均反映细胞膜的完整性,前者与肝细胞有关,后者与肝外细胞有关。该观察中ALT与AST呈分离的状态,说明本发明药物对肝细胞无损害,疾病与肝细胞无关,AST显著下降,说明病变在肝细胞之外,病变与细胞膜的稳定性有关,这些反应也说明,疾病与免疫反应有关。免疫反应既破坏细胞膜的稳定性,也可使血沉加快,经本发明药物治疗后,血沉与AST显著下降,均与稳定细胞膜、抑制免疫反应相关。该观察显示本发明药物的作用环节是稳定细胞膜与抑制免疫反应兼有,即在多水平、多层次、多靶点对疾病加以干预。
另外,胸部X线或HRCT显示,治疗前双侧肺纹理增多、紊乱,双肺野透亮度明显减低,呈磨玻璃样、云雾状甚或蜂窝肺改变,有的还伴有肺气肿、双侧胸膜增厚以及少量胸腔积液。在治疗后,虽然双肺仍见纹理增多、紊乱,但磨玻璃样、云雾状甚或蜂窝状改变明显减轻、有的减轻十分明显,并且都往双下肺、靠近胸膜处局限,胸膜增厚的变化改善明显,胸腔积液全部吸收;肺气肿的改善对于病程短的可以全部不见,而病程较长者没有明显改变。
临床疗效观察结果显示,本发明药物对于间质性肺疾病尤其是特发性肺纤维化有明显的治疗作用,总有效率达到88.5%,与对照组相比有显著性差异,在改善症状、提高患者生存质量、延长生命方面显示出独特的优势。此外,本发明药物与糖皮质激素均可改善血沉,而本发明药物更显著,两者之间有显著性差异。本发明药物在用药期间未出现异常不适,且用药前后血、尿、便及肝肾功能化验无明显变化,临床疗效观察结果显示本发明药物安全、有效,值得临床推广应用。
英文缩略词表
缩写 | 全称 | 中文 |
IPF | Idiopathic pulmonary fibrosis | 特发性肺纤维化 |
BLM | Bleomycin | 博莱霉素 |
ELISA | Enzyme-linked immunoadsordent assay | 酶联免疫吸附分析 |
TNF-a | Tumor necrosis factor-a | 肿瘤坏死因子-a |
IL | Inerlenkin | 白细胞介素 |
SOD | Superoxide dismutase | 超氧化物歧化酶 |
GSH-Px | Glutathione peroidase | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
MDA | Maleic dialdehyde | 丙二醛 |
PDGF | Platelet-derived growth factor | 血小板源性生长因子 |
TGF | Transforming growth factor | 转化生长因子 |
PF | Pulmonary fibrosis | 肺纤维化 |
AT-II | Alveolar type II cell | 肺泡II型上皮细胞 |
PBS | Phosphate buffered saline | 磷酸缓冲生理盐水 |
AM | Alveolar macrophase | 肺泡巨噬细胞 |
LMY | Lymphocyte | 淋巴细胞 |
IFN | Interferon | 干扰素 |
HE | Haematoxylin-Eosin | 苏木素-伊红染色法 |
iNOS | nitric oxide synthetase | 一氧化氮合成酶 |
PMN | polymorphonuclear | 中性粒细胞 |
Claims (7)
1.一种治疗特发性肺纤维化的药物,是由以下重量份数的中药为原料药:
按照下述方法制备获得:半夏粉碎成细粉;五味子和桔梗以80wt%乙醇溶液提取三次,收集药渣,合并乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;柴胡与干姜粉碎,以水蒸气提取法收集挥发油,收集水提液,挥发油用饱和水溶液法制成挥发油β环糊精包合物;取瓜蒌仁、桂枝、黄芩、党参、炙甘草、天花粉、香附、生姜、大枣,加入五味子和桔梗醇提后药渣、柴胡与干姜提取挥发油后水提液,加水煎煮两次,合并两次煎液,过滤,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥,粉碎,得干浸膏2;合并干浸膏1和干浸膏2,加入半夏细粉和挥发油β环糊精包合物,混合均匀,得到药物活性组分。
3.权利要求1或2所述治疗特发性肺纤维化的药物的制备方法,包括以下步骤:
a)将所述重量份数的半夏粉碎成细粉,备用;
b)将所述重量份数的五味子和桔梗以80wt%的乙醇溶液提取三次,收集药渣备用,合并乙醇提取液,回收乙醇并浓缩至无醇味,得干浸膏1;
c)将所述重量份数的柴胡与干姜粉碎后,以水蒸气提取法收集挥发油,收集水提液备用,所得挥发油用饱和水溶液法制成挥发油β环糊精包合物;
d)取所述重量份数的瓜蒌仁、桂枝、黄芩、党参、炙甘草、天花粉、香附、生姜和大枣,加入步骤b)的药渣、步骤c)的水提液,加水煎煮两次,合并两次煎液,过滤,浓缩至60℃相对密度1.05,离心,取上清液,减压浓缩至60℃相对密度1.25~1.28,干燥,粉碎,得干浸膏2;
e)合并干浸膏1和干浸膏2,加入所述半夏细粉和挥发油的β环糊精包合物,混合均匀,得到药物活性组分。
4.根据权利要求3所述的治疗特发性肺纤维化的药物的制备方法,其特征是其中步骤b)中以乙醇溶液提取药物时,第一次提取1.5小时,第二、三次提取1小时。
5.根据权利要求3所述的治疗特发性肺纤维化的药物的制备方法,其特征是步骤d)中加水煎煮药物时,每次加水为药物的8倍重量,煎煮1.5小时。
6.根据权利要求3所述的治疗特发性肺纤维化的药物的制备方法,其特征是所述挥发油的水蒸气提取是将药物粉碎,过24~35目筛,加入8倍药物重量的水浸泡1h,提取8h,收集挥发油。
7.根据权利要求3所述的治疗特发性肺纤维化的药物的制备方法,其特征是所述挥发油β环糊精包合物的制备是按照β环糊精∶挥发油=8∶1、β环糊精∶水=1∶6的重量配比,将挥发油与β环糊精、水在35℃下搅拌1h,分离得到挥发油β环糊精包合物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010531346A CN101991832B (zh) | 2010-10-30 | 2010-10-30 | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010531346A CN101991832B (zh) | 2010-10-30 | 2010-10-30 | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101991832A CN101991832A (zh) | 2011-03-30 |
CN101991832B true CN101991832B (zh) | 2012-09-26 |
Family
ID=43782909
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201010531346A Expired - Fee Related CN101991832B (zh) | 2010-10-30 | 2010-10-30 | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101991832B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105395825A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-03-16 | 浙江锦天生物科技有限公司 | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法与用途 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103055287B (zh) * | 2012-12-27 | 2018-12-07 | 长春中医药大学 | 一种治疗间质性肺疾病的中药组合物 |
CN103920114B (zh) * | 2014-03-31 | 2017-01-18 | 李树民 | 一种治疗肺纤维化的中药组合物 |
CN105497710A (zh) * | 2014-10-28 | 2016-04-20 | 程学来 | 一种治疗肺囊性纤维化的中药 |
CN108452173B (zh) * | 2018-06-01 | 2021-03-23 | 江苏省中医院 | 用于治疗特发性肺纤维化的中药复方及其制备方法和应用 |
CN112386672A (zh) * | 2019-08-13 | 2021-02-23 | 中日友好医院 | 一种治疗间质性肺疾病的中药组合物及其应用 |
CN111450086B (zh) * | 2020-05-30 | 2022-12-09 | 江西北正人体组织样本库有限公司 | 一种栝楼酯碱的抗肺纤维化用途 |
CN111494454B (zh) * | 2020-06-16 | 2022-06-24 | 北京东方运嘉科技发展有限公司 | 一种治疗间质性肺病的药物组合物 |
CN112568188B (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-25 | 澎立生物医药技术(上海)有限公司 | 一种制作Brown Norway大鼠肺纤维化模型的方法 |
CN114344387B (zh) * | 2022-01-25 | 2022-11-29 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物及其应用 |
CN115804829B (zh) * | 2022-11-11 | 2023-12-12 | 广州国家实验室 | S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶抑制剂在改善肺纤维化血管新生中的应用 |
CN115845021B (zh) * | 2023-01-13 | 2023-10-13 | 浙江省人民医院 | 一种用于预防和治疗肺纤维化的中药组合物及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1742939A (zh) * | 2005-09-29 | 2006-03-08 | 济南宏济堂制药有限责任公司 | 一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法 |
CN101229232A (zh) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | 北京琥珀光华医药科技开发有限公司 | 一种用于治疗肺纤维化的中药制剂 |
CN101543574A (zh) * | 2009-05-07 | 2009-09-30 | 北京师范大学 | 一种治疗肺间质纤维化的中药组合物 |
-
2010
- 2010-10-30 CN CN201010531346A patent/CN101991832B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1742939A (zh) * | 2005-09-29 | 2006-03-08 | 济南宏济堂制药有限责任公司 | 一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法 |
CN101229232A (zh) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | 北京琥珀光华医药科技开发有限公司 | 一种用于治疗肺纤维化的中药制剂 |
CN101543574A (zh) * | 2009-05-07 | 2009-09-30 | 北京师范大学 | 一种治疗肺间质纤维化的中药组合物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘秋杨.肺间质纤维化的中医药研究进展.《中国社区医师》.2007,第9卷(第177期),8-9页. * |
谭漪 等.肺间质纤维化的中医治法.《四川中医》.2008,第26卷(第5期),19-20页. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105395825A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-03-16 | 浙江锦天生物科技有限公司 | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法与用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101991832A (zh) | 2011-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101991832B (zh) | 一种治疗特发性肺纤维化的药物及其制备方法 | |
CN102266508B (zh) | 一种用于治疗干燥综合症的中药组合物及制备方法和应用 | |
CN104547361A (zh) | 一种药物组合物及其制备方法、制剂与应用 | |
CN101843840B (zh) | 一种治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的中药复方颗粒 | |
CN101601743A (zh) | 一种治疗溃疡性结肠炎的药物组合物及其制备方法 | |
CN117137998A (zh) | 一种用于治疗阴虚湿热型病毒性感染和肺结节的药物组合物及其制剂和应用 | |
CN102370738A (zh) | 一种防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂及制备方法 | |
CN105770679A (zh) | 防治口腔真菌感染的中药漱口液 | |
CN105663728A (zh) | 一种治疗结直肠癌的中药复方制剂及其制备方法 | |
CN105056128A (zh) | 一种治疗慢性萎缩性胃炎及肠化的中药组合物及制备方法和应用 | |
US10772933B2 (en) | Medicament for treating pulmonary tuberculosis | |
WO2021179881A1 (zh) | 中药组合物在制备用于防治冠状病毒合并肺损伤药物中的应用 | |
CN103920044A (zh) | 一种治疗尿道结石的药物及制备方法 | |
KR20030027208A (ko) | 생약을 함유하는 관절염 치료용 조성물 및 그 제조방법 | |
WO2017152834A1 (zh) | 一种雪柳叶层孔菌及其在制备药物中的用途 | |
CN107029084A (zh) | 一种治疗结直肠癌前病变的中药组合物及其药物制剂与应用 | |
CN1148217C (zh) | 治疗慢性支气管炎的中成药 | |
CN104337901A (zh) | 一种治疗非特异性膀胱炎的中药制剂及其制备方法 | |
CN104873781A (zh) | 一种治疗痰热蕴肺型慢性支气管炎的中药及制备方法 | |
CN107693593B (zh) | 一种防治冠心病的中药组合物 | |
CN103800361B (zh) | 一种治疗炎症性肠病的药物组合物及制备方法和用途 | |
CN115845021B (zh) | 一种用于预防和治疗肺纤维化的中药组合物及其制备方法 | |
CN104069173B (zh) | 治疗肝脏疾病的药物组合物及其制备方法 | |
CN116350732B (zh) | 用于治疗特发性肺纤维化缓解期的中药制剂及其制备方法 | |
CN117180379B (zh) | 一种治疗气虚毒滞型桥本甲状腺炎的中药组合物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120926 Termination date: 20161030 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |