CN101984827B - 助植物生长菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及微生物的一种助植物生长菌剂及其制备方法。属微生物菌剂的制备技术。一种助植物生长的菌剂，其主要特点在于由酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌和液体培养基组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌为25～40％、胶质芽孢杆菌为15～30％、巨大芽孢杆菌15～30％，圆褐固氮菌为15～30％、康氏木霉菌为15～30％，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461。本发明的优点是发明人经过试验，在灰钙土或盐碱土盆栽生长期观察中，施用了本发明的菌剂试验组与对照组不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。在灰钙土或盐碱土盆栽根系观察中，试验组与对照组不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。
Description
技术领域：
本发明主要涉及微生物的一种助植物生长菌剂及其制备方法。属微生物菌剂的制备技术。
背景技术：
国内已有多种用于植物生长的微生物菌剂，如日本的EM，神力CM，VT等，但用原生质体融合技术制备的基因工程菌株与胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌复合制备菌剂的方法并能助植物快速生长的菌剂的技术目前尚属空白。
发明内容：
本发明的目的在于避免现有技术不足而提供一种助植物生长菌剂及其制备方法。尤其是用原生质体融合技术制备的基因工程菌株与胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌复合制备微生物菌剂的方法。
使用基因工程菌与胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌科学配伍的培养基的原料是，以新鲜的豆腐或粉丝或玉米淀粉或洋芋淀粉的废水或麸皮、玉米浆混合液为原料，添加少量无机盐制备。该方法是利用食品、轻工业产生的废液为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其菌剂，可用于液体微生物肥料，也可作为微生物固体肥料和有机堆肥的微生物菌种接种剂。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案实现：一种助植物生长的菌剂，其主要特点在于由酵母融合菌(Fusant between candida tropicalisand saccharomycescerevisiae)F306、胶质芽孢杆菌(Bacillus megterium)B.me-8、巨大芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)B.mu-36、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)A.c-6、康氏木霉菌(T.reesi)T.r-12和液体培养基组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌为25～40％、胶质芽孢杆菌为15～30％、巨大芽孢杆菌15～30％，圆褐固氮菌为15～30％、康氏木霉菌为15～30％，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461。
所述的助植物生长的菌剂，所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5。
所述的助植物生长的菌剂的制备方法，其有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：葡萄糖0.8-1.2％、蛋白胨0.8-1.2％、琼脂1.8-2.2％、酵母膏0.3-0.8％，氯化钠0.8-1.2％，无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至6.2-7.2，经110-114℃，28-32分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 6.2-7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为酵母融合菌为25～40％、胶质芽孢杆菌为15～30％、巨大芽孢杆菌15～30％，圆褐固氮菌为15～30％、康氏木霉菌为15～30％三级菌种再扩大培养，五种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌混合菌剂，即为四级菌种，根据需要可继续逐级扩大培养，也可作为产品应用。所述的助植物生长菌剂的制备方法，所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1：1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，涂布于高渗基础型培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
所述的助植物生长菌剂的制备方法，所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
本发明的有益效果：发明人经过试验，在灰钙土和盐碱土盆栽生长期观察中，施用了本发明的菌剂试验组与对照组不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。在灰钙土和盐碱土盆栽根系观察中，试验组与对照组不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。
发明人采用先进的单亲灭活原生质体融合技术，对热带假丝酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵母(Saecharomyces cervsiar)2.399两亲本菌株做融合，构建新的基因工程菌，这些融合菌即具有双亲的生物特性，又具有优于双亲的活性酶，絮凝性和耐高温的生物特性。能充分利用豆腐、粉丝和玉米洋芋淀粉废水中有机物的营养物质进行生长繁殖，利用2008年04月21日，地址是在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2461的酿酒酵母F306(Saccharomyces cerevisiae)配伍胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌五菌组合，胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌具有适应性强、耐受性好，能将土壤中的不溶性磷和钾元素转化为有效磷和速效钾供植物生长；芽孢杆菌具有易生长，抗逆性强，适应广，不但能助植物生长，而且可增强植物的抗病虫害能力；康氏木霉菌能分泌纤维素酶可将土壤中的纤维素转化为淀粉和糖，为植物生长提供营养，经科学配比和独特的发酵工艺，使其菌群在生长过程中产生的有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基料和原料，通过相互间的共生增殖关系，形成了一个复杂而稳定的微生态***，发挥了多功能的优势。
酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌在新鲜的豆腐、粉丝、玉米、洋芋淀粉产生的废水中，添加少量的无机盐，直接发酵制备液体菌剂，既节省了培养基的原料，减少原料配制和高压灭菌的工序，节省了能源，也解决了这些行业治污的难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。
酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌菌剂即可作为植物生长剂，也可作为有机废水处理净化剂，还可作为生物絮凝剂，表面活性剂，生物吸附剂等应用于石油开采、食品工业、环境工程、医疗和精细化工等行业，具有较广的应用价值。
附图说明：
图1为本发明的制备工艺流程示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
见图1，实施例1
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO40.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于15×1.5cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO40.5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜豆腐废水不灭菌，将重量百分比为酵母融合菌为40％、胶质芽孢杆菌为15％、巨大芽孢杆菌15％，圆褐固氮菌为15％、康氏木霉菌为15％五菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其发酵液即为F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌液体菌剂，活细胞数为1.0～2.0×109个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例2
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜粉丝废水100ml，加入(NH4)2SO40.1g，H3PO40.05ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜粉丝废水1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜粉丝废水10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为酵母融合菌为25％、胶质芽孢杆菌为30％、巨大芽孢杆菌15％，圆褐固氮菌为15％、康氏木霉菌为15％五菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌液体菌剂，活细胞数为0.8～1.8×109个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例3
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO40.1g，H3PO40.05ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌于试管液体培养 基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为酵母融合菌为35％、胶质芽孢杆菌为15％、巨大芽孢杆菌20％，圆褐固氮菌为15％、康氏木霉菌为15％五菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×109个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例4
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至6.2～7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为酵母融合菌为25％、胶质芽孢杆菌为15％、巨大芽孢杆菌15％，圆褐固氮菌为30％、康氏木霉菌为15％五菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×109个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例5
一种酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇(PEG)的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)液反复冲洗，涂布于高渗基础培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
实施例6，酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌液体菌剂在以灰钙土和盐碱土为试验土壤的试验效果。
用苜蓿种籽做盆栽试验，经三次重复其结果见表1、表2、表3、表4和表5：
表1
| 项目 | 试验处理 |
| 试验组 | 生长期间施用本发明菌剂 |
| 对照 | 生长期间不施用菌剂 |
表2 灰钙土盆栽生长期观察
| 项目 | 出苗时间 (d) | 出苗率 (％) | 三叶期 (d) | 苗高 (cm) |
| 试验组 | 3 | 94 | 18 | 6.2 |
| 对照 | 4 | 84 | 21 | 4.5 |
试验与对照不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。
表3盐碱土盆栽生长期观察
| 项目 | 出苗时间 (d) | 出苗率 (％) | 三叶期 (d) | 苗高 (cm) |
| 试验组 | 4 | 66 | 20 | 3.2 |
| 对照 | 6 | 20 | 25 | 2.5 |
试验与对照不论出苗时间、出苗率、三叶期、苗高均有显著提高。
表4灰钙土盆栽苜蓿根系观察
| 项目 | 根系长度 (cm) | 根系数 (根) | 体积 (cm3) | 鲜重 (Kg) |
| 试验组 | 7.9 | 7 | 0.00002 | 0.01314 |
| 对照 | 4.8 | 4 | 0.00001 | 0.00726 |
试验与对照不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。
表5盐碱土盆栽苜蓿根系观察
| 项目 | 根系长度 (cm) | 根系数 (根) | 体积 (cm3) | 鲜重 (Kg) |
| 试验组 | 4.2 | 7 | 0.000008 | 0.00811 |
| 对照 | 3.2 | 4 | 0.000006 | 0.00521 |
试验与对照不论根系长度、根系数、体积、鲜重均有显著差异。
Claims (5)
1.一种助植物生长的菌剂，其特征在于由酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌和液体培养基组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌为25～40％、胶质芽孢杆菌为15～30％、巨大芽孢杆菌15～30％，圆褐固氮菌为15～30％、康氏木霉菌为15～30％，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461。
2.如权利要求1所述的助植物生长的菌剂，其特征在于所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5。
3.如权利要求1所述的助植物生长的菌剂的制备方法，其特征在于有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：葡萄糖0.8-1.2％、蛋白胨0.8-1.2％、琼脂1.8-2.2％、酵母膏0.3-0.8％，氯化钠0.8-1.2％，无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至6.2-7.2，经110-114℃，28-32分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 6.2-7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为酵母融合菌为25～40％、胶质芽孢杆菌为15～30％、巨大芽孢杆菌15～30％，圆褐固氮菌为15～30％、康氏木霉菌为15～30％三级菌种再扩大培养，五种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌、康氏木霉菌混合菌剂，即为四级菌种，然后继续逐级扩大培养。
4.如权利要求3所述的助植物生长菌剂的制备方法，其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，涂布于高渗基础型培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
5.如权利要求4所述的助植物生长菌剂的制备方法，其特征在于所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
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