JP2019527191A - 免疫増強剤、***不活化ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.実験材料
モノホスホリルリピドA、MPLと略す。
ムラミルジペプチド、MDPと略す。
MPL、MDPおよびβ−グルカンはすべてInvivoGen社製のものを使用した。
ゲンゲ属多糖類は陝西正大生物科学技術有限公司製のものを使用した。
ISA206は賽百克社製、ホワイトオイル、スパン、ツイーンは市販のものを使用した。
市販の***O、A、亜I三価ワクチンは内モンゴル金宇集団製のものを使用した。
6〜7週齢の健康で感染しやすい子豚、液相ブロッキングELISA抗体力価≦1:8。
免疫増強剤の主な成分は、モノホスホリルリピドA(MPL)、ムラミルジペプチド(MDP)、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類である。その製造方法としては各成分をpH8.0の0.1M Tris−HClに溶かした。
方法1:複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチン、すなわち複数成分配合免疫増強剤とツイーンを体積比96:4の割合で調製し、均一に混合して水相とし、ホワイトオイルとスパンを体積比96:4の割合で混合して油相とし、水相:油相の体積比を1:2の割合でワクチンを調製し、調製したワクチンを複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンとした。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンを使用する前に体積比1:9の割合で市販のワクチンと充分混合した。
1.ワクチンの調製
当該実施例は実施例1の第2の方法に基づいて***ワクチンを調製した。
複数成分配合免疫増強剤1と不活化抗原を1:9の割合で混合して水相溶液とし、ISA206を乳化缶に入れて、200回転/分の条件で、水相溶液を乳化缶に加えて、均一に攪拌して、2000回転/分で10分間攪拌した。得られた***不活化ワクチンを、複数成分配合免疫増強剤を含むFMD不活化ワクチン1と称し、FMD1と略す。
複数成分配合免疫増強剤2、3、4、5、6、7のワクチン製造方法は複数成分配合免疫増強剤1と同じで、複数成分配合免疫増強剤を含むFMD不活化ワクチン2、3、4、5、6、7を調製して、FMD2、3、4、5、6、7と略す。
実験のグループ分けと接種:健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、1つのグループを10頭ずつにし、全部で6グループとした。各グループのワクチンをそれぞれ1つのグループの健康で感染しやすい子豚に、分量2mLで接種した。
接種後の抗体の生成状況を観察測定し、接種後7日、14日、21日および28日目に、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血して、血清を分離して、蘭州獣医研究所の液相競合ELISA・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いて、ワクチン接種後の抗体の生成状況とウィンドウピリオドを観察測定した。
(液相ブロッキングELISA抗体の力価が26以上で合格とした。)
接種後の平均抗体レベルを図1に示した。
1.複数成分配合免疫増強剤の調製
複数成分配合免疫増強剤の主な成分は、モノホスホリルリピドA、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類である。その製造方法として、主な成分をそれぞれpH8.0の0.1M Tris−HClに溶かした。
(1)複数成分配合免疫増強剤とツイーンを96:4の割合で均一に混合して、水相を調製した。
(2)ホワイトオイルとスパンを96:4の割合で均一に混合した。
(3)水相と油相を体積比1:2の割合で充分混合して複合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを調製した。
複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチン300μLと1頭分のワクチンを充分混合した後接種する。
1.ワクチンの調製
複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンは実施例3で調製した3種類のシャペロンワクチンを用いた。
実験のグループ分けおよび接種:健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、各グループに10頭ずつ、全部で4つのグループとした。
各グループのワクチンを1つのグループに含まれる健康で感染しやすい子豚に接種した。
接種後の抗体の生成状況に対する観察測定:接種後7日、14日、21日と28日目において、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血し、血清を分離して、蘭州獣医研究所の液相競合ELISA・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いてワクチン接種後の抗体の生成状況とウィンドウピリオドを観察測定した。
(O型液相ブロッキングELISA抗体力価が26以上であれば抗体を合格とし、Aと亜I型液相ブロッキングELISA抗体力価が27以上であれば抗体を合格とした。)
1.ワクチンの調製
複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンには実施例3で調整した3種類のシャペロンワクチンを用いた。
ポリペプチドワクチンのロット番号:(2014)090297522
実験のグループ分けと接種:健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、各グループに10頭ずつ、全部で4グループとした。
各グループのワクチンを1つのグループに含まれる健康で感染しやすい子豚に接種した。
接種後の抗体の生成状況を観察測定し、接種後7日、14日、21日および28日目に、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血し、血清を分離して、蘭獣研の液相競合ELISA・サンドイッチ法抗体試薬キットおよび豚***ウィルスVPI構造たんぱく質抗体検出ELISAキット(ポリペプチド抗体の観察測定キットは上海申聯社のものを使用した)を用いて、ワクチン接種後の抗体の生成状況をそれぞれ観察測定した。
(液相ブロッキングELISA抗体の力価が26以上であれば抗体を合格とし、ポリペプチド抗体の観察測定は試薬キットの基準を用いて陰・陽性を判定した。)
(付記1)
5〜520μg/mLのモノホスホリルリピドAと、10〜520μg/mLのムラミルジペプチドと、1〜520μg/mLのβ−グルカンと、0.05〜5.2mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、複数成分配合免疫増強剤。
5〜500μg/mLのモノホスホリルリピドAと、10〜500μg/mLのムラミルジペプチドと、1〜500μg/mLのβ−グルカンと、0.05〜5.0mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、付記1に記載の複数成分配合免疫増強剤。
100〜500μg/mLのモノホスホリルリピドAと、100〜500μg/mLのムラミルジペプチドと、50〜500μg/mLのβ−グルカンと、1〜5.0mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、付記1に記載の複数成分配合免疫増強剤。
モノホスホリルリピドA、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類を含む溶液を調製し、ツイーン80と混合し、水相溶液を得るステップ1と、
ホワイトオイルとスパン80を混合し、油相溶液を得るステップ2と、
前記水相溶液と前記油相溶液を混合して乳化した後、複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを得るステップ3と、
を含むことを特徴とする、付記1ないし付記3のいずれか1つに記載の複数成分配合免疫増強剤の製造方法。
付記1ないし付記3のいずれか1つに記載の免疫増強剤のワクチン製造への応用。
付記1ないし付記3のいずれか1つに記載の複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチン。
不活化抗原溶液をさらに含むことを特徴とする、付記6に記載の***不活化ワクチン。
前記不活化抗原溶液と前記複数成分配合免疫増強剤との体積比は9:1〜8:1であることを特徴とする、付記7に記載の***不活化ワクチン。
前記不活化抗原溶液はO、A、亜I型***不活性化抗原、ポリペプチドあるいはその他の遺伝子工学発現産物の一種あるいは数種を含むことを特徴とする、付記7に記載の***不活化ワクチン。
複数成分配合免疫増強剤と不活化抗原溶液を混合した後、さらにツイーン80と充分混合して水相溶液を得るステップ1と、
ホワイトオイルとスパン80を混合して、油相溶液を得るステップ2と、
前記水相溶液と前記油相溶液を充分混合して複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチンを得るステップ3と、
を含むことを特徴とする、付記6に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチンの製造方法。
Claims (10)
- 5〜520μg/mLのモノホスホリルリピドAと、10〜520μg/mLのムラミルジペプチドと、1〜520μg/mLのβ−グルカンと、0.05〜5.2mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、複数成分配合免疫増強剤。
- 5〜500μg/mLのモノホスホリルリピドAと、10〜500μg/mLのムラミルジペプチドと、1〜500μg/mLのβ−グルカンと、0.05〜5.0mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、請求項1に記載の複数成分配合免疫増強剤。
- 100〜500μg/mLのモノホスホリルリピドAと、100〜500μg/mLのムラミルジペプチドと、50〜500μg/mLのβ−グルカンと、1〜5.0mg/mLのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、請求項1に記載の複数成分配合免疫増強剤。
- モノホスホリルリピドA、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類を含む溶液を調製し、ツイーン80と混合し、水相溶液を得るステップ1と、
ホワイトオイルとスパン80を混合し、油相溶液を得るステップ2と、
前記水相溶液と前記油相溶液を混合して乳化した後、複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを得るステップ3と、
を含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載の複数成分配合免疫増強剤の製造方法。 - 請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載の免疫増強剤のワクチン製造への応用。
- 請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチン。
- 不活化抗原溶液をさらに含むことを特徴とする、請求項6に記載の***不活化ワクチン。
- 前記不活化抗原溶液と前記複数成分配合免疫増強剤との体積比は9:1〜8:1であることを特徴とする、請求項7に記載の***不活化ワクチン。
- 前記不活化抗原溶液はO、A、亜I型***不活性化抗原、ポリペプチドあるいはその他の遺伝子工学発現産物の一種あるいは数種を含むことを特徴とする、請求項7に記載の***不活化ワクチン。
- 複数成分配合免疫増強剤と不活化抗原溶液を混合した後、さらにツイーン80と充分混合して水相溶液を得るステップ1と、
ホワイトオイルとスパン80を混合して、油相溶液を得るステップ2と、
前記水相溶液と前記油相溶液を充分混合して複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチンを得るステップ3と、
を含むことを特徴とする、請求項6に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む***不活化ワクチンの製造方法。
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