CN108191072B - 利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，包括以下步骤：将中空介孔碳固定化漆酶加入含抗生素的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲溶液中，振荡反应，使抗生素通过中空介孔碳外壳上的介孔通道进入中空内腔，被中空内腔固定的漆酶吸附和降解，完成对抗生素的去除。该利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法具有简单有效、易于实施、安全性高、无二次污染等优点。

Description

利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法。
背景技术
抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能及发挥作用的化学物质。近几十年来，由于抗生素广泛运用于医药、畜牧和水产养殖等，过量和不完全代谢使得抗生素经常在天然水，污水，土壤等环境介质中被检测出来。这些未被代谢掉的抗生素很可能会影响生物细胞的发展，生态***的循环并且会促进耐药病原菌的繁殖，从而对生态环境和人类健康带来不利影响。在过去的研究中，许多方法被用于去除抗生素污染物，包括过滤、吸附、高级氧化、生物降解、酶降解等。在这些方法中，酶降解可以被看作是一种有效和环境友好的方法，如漆酶降解。
漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含有多铜的胞外氧化酶，首次发现于漆树中的分泌物。但是研究表明许多真菌、植物、昆虫和一些细菌也可以分泌漆酶。漆酶被应用于许多领域，如食品、纺织、造纸、医药、能源、生物传感器和环境修复。近年来，由于严重的环境污染，漆酶在生物修复中的应用引起了越来越多的关注。这是因为漆酶具有高效的催化活性并且能降解多种有机物，特别是酚类有机污染物。但是，由于游离漆酶的稳定性低、不可回收和高成本，这大大限制了游离漆酶的实际中运用。而酶的固定化技术不仅能够保持酶高效的催化活性的，同时能够提高酶的稳定性，可回收性和降低利用成本。常规的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶等材料，但是这些材料存在固定化效率低，不稳定等缺点。因而，急需寻找到一种更加高效，稳定的固定化载体及固定方法，以扩大漆酶在抗生素降解方面的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单有效、易于实施、安全性高、无二次污染的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，包括以下步骤：
将中空介孔碳固定化漆酶加入含抗生素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，振荡反应，使抗生素通过中空介孔碳外壳上的介孔通道进入中空内腔，被中空内腔固定的漆酶吸附和降解，完成对抗生素的去除。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述含抗生素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，pH＝4.5～5.5，柠檬酸-柠檬酸钠的浓度为0.1M，抗生素的浓度为50mg/L；所述中空介孔碳固定化漆酶的添加量为20mg/100mL。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述振荡反应的温度为25～30℃，转速为150～200rpm，时间为3h。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述抗生素为盐酸四环素和/或盐酸环丙沙星。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述中空介孔碳固定化漆酶中，漆酶直接物理吸附在中空介孔碳的中空内腔；所述中空介孔碳固定化漆酶由以下方法制得：
将中空介孔碳加入到含有漆酶和鼠李糖脂的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，所述含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.5～5.5，鼠李糖脂浓度为10～20mg/L，漆酶浓度为1.0～1.8mg/mL，所述中空介孔碳与含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的用量比为100mg∶100～200mL，在25～30℃、150～200rpm下恒温振荡固定化2～3h，得到中空介孔碳固定化漆酶。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，漆酶利用戊二醛，通过共价交联固定在中空介孔碳的中空内腔；所述中空介孔碳固定化漆酶由以下方法制得：
(1)将质量分数为25％的氨水和中空介孔碳混合，所述中空介孔碳与氨水的用量比为100mg∶50～70mL，在200℃下水热反应12h，得到氨基化中空介孔碳；
(2)将氨基化中空介孔碳加入到质量浓度为5％的戊二醛溶液中，所述氨基化中空介孔碳与戊二醛溶液的用量比为100mg∶5～10mL，在室温下搅拌24h，得到连接戊二醛的氨基化中空介孔碳；
(3)将连接戊二醛的氨基化中空介孔碳加入到含有漆酶和鼠李糖脂的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，所述含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.5～5.5，鼠李糖脂浓度为10～20mg/L，漆酶浓度为1.0～1.8mg/mL，所述连接戊二醛的氨基化中空介孔碳与含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的用量比为100mg∶100～200mL，在25～30℃、150～200rpm下恒温振荡固定化2～3h，得到中空介孔碳固定化漆酶。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述中空介孔碳由以下方法制得：
以正硅酸丙酯、无水乙醇、氨水、间苯二酚和甲醛为原料，自组装形成介孔碳球前体；然后碳化，脱硅，离心，得到中空介孔碳。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述介孔碳球前体的具体制备过程为：将正硅酸丙酯加入到无水乙醇和超纯水的混合溶液中，再加入氨水，室温下搅拌15～20min；再加入间苯二酚和甲醛，室温下持续搅拌24h，离心，漂洗，干燥，粉碎，得到介孔碳球前体。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述氨水的质量分数为25％，所述正硅酸丙酯、无水乙醇、氨水、间苯二酚和甲醛的用量比为34.6mL∶600～700mL∶30mL∶4.0g∶5.6mL。
上述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，优选的，所述碳化温度为700℃，碳化时间为4～5h；所述脱硅介质为质量分数为10～20％的氢氟酸溶液，脱硅时间为24h。
本发明的创新点在于：中空介孔碳球是一种具有中空内腔及介孔外壳结构的新型碳材料，由于其优良的电化学性能使得它常用于电池领域的研究。同时，申请人的前期研究发现，这些优良的特性使得它在酶的固定化领域也展现出了巨大的运用潜力。在本申请中，我们在添加低浓度鼠李糖脂的情况下能将漆酶固定于中空介孔碳的中空内腔中，这区别于一般的固定化研究将酶固定于载体的表面或孔道。其巨大的中空内腔能作为一个容器显著增加漆酶的固定量，介孔外壳就像是一道“保护墙”，隔绝了外界环境变化对酶的直接冲击，介孔通道就像是“大门”，用于腔内-外物质的运输交换及相互作用，这将更利于保护酶的稳定性，提高酶的使用效率，所以内腔表面更利于酶的固定。这对漆酶起到了保护作用同时也能最大程度发挥漆酶在实际运用中的作用效果，实践也表明该载体对漆酶的固定化效果远高于以往的研究。同时，漆酶对污染物的降解是一个氧化还原反应，在这个反应中存在电子的大量转移与传递，而中空介孔碳优良的电化学性能能提高漆酶在该作用过程中电子的传递能力，从而提升固定化漆酶降解环境中污染物的能力。
本申请中，申请人利用一步法合成中空介孔碳球(HMCs)，并尝试用氨水(NH3·H2O)对其进行氨基功能化，同时还将戊二醛(GTA，5％)连接到氨基功能化后的HMCs内腔表面上制备得到了连接GTA后的HMCs-NH2(记为HMCs-NH2-GTA)。再在添加低浓度鼠李糖脂的情况下利用物理吸附法将漆酶固定于载体HMCs内腔表面或于内腔中聚成团状，或利用共价结合法将漆酶固定于载体HMCs-NH2-GTA内腔表面或于内腔中聚成团状，得到了本申请的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶。
漆酶的尺寸为6.5×5.5×4.5nm，而现有技术制备的中空介孔碳外壳上的介孔尺寸一般小于漆酶尺寸，漆酶难以进入中空介孔碳中。本发明采用一步法合成中空介孔碳，通过对一步合成的工艺进行优化，所得的中空介孔碳外壳上的介孔尺寸达到十几纳米，平均孔径大于漆酶的粒径，能让漆酶顺利进入内腔中。且外壳较薄，孔道短，内腔体积大，这减少了酶扩散进内腔中的阻力，也增加酶在内腔中的固定量。
不同于一般的将酶固定于载体的表面或孔道的工艺，申请人的前期研究表明，采用一般的固定化工艺，漆酶进入中空介孔碳的中空内腔中的量有限，限制了其对漆酶的保护和固定作用。申请人根据多年的理论和研发经验，提出在添加低浓度鼠李糖脂的情况下利用物理吸附法或共价结合法将漆酶固定于中空介孔碳的内腔表面或于内腔中聚成团状，得到了本申请的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶。鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂，这是一种两亲性物质，通过添加低浓度的鼠李糖脂不仅能促进漆酶的扩散，增强漆酶和载体的结合，还能对漆酶的活性起到一定的保护作用。
本发明采用了两种固定化技术，将漆酶固定于中空介孔碳材料的内表面中。区别于其他的固定化过程，以往的研究中所采用的固定化材料由于其孔径的限制，漆酶一般难以进入到材料的内部空间中，其固定位点主要集中于材料的外表面，由于外表面固定化的不稳定性从而限制了漆酶的固定化及运用。本研究中的两种固定化技术是区别于以往的固定化技术。
第一种是在添加低浓度鼠李糖脂的情况下利用物理吸附的方法将漆酶固定于未改性的中空介孔碳中：为了能使漆酶进入到中空介孔碳内部，并固定于中空介孔碳的内腔中，先通过优化一步合成法制得的中空介孔碳外壳上的介孔尺寸达到十几纳米，这超过了6.5×5.5×4.5nm的漆酶尺寸，同时，其介孔壳的厚度为40nm，较短的介孔通道减少了漆酶在扩散进入内腔过程中的阻力，增加了漆酶扩散至内腔中的数量。由于所制得中空介孔碳的内表面含有大量的含氧官能团，如羧基，羟基等，进入到内腔中的漆酶在范德华力，疏水性作用，氢键等作用力下固定于内腔表面。此外，随着内腔表面固定的漆酶越来越多，大量的进入到内腔中未固定于内腔表面的酶相互作用，团聚，从而在尺寸上超过了介孔通道的孔径，限制了其再次扩散出内腔，增加了漆酶在内腔中的固定量。同时，通过在缓冲液中添加低浓度的鼠李糖脂促进漆酶扩散进入中空介孔碳内部，增强漆酶和载体的结合。
第二种是在添加低浓度鼠李糖脂的情况下利用共价结合的方法将漆酶固定于经戊二醛改性的的中空介孔碳中：该固定化技术所采用的载体是经氨水水热改性后的，该载体中空介孔碳载体具有更大的介孔尺寸和比表面积，同时载体表面的氨基官能团显著增加，从而增加了漆酶进入内腔中概率。将戊二醛连接到经氨基化的中空介孔碳上，戊二醛能和载体表面上的氨基形成共价键，同时又和漆酶形成共价键，从而将漆酶固定于载体中。该共价键是一种比较强的作用力，对漆酶具有较强的吸引力，从而促使漆酶进入中空介孔碳的内腔中。改性后更大的介孔通道更加利于漆酶扩散至载体内腔中，同时增加的比表面积为漆酶提供了更多的固定位点。进入内腔中的漆酶通过共价结合到内腔表面，或是和戊二醛进行交联在内腔中团聚，形成大尺寸的漆酶团，从而限制了漆酶流出内腔，增加了内腔中漆酶的固定量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明利用中空介孔碳固定化酶对抗生素污染物进行吸附和降解，去除效率高，去除快，操作简单，不产生二次污染，且能对不同类型的抗生素进行有效去除。
附图说明
图1为两种中空介孔碳固定化漆酶制备过程中步骤(1)制备的中空介孔碳(HMCs)扫描电镜(A图)和透射电镜(B图)。
图2为载体HMCs和HMCs-NH2的N2吸附-脱附曲线和孔径分布图。
图3为两种载体HMCs和HMCs-NH2-GTA固定漆酶的固定量随时间的变化图。
图4为两种载体HMCs和HMCs-NH2-GTA固定漆酶的固定量随漆酶初始浓度的变化及所得的中空介孔碳固定化漆酶的酶活性恢复变化(R)图。
图5为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)在60℃下的热稳定性对照图。
图6为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的pH稳定性对照图。
图7为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)在-4℃下的储存稳定性对照图。
图8为两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的操作稳定性对照图。
图9为中空介孔碳固定化漆酶固定漆酶及降解水体中抗生素的原理图。
图10为两种失活中空介孔碳固定化酶和未失活中空介孔碳固定化酶对TCH的去除的对比曲线图。
图11为两种失活中空介孔碳固定化酶和未失活中空介孔碳固定化酶对CPH的去除的对比曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种本发明的利用中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)去除水体中的盐酸四环素(TCH)的方法，包括以下步骤：
取中空介孔碳固定化漆酶20mg添加到含50mg/L盐酸四环素(TCH)的100mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，将各混合液置于30℃，150rpm的振荡培养箱中去除3h，完成对盐酸四环素(TCH)的去除。
其中，中空介孔碳固定化漆酶的结构可以为漆酶直接物理吸附在中空介孔碳的中空内腔中(记为HMCs-Lac)以及，漆酶利用戊二醛，通过共价交联固定在中空介孔碳的中空内腔中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)两种。
中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)通过以下方法制得：
(1)制备HMCs：
取34.6mL的正硅酸丙酯(TPOS)加入到含有600mL无水乙醇和200mL超纯水的烧杯中，再接着加入30mL的氨水(NH3·H2O，25wt％)，然后于室温下搅拌15min。随后将4.0g的间苯二酚和5.6mL的甲醛加入到上述的混合液中并于室温下持续搅拌24h。将制得的棕黄色材料离心分离(10000rpm，3min)出来并用超纯水和无水乙醇漂洗三遍，并于60℃干燥箱中烘干，碾碎。并将所得的粉末状材料于700℃(5℃/min)带N2保护的管式炉中碳化4h，待其自然冷却后取出。将所得的黑色粉末置于氢氟酸溶液(10％，24h)中进行脱硅处理，然后离心分离(10000rpm，3min)出来剩余的黑色材料，并用超纯水将其漂洗至中性，然后至于60℃干燥箱中烘干，所得的黑色粉末状材料就是HMCs，然后置于干燥器中保存备用。
(2)制备中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)：
取100mg的HMCs加入到漆酶浓度为1mg/mL，鼠李糖脂浓度为10mg/L的200mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M,pH＝4.5)中，然后将该混合溶液放置于恒温振荡培养箱(30℃,150rpm)中固定化2h，再将固定化漆酶后的材料离心分离(6000rpm，5min)出来，并用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M,pH＝4.5)漂洗三遍以去除未游离的漆酶，将得到的材料放于-42℃的冷冻干燥机中干燥，将该物理吸附法所得的中空介孔碳固定化漆酶记为HMCs-Lac，并将其置于于-4℃的冰箱中保存备用。
中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)通过以下方法制得：
(1)制备HMCs：
与HMCs-NH2-Lac制备过程中的步骤(1)同。
(2)制备HMCs-NH2：
取100mg步骤(1)制得的HMCs置于10mL的超纯水中并超声分散10min，然后将70mL的NH3·H2O加入到上述黑色溶液中，混匀，并将其转入容积为100mL的水热反应釜中，并放置于200℃下反应12h。将反应后的材料离心分离(10000rpm，3min)出来，并用超纯水和乙醇漂洗多遍去掉多余的氨水，将得到的黑色材料于60℃真空干燥箱中烘干，所得到的黑色粉末就是氨基功能化的HMCs，记为HMCs-NH2，置于干燥器中保存备用。
(3)制备HMCs-NH2-GTA：
将100mg步骤(2)制得的HMCs-NH2加入到10mL的戊二醛溶液(5％)中，然后于室温下搅拌24h。将反应后的材料离心分离(10000rpm，3min)出来，并用超纯水漂洗多遍以去除多余的戊二醛，将得到的材料于60℃真空干燥箱中烘干，所得到的黑色粉末标记为HMCs-NH2-GTA，置于干燥器中保存备用。
(4)制备中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)：
取100mg步骤(3)制得的HMCs-NH2-GTA材料加入到漆酶浓度为1.0mg/mL，鼠李糖脂浓度为10mg/L的200mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)中，然后将该混合溶液放置于恒温振荡培养箱(30℃，150rpm)中固定化2h，再将固定化漆酶后的材料离心分离(6000rpm，5min)出来，并用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)漂洗三遍以去除未游离的漆酶，将得到的材料放于-42℃的冷冻干燥机中干燥，将该共价结合法所得的中空介孔碳固定化漆酶记为HMCs-NH2-GTA-Lac，并将其置于-4℃的冰箱中保存备用。
其中，漆酶浓度的测定方法为：取0.1mL的漆酶溶液加入到5mL的蛋白质试剂中，振荡均匀，反应2min，用紫外可见分光光度计(UV-255；Shimadzucompany，日本)于595nm下侧其吸光度，根据已做好的标线确定漆酶浓度。其中蛋白质试剂的配制方法为：将100mg考马斯亮蓝G-250加到50mL的95％的乙醇中，然后再将100mL的85％磷酸加入到该溶液中，并稀释到1000mL，该溶液即为蛋白质试剂。
图1为两种中空介孔碳固定化漆酶制备过程中步骤(1)制备的中空介孔碳(HMCs)扫描电镜(A图)和透射电镜(B图)，图由图1可知，该中空介孔碳具有较大的中空体积。
图2为载体HMCs和HMCs-NH2的N2吸附-脱附曲线和孔径分布图。由图可知，HMCs是典型的介孔材料，且其孔径尺寸分布图也表明该尺寸的孔径主要分布在2～40nm，平均孔径达到11.8nm；HMCs-NH2也是典型的介孔材料，且其孔径尺寸分布图也表明该尺寸的孔径主要分布在2～30nm，平均孔径达到13.5nm。
图3为两种载体HMCs和HMCs-NH2-GTA固定漆酶的固定量随时间的变化图，由图可知，漆酶的物理吸附固定化是一个非常迅速的过程，经过30min的固定基本就达到吸附平衡，且在HMCs载体的最大固定量分别为713mg/g；漆酶的共价结合固定化类似于漆酶的物理吸附固定化，但需要60min才能达到最大的固定量，且在HMCs-NH2-GTA载体的最大固定量为784mg/g。
关于两种载体HMCs和HMCs-NH2-GTA固定漆酶的固定化量随时间，初始浓度的变化曲线的测定研究：
漆酶固定量随固定时间的变化：准备两个漆酶浓度为1.0mg/mL，鼠李糖脂浓度为10mg/L的200mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，在第二个中加入100mg载体HMCs-NH2-GTA，然后将两个混合溶液放置于恒温振荡培养箱(30℃，150rpm)中固定化2h，并在一定时间间隔下(0.5，1.0，3.0，6.0，10，15，20，30，60，120min)下分别取样测定剩余漆酶的浓度，绘制出漆酶固定量随固定化时间的变化曲线。
漆酶固定量随初始漆酶浓度的变化：准备两组含不同漆酶浓度(0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mg/mL)，鼠李糖脂浓度为10mg/L的4.0mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，在第一组中每个加入2.0mg载体HMCs，在第二组中每个加入2.0mg载体HMCs-NH2-GTA，然后将各混合溶液放置于恒温振荡培养箱(30℃，150rpm)中固定化2h，并取样测定剩余漆酶的浓度，绘制出漆酶固定量随初始漆酶浓度变化曲线，并计算固定化酶的活性恢复。
其中，固定化酶活性恢复的计算公式为：R是固定化酶活性恢复，Ai是固定化酶的活性，Af是同等数量自由漆酶的活性。
图4为两种载体HMCs和HMCs-NH2-GTA固定漆酶的固定量随漆酶初始浓度的变化及所得的中空介孔碳固定化漆酶的酶活性恢复变化(R)图，由图4可知，两种载体固定漆酶的最大固定量随着漆酶初始浓度的增大而先快速增加而后增加速率减慢，同时固定酶的活性恢复均是先增大后减小的，在漆酶浓度为1.0～1.2mg/mL时达到最大。
关于游离漆酶、两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的稳定性的测定研究：
游离漆酶、两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的热稳定性测定：
用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)配置浓度为1.0mg/mL漆酶溶液，然后将其置于60℃恒温培养箱中3h，每隔30min取样测定该溶液的漆酶活性；准备两组，每组6个样，共12个含有2.1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)的4mL的离心管，在第一组每个中加入等量的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)，在第二组每个中加入等量(也与第一组等量)的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)，然后将每组各个均置于60℃恒温培养箱中3h，每隔30min取出一个样测定剩余的中空介孔碳固定化漆酶的活性。
游离漆酶、两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的pH稳定性测定：
将等量的游离漆酶分别置于pH分别为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)中，然后将各个样均置于30℃恒温培养箱中1h，测定不同pH下游离漆酶的稳定性；准备两组pH不同的(2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)，包含2.1mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)的离心管，在第一组中每个加入等量的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)，在第二组每个中加入等量(也与第一组等量)的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)，然后将每组各个均置于30℃恒温培养箱中1h，测定不同pH下不同的中空介孔碳固定化漆酶的稳定性。
游离漆酶、两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的储存稳定性测定：
用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)配置浓度为1.0mg/mL漆酶溶液，然后将其置于-4℃的冰箱中，每隔5d取一个样测定该溶液的漆酶活性；准备两组(每组6个)含有2.1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)的离心管，在第一组中每个加入等量的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)，在第二组每个中加入等量(也与第一组等量)的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)，然后将每组各个均置于-4℃的冰箱中，每隔5d取出一个样测定剩余中空介孔碳固定化漆酶的活性。
两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的操作稳定性测定：
准备两个含有2.1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)的离心管，在第一个中加入2mg中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac)，在第二个中加入2mg中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)，然后每个样再加入0.9mL，0.1mM的2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)溶液，于室温下反应4min，离心(6000rpm，5min)出固定化漆酶，用紫外可见分光光度计(UV-2550；Shimadzucompany，日本)于420nm下测定剩余绿色溶液的吸光度，重复操作8次，测定固定化漆酶的操作稳定性。
本实施例中，游离漆酶活性的测定方法为：一个酶活力单位(U)为1μmol的ABTS每分钟被转化所需的酶量，以不加启动因子的混合液为空白样。以ABTS为底物在420nm下测定4min内吸光度的变化。3mL反应体系包括2mL柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(100mmol/L)pH＝4.5，0.1mL酶液，0.9mLABTS(1mmol/L)。
中空介孔碳固定化漆酶活性的测定方法为：取2mg待测中空介孔碳固定酶加入到包括2.1mL柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(0.1M，pH＝4.5)和0.9mLABTS(1mmol/L)，让其反应4min，离心(6000rpm，5min)出固定化漆酶，用紫外可见分光光度计(UV-2550；Shimadzucompany,日本)于420nm下测定剩余绿色溶液的吸光度。
相对酶活(％)定义为每个样的酶活性与该组中最大酶活性的比值再乘以100。
图5为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)在60℃下的热稳定性对照图；图6为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的pH稳定性对照图；图7为游离漆酶和两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)在-4℃下的储存稳定性对照图；图8为两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)的操作稳定性对照图。由图5到图8可知，两种中空介孔碳固定化漆酶都展现出了优良的热稳定性，pH稳定性，储存稳定性及操作稳定性，其中用共价结合的方法所得的中空介孔碳固定化漆酶具有最好的稳定性。然而游离漆酶相比于中空介孔碳固定化酶其热稳定性，pH稳定性及储存稳定性都不是很好。
中空介孔碳固定化漆酶固定漆酶及降解水体中抗生素盐酸四环素(TCH)的原理如图9所示，溶于缓冲液中的漆酶通过外壳上的介孔通道进入中空介孔碳的中空内腔后，通过物理吸附或共价结合固定于中空介孔碳内腔表面或聚成团，污染物盐酸四环素(TCH)通过介孔通道进入内腔从而被固定的漆酶降解。中空介孔碳巨大的中空内腔能作为一个容器显著增加漆酶的固定量，且其介孔外壳不仅能将漆酶和外部环境隔离起来，同时不阻碍内外环境物质的传输和交换，这对漆酶起到了保护作用同时也能最大程度发挥漆酶在实际运用中的作用效果。同时，漆酶对污染物的降解是一个氧化还原反应，在这个反应中存在电子的大量转移与传递，而中空介孔碳优良的电化学性能能提高漆酶在该作用过程中电子的传递能力，从而提升固定化漆酶降解环境中污染物盐酸四环素(TCH)的能力。
实施例2：
一种利用实施例1失活的两种中空介孔碳固定化漆酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)和未失活的实施例1的两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)去除水体中的盐酸四环素(TCH)污染物的应用研究，具体步骤如下：
取失活的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶(失活的Cs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)和未失活的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)各20mg分别添加到含50mg/L盐酸四环素(TCH)的100mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，将各混合液置于30℃，150rpm的振荡培养箱中去除3h，期间在不同时刻取样测定TCH的剩余浓度。
其中TCH的浓度采用紫外可见分光光度计(UV-2550；Shimadzu company，日本)于357nm下测定。
其中，失活的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)，是由实施例1制备的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)经灭活后所得。
灭活方法：将固定漆酶装入4mL的离心管中，密封好，再将离心管置于高压灭菌锅中105℃灭活10min，待冷却后取出，经测定灭火后的固定漆酶不再具有酶活性。
有研究表明利用磁性介孔碳通过物理吸附固定化漆酶，其最大固定量只有491.7mg/g，利用碳纳米管材料通过共价结合固定化漆酶时其最大固定量为168.6mg/g，远低于该研究中中空介孔碳对对漆酶的固定。同时，在以往利用固定化漆酶去除四环素污染物的研究中，其对四环素类抗生素的最大去除效率一般为50％左右，且需要较长的去除时间。而在本研究中创新性地利用中空介孔碳材料固定化漆酶去除四环素污染废水，通过协同中空介孔碳较强的吸附性能及漆酶的降解能力对四环素污染物达到快速有效的去除，显示出来该固定化材料优异的性能，表明该载体对漆酶的固定化效果远高于以往的研究。
图10为两种失活中空介孔碳固定化酶和未失活中空介孔碳固定化酶对TCH的去除的对比曲线图，由图10可知，两种失活的中空介孔碳固定化酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)对TCH的去除率分别达到63.9％和59.4％，未失活的两种中空介孔碳固定化酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)对TCH的去除率分别达到86.3％和71.3％，由此可知未失活的两种中空介孔碳固定化酶对TCH的去除具有更好的效果。
实施例3：
一种本发明的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中的盐酸环丙沙星(CPH)的方法，包括以下步骤：
取中空介孔碳固定化漆酶20mg添加到含50mg/L盐酸环丙沙星(CPH)的100mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，将各混合液置于30℃，150rpm的振荡培养箱中去除3h，完成对盐酸环丙沙星(CPH)的去除。
其中，中空介孔碳固定化漆酶的结构可以为漆酶直接物理吸附在中空介孔碳的中空内腔中(记为HMCs-Lac)、漆酶利用戊二醛，通过共价交联固定在中空介孔碳的中空内腔中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-NH2-GTA-Lac)两种。上述两种不同结构的中空介孔碳固定化漆酶的制备方法与实施例1相同。
上述两种中空介孔碳固定化漆酶固定漆酶及降解水体中抗生素盐酸环丙沙星(CPH)的原理与实施例1同，溶于缓冲液中的漆酶通过外壳上的介孔通道进入中空介孔碳的中空内腔后，通过物理吸附或共价结合固定于中空介孔碳内腔表面或聚成团，污染物盐酸环丙沙星(CPH)通过介孔通道进入内腔从而被固定的漆酶降解。中空介孔碳巨大的中空内腔能作为一个容器显著增加漆酶的固定量，且其介孔外壳不仅能将漆酶和外部环境隔离起来，同时不阻碍内外环境物质的传输和交换，这对漆酶起到了保护作用同时也能最大程度发挥漆酶在实际运用中的作用效果。同时，漆酶对盐酸环丙沙星(CPH)的降解是一个氧化还原反应，在这个反应中存在电子的大量转移与传递，而中空介孔碳优良的电化学性能能提高漆酶在该作用过程中电子的传递能力，从而提升固定化漆酶降解环境中盐酸环丙沙星(CPH)的能力。
实施例4：
一种利用实施例1失活的两种中空介孔碳固定化漆酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)和未失活的实施例1的两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)去除水体中的盐酸环丙沙星(CPH)污染物的应用研究，具体步骤如下：
取失活的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)和未失活的两种不同连接状态的中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)各20mg分别添加到含50mg/L盐酸环丙沙星(CPH)的100mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M，pH＝4.5)，将各混合液置于30℃，150rpm的振荡培养箱中去除3h，期间在不同时刻取样测定CPH的剩余浓度。
其中CPH的浓度采用紫外可见分光光度计(UV-2550；Shimadzu company，日本)于315nm下测定。
图11两种失活中空介孔碳固定化漆酶和未失活中空介孔碳固定化漆酶对CPH的去除的对比曲线图，由图11可知，两种失活的中空介孔碳固定化漆酶(失活的HMCs-Lac和失活的HMCs-NH2-GTA-Lac)对CPH的去除率分别达到75.1％和70.3％，未失活的两种中空介孔碳固定化漆酶(HMCs-Lac和HMCs-NH2-GTA-Lac)对CPH的去除率分别达到83.6％和80.3％，由此可知未失活的两种中空介孔碳固定化漆酶对CPH的去除具有更好的效果。
有研究表明利用磁性介孔碳通过物理吸附固定化漆酶，其最大固定量只有491.7mg/g，利用碳纳米管材料通过共价结合固定化漆酶时其最大固定量为168.6mg/g，远低于该研究中中空介孔碳对对漆酶的固定。同时，以往缺乏关于利用固定化漆酶去除环丙沙星类污染物的研究，而在本研究中创新性地利用中空介孔碳材料固定化漆酶去除环丙沙星类染废水，通过协同中空介孔碳较强的吸附性能及漆酶的降解能力对环丙沙星类污染物达到快速有效的去除，显示出来该固定化材料优异的性能，表明该载体对漆酶的固定化效果远高于以往的研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，包括以下步骤：
将中空介孔碳固定化漆酶加入含抗生素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，振荡反应，使抗生素通过中空介孔碳外壳上的介孔通道进入中空内腔，被中空内腔固定的漆酶吸附和降解，完成对抗生素的去除；所述中空介孔碳由以下方法制得：以正硅酸丙酯、无水乙醇、氨水、间苯二酚和甲醛为原料，自组装形成介孔碳球前体；然后碳化，脱硅，离心，得到中空介孔碳。
2.根据权利要求1所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述含抗生素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，pH=4.5～5.5，柠檬酸-柠檬酸钠的浓度为0.1 M，抗生素的浓度为50mg/L；所述中空介孔碳固定化漆酶的添加量为20mg/100mL。
3.根据权利要求2所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述振荡反应的温度为25～30℃，转速为150～200rpm，时间为3h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述抗生素为盐酸四环素和/或盐酸环丙沙星。
5.根据权利要求4所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述中空介孔碳固定化漆酶中，漆酶直接物理吸附在中空介孔碳的中空内腔；所述中空介孔碳固定化漆酶由以下方法制得：
将中空介孔碳加入到含有漆酶和鼠李糖脂的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，所述含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.5～5.5，鼠李糖脂浓度为10~20mg/L，漆酶浓度为1.0～1.8mg/mL，所述中空介孔碳与含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的用量比为100mg∶100～200mL，在25～30℃、150～200rpm下恒温振荡固定化2～3h，得到中空介孔碳固定化漆酶。
6.根据权利要求4所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，漆酶利用戊二醛，通过共价交联固定在中空介孔碳的中空内腔；所述中空介孔碳固定化漆酶由以下方法制得：
（1）将质量分数为25%的氨水和中空介孔碳混合，所述中空介孔碳与氨水的用量比为100mg∶50~70mL，在200℃下水热反应12h，得到氨基化中空介孔碳；
（2）将氨基化中空介孔碳加入到质量浓度为5%的戊二醛溶液中，所述氨基化中空介孔碳与戊二醛溶液的用量比为100mg∶5～10mL，在室温下搅拌24h，得到连接戊二醛的氨基化中空介孔碳；
（3）将连接戊二醛的氨基化中空介孔碳加入到含有漆酶和鼠李糖脂的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，所述含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.5～5.5，鼠李糖脂浓度为10~20mg/L，漆酶浓度为1.0～1.8mg/mL，所述连接戊二醛的氨基化中空介孔碳与含有漆酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的用量比为100mg∶100～200mL，在25～30℃、150～200rpm下恒温振荡固定化2～3h，得到中空介孔碳固定化漆酶。
7.根据权利要求1所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述介孔碳球前体的具体制备过程为：将正硅酸丙酯加入到无水乙醇和超纯水的混合溶液中，再加入氨水，室温下搅拌15~20 min；再加入间苯二酚和甲醛，室温下持续搅拌24h，离心，漂洗，干燥，粉碎，得到介孔碳球前体。
8.根据权利要求7所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述氨水的质量分数为25%，所述正硅酸丙酯、无水乙醇、氨水、间苯二酚和甲醛的用量比为34.6mL∶600~700mL∶30mL∶4.0g∶5.6mL。
9.根据权利要求8所述的利用中空介孔碳固定化漆酶去除水体中抗生素的方法，其特征在于，所述碳化温度为700℃，碳化时间为4~5h；所述脱硅介质为质量分数为10~20%的氢氟酸溶液，脱硅时间为24h。
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