CN101972477B - 磷酸锌疫苗佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷酸锌疫苗佐剂，尤其涉及磷酸锌作为疫苗佐剂的应用，以及磷酸锌疫苗佐剂在制备疫苗中的应用。所述磷酸锌作为疫苗佐剂与疫苗联合应用，能够有效增强疫苗的体液免疫应答，其免疫增强效果优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂，并且经动物试验结果显示：磷酸锌作为疫苗佐剂其致敏性和安全性均优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗佐剂，尤其涉及一种磷酸锌疫苗佐剂，以及该磷酸锌疫苗佐剂在制备疫苗中的应用，属于免疫学领域。
背景技术
锌是人体中不可缺少的元素。锌有着重要的生理功能：锌是人体中100多种酶的组成部分；锌是DNA聚合酶的必需组成部分；锌参加唾液蛋白构成；锌参加维生素A还原酶和视黄醇结合蛋白的合成；锌能够促进性器官正常发育，以保持正常的性功能；锌能够保护皮肤健康，维护免疫功能；锌有助于清除体内胆固醇，防治动脉粥样硬化；锌有助于抑制癌症的发生等。人体的生长发育离不开锌，体内锌水平的高低会对神经、生殖和免疫***产生影响。锌是所有生物体必需的微量元素。锌制剂已广泛应用于感染性疾病、自身免疫病等多种疾病的辅助治疗当中。
疫苗佐剂是当今疫苗研究开发的热点，理想的疫苗佐剂需要具备安全、有效、靶向和经济的特点。现有的铝佐剂是使用时间最长且应用最为广泛的被批准用于人体的疫苗佐剂，它主要依靠储存库效应和免疫刺激效应两种机制来显著提高机体的免疫应答。但作为佐剂，它在安全性和靶向性方面仍存在缺陷，原因是：近年来经许多科学家研究发现，老年性痴呆症与铝有密切关系，同时还发现，铝对人体的脑、心、肝、肾功能和免疫功能都有损害。因此，世界卫生组织于1989年正式将铝确定为食品污染物而加以控制，并规定成年人每天允许摄入的铝量不超过60mg。其他一些正在研究或已证实有佐剂作用的物质，由于安全性、有效性或经济性等方面的原因，尚未批准用于人体。
磷酸锌无毒，在物理、化学等方面与磷酸铝具有较高的相似性，而且应用广泛、来源普遍、成本低廉。
用磷酸锌作为疫苗佐剂与铝佐剂类似，均为颗粒佐剂，该类佐剂的作用是：吸附抗原后能形成凝聚性大颗粒，从而容易被巨噬细胞吞噬而增强抗原的免疫原性，此外，它还可以减慢抗原的降解速度，延长抗原在体内的停留时间，延长刺激机体的时间，从而提高抗体的滴度。为此，我们将磷酸锌这一含锌的化合物作为免疫佐剂，应用于疫苗的制备，并在动物实验中检验其免疫增强作用，结果显示磷酸锌作为佐剂与疫苗联合应用，能够有效增强疫苗的体液免疫应答，其免疫增强效果优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂，并且其致敏性低于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。
发明内容
为解决现有疫苗铝佐剂在安全性等方面的缺陷，以及其它佐剂尚未批准用于人体，从而制约着疫苗研究及发展，本发明提供一种安全，有效，稳定，价廉，并具有免疫增强作用的磷酸锌疫苗佐剂。
本发明提供磷酸锌作为疫苗佐剂的应用。
本发明提供磷酸锌在制备疫苗佐剂中的应用。
本发明提供磷酸锌疫苗佐剂在制备疫苗中的应用。
本发明提供磷酸锌疫苗佐剂在制备甲肝疫苗中的应用。
所述磷酸锌的水合物化学式为Zn3(PO4)2·2H20，化学式量为422.08，当其失去两个结晶水后，无水物化学式为Zn3(PO4)2，化学式量为386.08。
所述磷酸锌作为疫苗佐剂应用于人体的推荐剂量为：1mg。
所述磷酸锌为市购的分析纯Zn3(PO4)2·2H2O粉末，或者市购的分析纯Zn3(PO4)2粉末。
所述磷酸锌疫苗佐剂的制备：将所需剂量的分析纯的Zn3(PO4)2·2H2O粉末或者分析纯的Zn3(P04)2粉末加入到适量注射用水中混悬，即得磷酸锌佐剂。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述方案，使磷酸锌疫苗佐剂安全、无毒，由于磷酸锌来源广泛、成本低廉，非常适合于疫苗佐剂，磷酸锌疫苗佐剂能够高效刺激机体免疫应答，免疫增强效果优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂；磷酸锌疫苗佐剂具有低致敏性的特点，因此，在这一方面也优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。磷酸锌疫苗佐剂与灭活的甲肝病毒抗原混合免疫动物后，能够显著增强抗原特异性的体液免疫应答。
附图说明
图1为28周内，使用不同剂量的磷酸锌对小鼠血清特异性抗HAV IgG抗体水平的影响。
图2为35天内，磷酸锌对小鼠血清特异性抗OVA IgE抗体水平的影响。
图3为28周内，使用不同剂量的磷酸锌对小鼠血清特异性抗HBV IgG抗体水平的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
A、磷酸锌作为甲肝疫苗佐剂的免疫效果观察
磷酸锌作为疫苗佐剂与灭活的甲肝病毒抗原在动物实验中，每只小鼠的应用剂量为：磷酸锌0.5～1.5mg，灭活甲肝病毒抗原12.8EU。
a、磷酸锌佐剂母液的配制
a1、精密称取分析纯的Zn3(PO4)2·2H2O粉末0.1093g，加入到10ml注射用水中混悬，制成Zn3(PO4)2浓度为10mg/ml的磷酸锌佐剂；
a2、精密称取分析纯的Zn3(PO4)2粉末0.1000g，加入到10ml注射用水中混悬，制成Zn3(PO4)2浓度为10mg/ml的磷酸锌佐剂；
b、动物免疫
将42只ICR小鼠分为六组、每组7只进行分组免疫，方案如下：
①HAV组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU；
②HAV+Al(OH)3组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化铝的佐剂；
③HAV+Zn(OH)2组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化锌的佐剂；
④HAV+Zn3(PO4)20.5mg组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.05ml(0.5mg)；
⑤HAV+Zn3(PO4)2 1mg组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.1ml(1mg)；
⑥HAV+Zn3(PO4)2 1.5mg组：每只小鼠腹腔注射灭活甲肝病毒抗原12.8EU及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.15ml(1.5mg)；
c、小鼠血清的采集
分别于步骤b中所述分组免疫后，第4、8、12、16、20、24、28周采取小鼠尾静脉血，每只采取全血约100μl，置于高压灭菌过的Eppendorf管中，37℃静置1小时，之后4℃静置过夜，次日离心后取上层血清，置于高压灭菌过的Eppendorf管中-20℃中保存待检；
d、ELISA法测定步骤c中所取小鼠血清中抗-HAV IgG的抗体滴度：
用常规的ELISA商品试剂盒按说明书所述方法测定c步骤中所取小鼠血清中抗-HAV IgG的抗体滴度。其中包被96孔酶标板的抗原为纯化的灭活甲肝病毒抗原，待测样品为c步骤中所取的各组小鼠血清，其中的阳性参照品为小鼠抗-HAV IgG阳性的血清，阴性参照为未接触过甲肝病毒抗原的小鼠的抗-HAV IgG为阴性的血清；
e、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。
表1为28周内，使用灭活HAV抗原与不同剂量磷酸锌疫苗佐剂免疫获得的小鼠血清IgG水平(1∶N)。
表1
通过数据分析可以看出，从第四周开始，各实验组都能产生抗-HAV IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值。其中HAV+Zn3(PO4)2 1mg组所取得的免疫效果最佳，28周之内其抗体滴度水平都显著高于无佐剂灭活甲肝疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。第8周之后，所有添加佐剂的实验组均产生了显著高于HAV组的抗体水平。其中HAV+Zn3(PO4)2 1mg组、HAV+Zn3(PO4)2 1.5mg组和HAV+Zn(OH)2组抗体水平都显著高于HAV+Al(OH)3组，P＜0.05。提示磷酸锌具有能够增强HAV抗原的免疫效果的作用，其体液免疫增强效果高于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。见图1。
B.磷酸锌引起卵清蛋白即OVA特异性IgE的效果分析
a、从步骤1的实验中优选并确定作为佐剂取得的免疫效果的最佳磷酸锌剂量为1mg，以BALB/c小鼠为实验动物，使用V级的卵清蛋白即OVA作为诱导小鼠产生特异性IgE的抗原，与氢氧化锌混合，检测氢氧化锌诱导机体IgE的效果。
具体方法如下：取BALB/c小鼠24只，每组6只，分为4组，方案如下：
①单纯免疫OVA组：在图表中表示为OVA，每只鼠分别于第0和第7天腹腔注射OVA 100μg；
②OVA+氢氧化铝佐剂组：在图表中表示为OVA+Al(OH)3，每只鼠分别于第0和第7天腹腔注射OVA 100μg及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化铝的佐剂；
③OVA+磷酸锌佐剂1mg组：在图表中表示为OVA+Zn3(PO4)2 1mg，每只鼠分别于第0和第7天腹腔注射OVA 100μg及A步骤中a2的磷酸锌佐剂0.1ml(1mg)；
④OVA+氢氧化锌佐剂组：在图表中表示为OVA+Zn(OH)2，每只鼠分别于第0和第7天腹腔注射OVA 100μg及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化锌的佐剂；
b、小鼠血清的采集
分别于B步骤中a所述方法的首次免疫后第8、14、21和35天采取小鼠尾静脉血，方法与A步骤的c相同。
c、ELISA法测定上步骤2.B中所取小鼠血清中抗OVA-IgE的滴度
用常规的ELISA商品试剂盒按说明书所述方法测定b步骤中所取小鼠血清中抗-OVA IgE的抗体滴度，其中包被96孔酶标板的抗原为OVA，待测样品为步骤2.B中所取小鼠血清，其中的阳性参照品为小鼠抗OVA-IgE为阳性的血清，阴性参照为未接触过OVA抗原的小鼠的OVA-IgE为阴性的血清；
d、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。
表2为卵清蛋白(OVA)与不同佐剂免疫获得的小鼠血清IgE水平(1∶N)。
表2
通过数据分析可得到如下结果：在初次致敏后第8、14、21、35天时，OVA+Zn3(PO4)2组小鼠的抗-OVA IgE水平显著低于OVA+Al(OH)3组和OVA+Zn(OH)2组，P＜0.05；说明磷酸锌致敏性低于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。见图2。
实施例2
A、磷酸锌作为乙肝疫苗佐剂的免疫效果观察
磷酸锌作为疫苗佐剂与HBV亚单位疫苗在动物实验中，每只小鼠的应用剂量为：磷酸锌0.5～1.5mg，HBV亚单位疫苗2μg。
a、磷酸锌佐剂母液的配制
a1、精密称取分析纯的Zn3(PO4)2·2H2O粉末0.1093g，加入到10ml注射用水中混悬，制成Zn3(PO4)2浓度为10mg/ml的磷酸锌佐剂；
a2、精密称取分析纯的Zn3(PO4)2粉末0.1000g，加入到10ml注射用水中混悬，制成Zn3(PO4)2浓度为10mg/ml的磷酸锌佐剂；
b、动物免疫
将42只ICR小鼠分为六组、每组7只进行分组免疫，方案如下：
①HBV组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg；
②HBV+Al(OH)3组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化铝的佐剂；
③HBV+Zn(OH)2组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg及在适量注射用水中溶有1mg氢氧化锌的佐剂；
④HBV+Zn3(PO4)2 0.5mg组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.05ml(0.5mg)；
⑤HBV+Zn3(PO4)2 1mg组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.1ml(1mg)；
⑥HBV+Zn3(PO4)2 1.5mg组：每只小鼠腹腔注射HBV亚单位疫苗2μg及a步骤中a1的磷酸锌佐剂0.15ml(1.5mg)；
c、小鼠血清的采集
分别于步骤b中所述分组免疫后，第4、8、12、16、20、24、28周采取小鼠尾静脉血，每只采取全血约100μl，置于高压灭菌过的Eppendorf管中，37℃静置1小时，之后4℃静置过夜，次日离心后取上层血清，置于高压灭菌过的Eppendorf管中-20℃中保存待检；
d、ELISA法测定步骤c中所取小鼠血清中抗-HBV IgG的抗体滴度：
用常规的ELISA商品试剂盒按说明书所述方法测定c步骤中所取小鼠血清中抗-HBV IgG的抗体滴度。其中包被96孔酶标板的抗原为HBV亚单位疫苗成分HBVsAg，待测样品为c步骤中所取的各组小鼠血清，其中的阳性参照品为小鼠抗-HBV IgG阳性的血清，阴性参照为未接触过乙肝病毒抗原的小鼠的抗-HBV IgG为阴性的血清；
e、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。
表3为28周内，使用灭活HBV抗原与不同剂量磷酸锌疫苗佐剂免疫获得的小鼠血清抗HBV IgG水平(1∶N)。
表3
通过数据分析可以看出，从第四周开始，各实验组都能产生抗-HBV IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值。其中HBV+Zn3(PO4)2 1mg组所取得的免疫效果最佳，28周之内其抗体滴度水平都显著高于无佐剂HBV亚单位疫苗组P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。第8周之后，所有添加佐剂的实验组均产生了显著高于HBV组的抗体水平。其中HBV+Zn3(PO4)2 1mg组、HBV+Zn3(PO4)2 1.5mg组和HBV+Zn(OH)2组抗体水平都显著高于HBV+Al(OH)3组，P＜0.05。提示磷酸锌具有能够增强HBV抗原的免疫效果的作用，其体液免疫增强效果高于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。见图3。
Claims (6)
1.磷酸锌作为疫苗佐剂的应用。
2.磷酸锌在制备疫苗佐剂中的应用。
3.磷酸锌疫苗佐剂在制备疫苗中的应用。
4.磷酸锌疫苗佐剂在制备甲肝疫苗中的应用。
5.如权利要求1-4中的任何一种应用，其特征在于所述磷酸锌的水合物化学式为Zn3(PO4)2·2H2O，化学式量为422.08，当其失去两个结晶水后，无水物化学式为Zn3(PO4)2，化学式量为386.08。
6.如权利要求1-4中的任何一种应用，其特征在于所述磷酸锌作为疫苗佐剂应用于人体的推荐剂量为：1mg。
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