CN101967183B - 一种人工合成的新型抗血栓多肽衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种人工合成的具有抗血栓活性的多肽衍生物BNW，并公开了其制备方法以及作为抗血栓剂的应用。BNW利用多肽液相化学法合成并经C末端衍生化而来，含有3个氨基酸残基，序列为Pyr-Asn-Trp-NHPh，分子量为504，结构式如图.1。动物试验表明该多肽衍生物对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓的形成及对ADP诱发的小鼠急性肺血栓的形成均有抑制作用，并且可以延长小鼠的凝血时间。

Description

一种人工合成的新型抗血栓多肽衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及多肽衍生物，尤其涉及经人工衍生化并合成的具有抗血栓活性的多肽衍生物。本发明还涉及该多肽衍生物的制备方法以及作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。 

背景技术

细胞外基质(ECM)是血管壁的主要成分，其降解贯穿于动脉粥样硬化发生发展的整个过程。基质金属蛋白酶(MMPs)是分解细胞外基质的蛋白酶类中最重要的一类，参与了各种病理过程，包括血管再生、肿瘤浸润和转移、炎症反应等。近年来，国外大量文献报道了MMPs与动脉粥样硬化和冠心病的内在联系，并取得了一定的研究成果。 

动脉粥样硬化发病机理复杂，其中动脉粥样硬化斑块破裂并血栓形成是导致心血管疾病发病及死亡的重要原因。 

生理情况下，ECM处于不断产生和降解的动态平衡中，当ECM产生过多或降解过少时，可引起ECM过度堆积，而导致疾病发生。MMPs在此过程中起重要作用，其可降解基底膜和ECM的大多数蛋白质，如胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等。研究表明，ECM合成或降解代谢失衡与许多心血管疾病的发生有关，而MMPs表达活性增强可使ECM合成与降解失衡，两者参与心肌和血管重构及心室扩张，在心血管疾病的发病过程中起重要作用，用外源性基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)治疗实验性充血性心力衰竭(CHF)后的心室重构、血管成形术后再狭窄等有一定效果。因此，调节MMPs的活性可能是心血管疾病治疗，特别是血栓治疗的一个新方向，对其拮抗剂的进一步研究将促进临床的早日应用。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种人工合成的具有良好抗血栓活性的新型多肽衍生物BNW，其结构序列为Pyr-Asn-Trp-NHPh。 

根据基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)的设计思路，基于底物的MMPI的设计理论，利用多肽液相合成及多肽衍生化技术，设计完成了新型抗血栓多肽衍生物BNW，其氨基酸序列为Pyr-Asn-Trp-NHPh，分子量为504。 

本发明的目的之二是提供一种具有良好抗血栓活性的新型多肽衍生物BNW的制备方法。 

根据所设计的BNW结构序列，利用多肽液相合成和多肽衍生化技术进行合成。制备从C端到N端逐个进行。先将C末端色氨酸进行衍生化，得到Trp-苯胺·HCl，之后在缩合剂的作用下，逐个连接氨基酸，达到所要合成的肽链长度，最后利用切割液将肽链从树脂上裂解下来，即得粗品。经HPLC反相柱进行纯化后通过质谱分析确证。 

以上所述的多肽液相合成方法及多肽衍生化技术是本领域的常规并公知的技术。 

电刺激大鼠颈总动脉血栓形成、ADP诱发的小鼠急性肺血栓形成以及小鼠的凝血时间测定等动物实验证明，本发明的多肽衍生物BNW具有较强的抗血栓活性。 

本发明的目的之三是将新型多肽衍生物BNW应用于抗血栓药物的制备中。 

本发明的有益效果在于： 

根据基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)的设计思路，基于底物的MMPI的设计理论，利用多肽液相合成和多肽衍生化技术，设计完成的新型抗血栓多肽衍生物BNW具有结构简单、人工合成方便和良好的抗血栓活性等有益特点，有望成为一种极具应用潜力且安全有效的抗血栓多肽衍生化药物。 

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当指出，这些实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。 

本发明中所出现的缩略语的说明： 

THF    四氢呋喃 

DCC    二环己基酰亚胺 

Boc    叔丁氧羰基 

HOBt   N-羟基苯并*** 

DMF    二甲基甲酰胺 

DCM    二氯甲烷 

EA     醋酸乙酯 

Pet    石油醚 

C₄H₄O₂ 2-丁炔酸 

Fomc   9-芴甲氧羰基 

HOSU   N-羟基琥珀酰亚胺 

TFA    三氟乙酸 

TIS    三异丙基硅烷 

EDA    乙二胺 

实施例1新型抗血栓多肽衍生物BNW的制备及分离纯化 

按下述序列制备BNW。 

BNW的结构序列为：Pyr-Asn-Trp-NHPh。 

本实施例采用多肽液相合成技术进行手工合成，合成的多肽经高浓度的TFA切割后，得到粗品。经HPLC反相柱进行纯化后，通过质谱分析确证。具体实验步骤如下： 

1)BNW的制备 

以下制备抗血栓多肽衍生物BNW的保护氨基酸及缩合试剂、切割试剂均购买于上海吉尔生化有限公司。 

制备从C端到N端逐个进行。称取5g Boc-Trp、1.6g苯胺、2.3g HOBt以及4g DCC，混合后用DMF溶解，之后将完全溶解的混合液加入反应器过夜反应。点板确认反应完全(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝90∶8∶2)。反应完全后，抽滤，并用EA进行萃取，加水分层，之后再点板确认萃取完全。之后用柠檬酸水溶液及饱和NaCl溶液各洗2遍，进而用无水Na₂SO₄干燥，20min后浓缩，浓缩后加入2mol/L HCl/C₄H₄O₂脱去Boc，2h后点板检测反应完全后，浓缩尽干，加***析出固体(Trp-苯胺·HCl)，抽滤后烘干待用。接着称取5g Fomc-Asn(Trt)-OH、4g Trp-苯胺·HCl、1.8g HOBt、2ml DIEA以及2.6g DCC，混合后用DMF溶解，加入反应器后过夜反应。点板确认反应完全(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝90∶8∶2)。反应完全后，抽滤，并用EA进行萃取，加水分层，之后再点板确认萃取完全。用NaHCO₃、柠檬酸水溶液及饱和NaCl溶液各洗2遍，进而用无水Na₂SO₄干燥，30min后浓缩，浓缩至油状物，取下加入DCM溶解，待溶解完全后，加入20mlEDA反应4h以上，点板确认反应完全(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝90∶8∶2)。浓缩尽干，加Pet洗3遍，倾掉Pet获得油状物，继续浓缩尽干，待用。接着称取3g Pyr、3g HOSU、5.5g DCC，并以THF作为溶剂进行混合溶解，之后加入反应器过夜反应。点板确认反应完全(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝85∶10∶5)。反应完全后，抽滤掉固体，取下层液体，搅拌。然后将Asn(Trt)-Trp-苯胺用等摩尔的NaOH水溶液溶解，加入反应液中，反应2h后点板确认反应完全。反应完全后，用Pet洗反应液2次，调PH＝2-3时，用EA萃取产品，并用NaCl水溶液洗2次，干燥后浓缩尽干。加入切割液TFA∶H₂O∶TIS(95∶2∶3)搅拌2h。抽滤，在滤液中加入10倍体积的冰***，充分震荡后静置30min。抽干，真空干燥，即得BNW粗肽。 

2)BNW的纯化 

将200mg上述粗肽溶解于50mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化。色谱柱为Venusil XBPC18(L)30×250mm；流动相为A液：0.1％TFA-100％乙腈，B液：0.1％TFA-100％去离子水；梯度洗脱程序为(B)：0～25min，72％→62％，25～35min，62％→50％，35～40min，50％→0％。检测波长：220nm；体积流量：20ml/min；进样量：150mg；浓度：150mg/10ml(以甲醇和水为溶剂)。主峰分离效果较好，适合样品的大量制备。收集主峰峰尖部分后，用分析型反相HPLC对收集成分进行检测，色谱柱为Venusil XBP C18(L)4.6×250mm；流动相为A液： 0.1％TFA-100％去离子水，B液：0.1％TFA-100％乙腈，梯度洗脱程序为(B)：0～25min，30％→55％。每次梯度洗脱结束以后，均以100％B液平衡5min；检测波长：220nm；体积流量：1.0ml/min；进样量：10μl。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到BNW纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为504，与计算值相符。 

实施例2BNW对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓形成的影响 

1)样品溶液的配制 

阳性对照组临用前将氯吡格雷以生理盐水稀释成所需浓度的药液(2mg/ml)；BNW组临用前以0.2％L-精氨酸溶解，并以生理盐水稀释成所需浓度的药液(2mg/ml)。各组均尾静脉给药，容积为10ml/kg。 

2)动物模型的制备 

大鼠腹腔注射10mg/L戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)，麻醉后仰卧位固定。颈部正中线切口，游离右侧颈总动脉，近心端放置BT87-3型实验性体内血栓形成测定仪的刺激电极，远心端放置温度探头。当刺激电极接通电流后，以2mA直流电刺激动脉7min，使刺激部位的血管内皮受损，激活血小板和凝血***，管腔混合血栓逐渐形成，血流逐渐阻断，当血流完全阻断时，远端温度突降，仪器报警，显示堵塞时间(t_堵塞)，即血栓形成时间。 

3)实验步骤 

取Wistar大鼠32只，体重200-250g，雌雄各半，按体重随机分为4组，每组8只，即空白对照组，模型对照组，阳性对照组(剂量为20mg/kg)，BNW组(剂量为20mg/kg)。采用尾静脉注射给药，给药体积为10ml/kg，给药后15min开始刺激。空白对照组给予0.2％L-精氨酸，模型对照组给予生理盐水，阳性对照组给予氯吡格雷。 

4)统计学处理 

采用Excel软件处理数据。所有数据均表示为均数±标准差 

表示，两组间比较用t检验，结果见表1。 

表1各组对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓形成的影响 

统计方法：t检验；①P＜0.01，与模型对照组比较；②P＞0.05，与阳性对照组比较。 

从表1的数据可以看出，同等剂量(20mg/kg)的阳性对照组和BNW组同模型组相比有非常显著性差异，而BNW组与阳性对照组无显著性差异，故，判断BNW可以有效的抑制电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓的形成。 

实施例3BNW对ADP诱发的小鼠急性肺血栓形成的影响 

1)样品溶液的配制 

阳性对照组临用前将氯吡格雷以生理盐水稀释成所需浓度的药液(剂量为4mg/kg)；BNW组临用前以生理盐水稀释成所需浓度的药液(剂量为4mg/kg)；诱导剂ADP溶液临用前以纯水稀释成所需浓度(200mg/kg)。各组均尾静脉给药，容积为10ml/kg。 

2)实验步骤 

取健康ICR小鼠24只，体重20-25g，雌雄各半，按体重随机分为3组，每组8只，即模型对照组，阳性对照组、BNW组。各组均尾静脉给药，容积为10ml/kg，模型对照组给予等容积的生理盐水，阳性对照组给予氯吡格雷。给药后15min(阳性对照组给药2小时后)，按200mg/kg尾静脉注射ADP溶液，形成急性肺血栓(小鼠呼吸喘促、不能自主活动)，记录注射ADP后至小鼠恢复自主活动的时间(min)。 

3)统计学处理 

采用Excel软件处理数据。所有数据均表示为均数±标准差 

表示，两组间比较用t检验，结果见表2。 

表2各组对ADP诱发小鼠急性肺血栓形成的影响 

统计方法：t检验；①P＜0.01，与模型对照组比较；②P＞0.05，与阳性对照组比较。 

从表2的数据可以看出，同等剂量(4mg/kg)的阳性对照组和BNW组同模型组相比有非常显著性差异，而BNW组与阳性对照组无显著性差异，故，判断BNW可以有效的加速小鼠恢复自主活动时间，从而缓解ADP诱发的小鼠急性肺血栓的形成。 

实施例4BNW对小鼠体内凝血时间的影响 

1)样品溶液的配制 

阳性对照组临用前将氯吡格雷以生理盐水稀释成所需浓度的药液(剂量为4mg/kg)；BNW组临用前以生理盐水稀释成所需浓度的药液(剂量为4mg/kg)；各组均尾静脉给药，容积为 10ml/kg。 

2)实验步骤 

取健康ICR小鼠24只，体重20-25g，雌雄各半，按体重随机分为3组，每组8只，即模型对照组，阳性对照组、BNW组。各组均尾静脉给药，容积为10ml/kg，1次/d，连续4d，末次给药15min后(阳性对照组末次给药2小时后)，将玻璃毛细管***小鼠眼眶内使血液自行流出，用干棉球擦去第1滴血，再分别将血滴滴于清洁载玻片的两端，血滴直径5～10mm，立即开始计时。此后每隔30s，用干燥的针头挑动血液1次，至针头能挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间，另1滴血供最后复试。模型对照组给予等容积的生理盐水，阳性对照组给予氯吡格雷。 

3)统计学处理 

采用Excel软件处理数据。所有数据均表示为均数±标准差 

表示，两组间比较用t检验，结果见表3。 

表3各组对小鼠体内凝血时间的影响 

统计方法：t检验；①P＜0.05，与模型对照组比较；②P＞0.05，与阳性对照组比较。 

结果表明：阳性对照氯吡格雷组、化合物1组及化合物2组在同样浓度下都可以显著的延长小鼠体内凝血时间，初步判断具有抗血栓作用。且同剂量的阳性和样品组与空白组相比都有显著性差异，而样品组与阳性组无显著性差异。 

从表3的数据可以看出，同等剂量(4mg/kg)的阳性对照组和BNW组同空白对照组相比有显著性差异，而BNW组与阳性对照组无显著性差异，故，判断BNW可以有效的延长小鼠凝血时间。 

Claims (3)

1.一种具有抗血栓活性的多肽衍生物BNW，其结构序列为Pyr-Asn-Trp-NHPh，分子量为504。

2.一种制备权利要求1的多肽衍生物的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：

将C末端色氨酸进行衍生化，得到Trp-苯胺·HCl；

在缩合剂的作用下，逐个连接氨基酸，达到所要合成的肽链长度；

利用切割液将肽链从树脂上裂解下来，以得到所述多肽衍生物。

3.权利要求1的多肽衍生物在制备抗血栓药物中的用途。