CN101973640A - 一种孔雀石绿染料废水的处理方法 - Google Patents

Abstract

一种孔雀石绿染料废水的处理方法，经细菌纤维素膜的制备、细菌纤维素膜的改性处理、改性细菌纤维素膜对白腐菌的固定化，将得到的固定化白腐菌改性细菌纤维素膜，加到50mL孔雀石绿染料废水中，取20～40mg孔雀石绿，溶于1L白腐菌液体限制性培养基中，于28℃下在气浴恒温摇床上以120rpm处理5天，每隔24小时测定废水的色度，5天后，弃掉处理后的废水，保留固定化菌，再加入50mL新配制的相同浓度的染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，废水色度的去除率始终为86％以上。所涉及的木醋杆菌、白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

Description

一种孔雀石绿染料废水的处理方法

技术领域

本发明属于应用微生物与环境工程技术领域，涉及利用一种新型固定化载体固定化微生物处理染料废水的方法。尤其涉及利用固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜处理孔雀石绿染料废水。

背景技术

孔雀石绿是一种有毒的三苯甲烷类化学物，由苯甲醛和N，N-二甲基苯胺在盐酸或硫酸中缩合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隐性碱体后，在酸介质中被二氧化铅秘氧化制得。目前，孔雀石绿染料废水的处理主要采用光催化氧化法、微波法、铁氧电池法及硅藻土多孔陶瓷法等，但这些方法存在成本高、周期长、操作稳定性差、容易引起二次污染等缺点。

自然界中白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)是一种重要的生物资源，能够降解多环芳香烃类和毒性较大的有机污染物。白腐菌在处理染料过程中会产生胞外过氧化物酶如木素过氧化物酶LiP和锰过氧化物酶MnP等，这些酶具有底物非特异性等特殊性能，并能引发一系列的自由基反应，从而对染料进行脱色、降解和矿化。

虽然白腐菌有诸多优点，但其在悬浮培养降解体系中还存在处理效率低，酶***稳定性差，抗逆性、抗毒性、抗高负荷能力差、固液分离困难等问题。

固定化白腐菌常用的方法有包埋法、吸附法等，常用的固定化载体有木屑、聚氨酯泡沫、活性炭、聚乙烯醇、海藻酸钙。但上述载体存在很多问题，如制备过程较复杂、固定化效率低、操作稳定性差、废弃后易对环境造成二次污染。

发明内容

本发明的目的：通过对木醋杆菌产生的细菌纤维素膜进行改性处理，使其成为固定化微生物的优良载体，进而用于固定化白腐菌，建立一种处理孔雀石绿染料废水的简单、有效的方法，被改性细菌纤维素膜固定化的白腐菌在对孔雀石绿染料废水处理过程中活性更加稳定，抗干扰能力更强，载体持久、耐用，能够重复使用多次。

一种孔雀石绿染料废水的处理方法，是由如下的过程和步骤组成：

(1)细菌纤维素膜的制备

将保存在斜面上的菌株编号为CGMCC NO：1.1812的木醋杆菌Gluconacetobacterxylinum接入到50mL种子培养基中，所述的种子培养基中各组分用量占种子培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；气浴恒温摇床上以160rpm培养2天，得到活化好的木醋杆菌培养液，取此木醋杆菌培养液10mL接入到125mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；30℃静置培养7天，在液面生成淡黄色胶质膜，将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液中，80℃煮沸60min，去除菌膜内部的菌体和残留培养基，然后用蒸馏水反复冲洗至中性，得到细菌纤维素膜；

上述木醋杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC NO：1.1812；

(2)细菌纤维素膜的改性处理

将40～60g步骤(1)得到的细菌纤维素膜加入到100～180mL的1mol/L氢氧化钠溶液中，再加入20～40mL环氧氯丙烷，于60℃恒温水浴反应30～60min后，取出膜用丙酮洗涤；水洗后，再加入5.5～9mL的乙二胺和49.5～81mL的蒸馏水；充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热30～60min，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤3遍后，蒸馏水洗至中性，再经丙酮润洗后，真空干燥至恒重，得到改性后的细菌纤维素膜；

(3)改性细菌纤维素膜对菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的固定化

将6～9g步骤(2)得到的改性细菌纤维素膜加入到80～105mL的pH＝7.0、浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液中，再加入6～7mL 25％重量百分含量的戊二醛水溶液；于40℃下轻微搅拌反应30～60min，取出膜依次用蒸馏水和0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液洗涤，然后真空干燥；干燥后的细菌纤维素膜加入到110～130mL的白腐菌液体限制性培养基中，所述的白腐菌液体限制性培养基中各组分用量分别为：KH₂PO₄2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.25g/L；MnSO₄0.5mg/L；无水FeSO₄0.1g/L；NaCl 1.0mg/L；NH₄NO₃2g/L；CaCl₂0.1g/L；葡萄糖15g/L；VB₁5.0mg/L；pH＝6.0～7.0；灭菌后再加入12～15mL白腐菌孢子液；于28℃，120rpm摇床上培养48小时，取出膜后用无菌水反复冲洗三次，此时膜表面形成了一层薄薄的白色菌膜，得到固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜；

上述白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC NO：5.776；

(4)固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜对孔雀石绿染料废水的处理

将1～2g步骤(3)得到的固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜，加入到50mL孔雀石绿染料废水中，上述孔雀石绿染料废水的制备过程如下：称取20～40mg孔雀石绿，溶于1L上述步骤(3)所述的白腐菌液体限制性培养基中，得到孔雀石绿染料废水；于28℃下，在气浴恒温摇床上以120rpm处理5天，每隔24小时测定染料废水的色度，5天后，弃掉处理后的染料废水，保留固定化菌，再加入50mL新配制的相同浓度的染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定染料废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，染料废水色度的去除率始终维持在86％以上。

本发明与现有技术相比存在显著的进步和积极的效果：

①本发明为细菌纤维素膜应用提供了新的思路和途径。

②改性后的细菌纤维素膜韧性提高，耐腐蚀能力增强，并且减小了载体本身对白腐菌处理孔雀石绿染料废水效果的干扰。

③固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜处理孔雀石绿染料废水的方法具有可操作性，并且操作简单，处理效果明显及稳定性好，受环境影响小。

④改性细菌纤维素膜废弃后能被环境微生物降解，并成为植物生长的肥料不会造成二次污染。

具体实施方式

实施例1

白腐菌孢子液的制备：

从保存菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的斜面上挑取少量菌体，划线法接种到固体培养基上，所述的固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：马铃薯葡萄糖琼脂3.8％；KH₂PO₄0.3％；MgSO₄·7H₂O 0.15％，30℃培养5天后，白腐菌孢子菌丝大量扩增，向平皿中注入少量无菌水，以推棒法刮下孢子粉，经4层擦镜纸滤去菌丝体，得到的乳白色孢子悬浮液即为白腐菌孢子液，4℃冰箱保存备用；

上述步骤中白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCCNO：5.776。

实施例2

细菌纤维素膜的制备：

将保存在斜面上的菌株编号为CGMCC NO：1.1812的木醋杆菌Gluconacetobacterxylinum接入到50mL种子培养基中，所述的种子培养基中各组分用量占种子培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；气浴恒温摇床上以160rpm培养2天，得到活化好的木醋杆菌培养液，取此木醋杆菌培养液10mL接入到125mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；30℃静置培养7天，在液面生成淡黄色胶质膜，将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液中，80℃煮沸60min，去除菌膜内部的菌体和残留培养基，然后用蒸馏水反复冲洗至中性，得到细菌纤维素膜。

上述步骤中木醋杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCCNO：1.1812；

实施例3：

细菌纤维素膜的改性处理：

取细菌纤维素膜40g放入100mL的1mol/L氢氧化钠溶液中，再加入20mL的环氧氯丙烷，于60℃恒温水浴反应30min后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物；水洗后，再加入5.5mL的乙二胺和49.5mL蒸馏水，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热30min，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤3遍后，蒸馏水洗至中性，再经丙酮润洗后，真空干燥至恒重，此时膜的柔韧性变强，表面呈淡黄色，光滑，有光泽，此即为改性后的细菌纤维素膜；

改性细菌纤维素膜对菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的固定化：

取6g上述步骤得到的改性细菌纤维素膜放到含有80mL的磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)的锥形瓶中，再加入6mL 25％重量百分含量的戊二醛水溶液，40℃轻微搅拌反应30min，取出膜依次用蒸馏水和磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)洗涤，然后真空干燥；将上述戊二醛处理后的细菌纤维素膜放到含有110mL白腐菌液体限制性培养基的锥形瓶中，所述的白腐菌液体限制性培养基中各组分用量分别为：KH₂PO₄2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.25g/L；MnSO₄0.5mg/L；无水FeSO₄0.1g/L；NaCl 1.0mg/L；NH₄NO₃2g/L；CaCl₂0.1g/L；葡萄糖15g/L；VB₁5.0mg/L；pH＝6.0～7.0(以下实施例中白腐菌液体限制性培养基组成相同)；灭菌后再加入12mL实施例1得到的白腐菌孢子液，于28℃，120rpm摇床上培养48小时，取出膜后用无菌水反复冲洗三次，此时细菌纤维素膜表面形成了一层薄薄的白色菌膜，即为固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜。

实施例4：

细菌纤维素膜的改性处理：

取细菌纤维素膜50g放入150mL的1mol/L氢氧化钠溶液中，再加入30mL的环氧氯丙烷，于60℃恒温水浴反应45min后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物；水洗后，再加入8.5mL的乙二胺和76.5mL蒸馏水，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热45min，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量盐酸洗涤3遍后，蒸馏水洗至中性，再经丙酮润洗后，真空干燥至恒重，此时膜的柔韧性变强，表面呈淡黄色，光滑，有光泽，此即为改性后的细菌纤维素膜；

改性细菌纤维素膜对菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的固定化：

取7g上述步骤得到的改性细菌纤维素膜放到含有90mL的磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)的锥形瓶中，再加入6.5mL 25％重量百分含量的戊二醛水溶液，40℃轻微搅拌反应45min，取出膜依次用蒸馏水和磷酸缓冲溶液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)洗涤，然后真空干燥；将上述戊二醛处理后的细菌纤维素膜放到含有120mL白腐菌液体限制性培养基的锥形瓶中；灭菌后再加入13mL实施例1得到的白腐菌孢子液，于28℃，120rpm摇床上培养48小时，取出膜后用无菌水反复冲洗三次，此时细菌纤维素膜表面形成了一层薄薄的白色菌膜，即为固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜。

实施例5：

细菌纤维素膜的改性处理：

取细菌纤维素膜60g放入180mL的1mol/L氢氧化钠溶液中，再加入40mL的环氧氯丙烷，于60℃恒温水浴反应60min后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物；水洗后，再加入9mL的乙二胺和81mL蒸馏水，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热60min，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤3遍后，蒸馏水洗至中性，再经丙酮润洗后，真空干燥至恒重，此时膜的柔韧性变强，表面呈淡黄色，光滑，有光泽，此即为改性后的细菌纤维素膜；

改性细菌纤维素膜对菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的固定化：

取9g上述步骤得到的改性细菌纤维素膜放到含有105mL的磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)的锥形瓶中，再加入7mL 25％重量百分含量的戊二醛水溶液，40℃轻微搅拌反应60min，取出膜依次用蒸馏水和磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，0.2mol/L，pH＝7.0)洗涤，然后真空干燥；将上述戊二醛处理后的细菌纤维素膜放到含有130mL白腐菌液体限制性培养基的锥形瓶中；灭菌后再加入15mL实施例1得到的白腐菌孢子液，于28℃，120rpm摇床上培养48小时，取出膜后用无菌水反复冲洗三次，此时细菌纤维素膜表面形成了一层薄薄的白色菌膜，即为固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜。

实施例6：

固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜对孔雀石绿染料废水的处理：

取1g固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜，以及相同质量的同定化白腐菌的聚乙烯醇海藻酸钠，分别加入到含有50mL孔雀石绿染料废水的锥形瓶中，上述孔雀石绿染料废水的制备过程如下：称取20mg孔雀石绿，溶于1L白腐菌液体限制性培养基中，即得到孔雀石绿染料废水；于28℃下，在气浴恒温摇床上以120rpm摇床处理5天，每隔24小时测定染料废水的色度，5天后，弃掉处理后的染料废水，保留固定化菌，再向此锥形瓶中加入50mL新配制的20mg/L孔雀石绿染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定染料废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，即用同1批固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜连续处理6批次染料废水，色度去除效果如表1所示：

表1固定化白腐菌的不同载体对20mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果

从表1中可以看出，1g固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜对20mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果明显优于相同质量的固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，且改性细菌纤维素膜对白腐菌处理孔雀石绿染料废水效果的干扰明显小于聚乙烯醇-海藻酸钠。

实施例7：

固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜对孔雀石绿染料废水的处理：

取2g固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜，以及相同质量的固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，分别加入到含有50mL孔雀石绿染料废水的锥形瓶中，上述孔雀石绿染料废水的制备过程如下：称取40mg孔雀石绿，溶于1L白腐菌液体限制性培养基中，即得到孔雀石绿染料废水；于28℃下，在气浴恒温摇床上以120rpm摇床处理5天，每隔24小时测定染料废水的色度，5天后，弃掉处理后的染料废水，保留固定化菌，再向此锥形瓶中加入50mL新配制的40mg/L孔雀石绿染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定染料废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，即用同1批固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜连续处理6批次染料废水，色度去除效果如表1所示：

表2固定化白腐菌的不同载体对40mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果

从表2中可以看出，2g固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜对40mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果明显优于相同质量的固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，且改性细菌纤维素膜对白腐菌处理孔雀石绿染料废水效果的干扰明显小于聚乙烯醇-海藻酸钠。

实施例8：

固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜对孔雀石绿染料废水的处理：

取1.5g固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜，以及相同质量的固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，分别加入到含有50mL孔雀石绿染料废水的锥形瓶中，上述孔雀石绿染料废水的制备过程如下：称取30mg孔雀石绿，溶于1L白腐菌液体限制性培养基中，即得到孔雀石绿染料废水；于28℃下，在气浴恒温摇床上以120rpm摇床处理5天，每隔24小时测定染料废水的色度，5天后，弃掉处理后的染料废水，保留固定化菌，再向此锥形瓶中加入50mL新配制的30mg/L孔雀石绿染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定染料废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，即用同1批固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜连续处理6批次染料废水，色度去除效果如表1所示：

表3固定化白腐菌的不同载体对30mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果

从表3中可以看出，1.5g固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜对30mg/L孔雀石绿染料废水的处理效果明显优于相同质量的固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，且改性细菌纤维素膜对白腐菌处理孔雀石绿染料废水效果的干扰明显小于聚乙烯醇-海藻酸钠。

注：

上述实施例6～实施例8中聚乙烯醇-海藻酸钠对白腐菌的固定化步骤为：

①将10g聚乙烯醇和0.5g海藻酸钠加入到100mL蒸馏水中，用沸水浴加热使之溶解，冷却至室温，然后再将0.1g活性炭投入其中使之混合；在无菌操作台中向上述所得混合液中加入10mL实施例1得到的白腐菌孢子液，混合充分；

②配置饱和硼酸溶液100ml，然后用碳酸钠溶液调节pH值至6.7，再向该混合液中添加2g氯化钙，充分混合；

③将①所得混合物打入注射器，滴入到②的混合物中，滴入过程中控制胶滴大小在2～3mm左右。然后将胶滴置于在4℃冰箱中保存24h，使其凝胶化，最后用蒸馏水冲洗至中性，即得到固定化白腐菌的聚乙烯醇-海藻酸钠，置于4℃冰箱中待用，用时吸净水分。

Claims (1)

1.一种孔雀石绿染料废水的处理方法，是由如下的过程和步骤组成：

(1)细菌纤维素膜的制备

将保存在斜面上的菌株编号为CGMCC NO：1.1812的木醋杆菌Gluconacetobactcrxylinum接入到50mL种子培养基中，所述的种子培养基中各组分用量占种子培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；气浴恒温摇床上以160rpm培养2天，得到活化好的木醋杆菌培养液，取此木醋杆菌培养液10mL接入到125mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为：葡萄糖2％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.3％；Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％；KH₂PO₄0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；30℃静置培养7天，在液面生成淡黄色胶质膜，将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液中，80℃煮沸60min，去除菌膜内部的菌体和残留培养基，然后用蒸馏水反复冲洗至中性，得到细菌纤维素膜；

(2)细菌纤维素膜的改性处理

将40～60g步骤(1)得到的细菌纤维素膜加入到100～180mL的1mol/L氢氧化钠溶液中，再加入20～40mL环氧氯丙烷，于60℃恒温水浴反应30～60min后，取出膜用丙酮洗涤；水洗后，再加入5.5～9mL的乙二胺和49.5～81mL的蒸馏水；充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热30～60min，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤3遍后，蒸馏水洗至中性，再经丙酮润洗后，真空干燥至恒重，得到改性后的细菌纤维素膜；

(3)改性细菌纤维素膜对菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的固定化

将6～9g步骤(2)得到的改性细菌纤维素膜加入到80～105mL的pH＝7.0、浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液中，再加入6～7mL 25％重量百分含量的戊二醛水溶液；于40℃下轻微搅拌反应30～60min，取出膜依次用蒸馏水和0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液洗涤，然后真空干燥；干燥后的细菌纤维素膜加入到110～130mL的白腐菌液体限制性培养基中，所述的白腐菌液体限制性培养基中各组分用量分别为：KH₂PO₄2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.25g/L；MnSO₄0.5mg/L；无水FeSO₄0.1g/L；NaCl1.0mg/L；NH₄NO₃2g/L；CaCl₂0.1g/L；葡萄糖15g/L；VB₁5.0mg/L；pH＝6.0～7.0；灭菌后再加入12～15mL白腐菌孢子液；于28℃，120rpm摇床上培养48小时，取出膜后用无菌水反复冲洗三次，此时膜表面形成了一层薄薄的白色菌膜，得到固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜；

(4)固定化菌株编号为CGMCC NO：5.776的白腐菌的改性细菌纤维素膜对孔雀石绿染料废水的处理

将1～2g步骤(3)得到的固定化白腐菌的改性细菌纤维素膜，加入到50mL孔雀石绿染料废水中，上述孔雀石绿染料废水的制备过程如下：称取20～40mg孔雀石绿，溶于1L上述步骤(3)所述的白腐菌液体限制性培养基中，得到孔雀石绿染料废水；于28℃下，在气浴恒温摇床上以120rpm处理5天，每隔24小时测定染料废水的色度，5天后，弃掉处理后的染料废水，保留固定化菌，再加入50mL新配制的相同浓度的染料废水，处理条件同上，每隔24小时测定染料废水的色度，以5天为一循环，如此重复5次，染料废水色度的去除率始终维持在86％以上。