CN101965408A - 针对多重靶的pi3k相互作用分子的选择性概况分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及其中通过使包含PI3K的蛋白质制剂与苯基噻唑配体1温育来鉴定PI3K相互作用化合物的方法。

Description

针对多重靶的PI3K相互作用分子的选择性概况分析

本发明涉及使用苯基噻唑配体1作为关于PI3K的配体，用于鉴定且表征PI3K相互作用分子和用于纯化PI3K的方法。此外，本发明涉及例如用于治疗癌症、代谢疾病或自身免疫/炎性病症的，包括所述相互作用分子的药物组合物。

激酶催化蛋白质、脂质、糖、核苷和其他细胞代谢产物的磷酸化，并且在真核细胞生理学的所有方面起关键作用。特别地，蛋白质激酶和脂质激酶参与信号事件，所述信号事件响应细胞外介质或刺激例如生长因子、细胞因子或趋化因子控制细胞的活化、生长、分化和存活。一般而言，蛋白质激酶分成2组，优先磷酸化酪氨酸残基的那些和优先磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基的那些。

不适当地高蛋白质激酶活性涉及许多疾病，包括癌症、代谢疾病和自身免疫/炎性病症。这可以通过由于酶的突变、超表达或不适当活化的控制机制失败直接或间接引起。在所有这些情况下，激酶的选择性抑制预期具有有利效应。

已成为药物开发的近期焦点的一组脂质激酶是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族。PI3K家族成员是脂质激酶，其催化γ-磷酸从ATP到磷脂酰肌醇及其衍生物(统称为磷酸肌醇)的3′羟基的转移。迄今为止已从哺乳动物细胞中分离出PI3K家族的8个成员(同种型)，并且根据其一级结构和底物特异性分成3个类别(类别IA：PI3Kα、β和δ；类别IB：PI3Kγ；类别II：PI3KC2α、β和γ；类别III：Vps34酵母同系物(Fruman等人，1998.Phosphoinositide kinases.Annual Review Biochemistry 67，481-507；Cantley，L.C.，2002，Science 296，1655-1657)。

已知哺乳动物细胞表达PI3K IA类的催化亚单位的3个同种型(p110α、p110β和p110δ，同义词“PI3Kδ”)。类别IB仅包含一个成员(催化亚单位)，其已命名为p110γ或PI3Kγ。除了其脂质激酶活性外，PI3Kγ还显示丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶活性，如由自磷酸化证实的。

其中编码PI3Kγ或δ的基因被缺失的经遗传处理的小鼠的研究给出关于这些激酶的生理学功能及其作为药物靶的潜在效用的重要信息。缺乏PI3Kγ或δ的小鼠是存活的并且显示特征性表型，暗示几种潜在的治疗适应症。PI3Kγ看起来是先天性免疫***的主要介质。例如，PI3Kγ缺陷巨噬细胞和嗜中性粒细胞显示浸润发炎腹膜的能力受损。肥大细胞代表在PI3Kγ缺陷小鼠中受累的另一种细胞类型。缺乏PI3Kδ的小鼠的表型的特征在于淋巴细胞功能的损害，并且指向适应性免疫应答控制中的主导因素(Wetzker和Rommel，Current Pharmaceutical Design，2004，10，1915-1922)。

与广泛表达的PI3Kα和β同种型形成对比，造血特异性同种型PI3Kγ和δ暗示重要的治疗适应症。2种同种型表现为用于治疗由过度活跃的吞噬细胞、肥大细胞、B和T淋巴细胞介导的自身免疫/炎性疾病(例如类风湿性关节炎、哮喘或过敏反应)的理想靶。为了避免不希望有的副作用，需要高度同种型选择性的抑制剂(Ohashi和Woodgett 2005，Nature Medicine 11，924-925)。

磷脂酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)家族成员是涉及细胞周期进展、DNA重组和DNA损伤检测的高分子量激酶。在具有毛细血管扩张性共济失调症的患者细胞中缺陷且涉及细胞对损伤DNA的检测和应答的人ATM基因是这个家族的成员。另一个是mTOR(同义词FRAP)，其涉及雷帕霉素敏感途径，导致G1细胞周期进展(Shilo，2003.Nature Reviews Cancer 3，155-168)。

关于鉴定和表征PI3K抑制剂的一个先决条件是合适测定法的提供，优选生理学形式的蛋白质靶。在本领域中，已提出几种策略以解决这个问题。

常规地，PI3K脂质激酶家族活性可以使用经纯化的酶或重组酶在具有磷脂(原文为phopholipid，疑为phospholipid)囊泡的基于溶液的测定法中进行测量。通过添加酸化的有机溶剂和通过萃取或薄层色谱法分析的后续相分离来终止反应(Carpenter等人，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。

本领域描述的另一种测定法基于从放射性标记的ATP到固定在平板上的磷脂酰肌醇的磷酸盐转移。这种测定法类型也使用重组PI3Kγ酶，但可以以高通量方式执行(Fuchikami等人，2002，J.Biomol.Screening 7，441-450)。

另外一种生物化学筛选测定法基于使用荧光团标记的磷酸肌醇的竞争荧光偏振(FP)形式(Drees等人，2003，Comb.Chem.High Throughput Screening 6，321-330)。

最后，报告了基于荧光显微镜成像和自动化图像分析的基于细胞的Akt-EGFP再分布测定法。为此，用人胰岛素受体和Akt1-增强绿色荧光蛋白(EGFP)融合构建体稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在用***1(IGF-1)刺激后，PI3K被激活，并且Akt1-EGFP蛋白质被召募至细胞膜。用PI3K同种型选择性抑制剂验证再分布测定法显示，PI3Kα是在IGF-1刺激后在CHO宿主细胞中激活的主要同种型(Wolff等人，Comb.Chem.High Throughput Screen.9，339-350)。

尽管不是所有情况下用于鉴定选择性激酶抑制剂需要的另一个先决条件是允许测定这些分子的靶选择性的方法。例如，可以预期提供与特定药物靶结合且抑制其但不与紧密相关的靶相互作用的分子，所述紧密相关靶的抑制可以导致副作用。常规地，个别酶测定法的大实验对象组用于评估化合物对于激酶的抑制效应(Knight等人，2004.Bioorganic and Medicinal Chemistry 12，4749-4759；Knight等人，2006，Cell 125，733-747)。最近，在噬菌体上展示的激酶或激酶结构域已用于评估给定化合物与大激酶组相互作用的能力(Karaman等人，2008.Nature Biotechnology 26，127-132)。此外，已描述了允许激酶抑制剂针对蛋白质组的概况分析的化学蛋白质组学方法(WO2006/134056；Bantscheff等人，2007.Nature Biotechnology 25，1035-1044；Patricelly等人，2007.Biochemistry 46，350-358；Gharbi 等人，2007.Biochem.J.404，15-21；WO2008/015013)。

由上文看来，需要提供用于鉴定且选择性概况分析PI3K相互作用化合物的有效方法以及用于纯化PI3K的方法。

为了顺应这个需要，本发明在第一个方面提供了用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)使苯基噻唑配体1-PI3K复合物与给定化合物温育，

d)测定化合物是否能够使PI3K与经固定的苯基噻唑配体1分离，和

e)测定化合物是否还能够使ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR与经固定的苯基噻唑配体1分离。

在第二个方面，本发明涉及用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)检测在步骤b)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物，和

d)检测在步骤b)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

在第三个方面，本发明提供了用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂的2个等分试样，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使一个等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使另一个等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1和给定化合物接触，

d)测定在步骤b)和c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量，和

e)测定在步骤b)和c)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

在第四个方面，本发明涉及用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤：

a)提供各自包括包含PI3K的至少一个细胞的2个等分试样，

b)使一个等分试样与给定化合物温育，

c)收获每个等分试样的细胞，

d)使细胞裂解，以便获得蛋白质制剂，

e)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和

f)测定在步骤e)中每个等分试样中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量，和

g)测定在步骤e)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

在本发明的背景中，已令人惊讶地发现苯基噻唑配体1是PI3K配体和PIKK家族其他成员(即ATM、ATR、DNAPK和mTOR(FRAP))的配体。这使得苯基噻唑配体1在筛选测定法中的使用成为可能，例如在竞争筛选测定法中以及在用于纯化PI3K的方法中。

苯基噻唑配体1的结构在图1中给出。这种化合物是取代的噻唑(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺)，根据图1，其在液体溶液中具有盐酸盐作为阴离子。然而，在本发明的背景中还设想了进一步的抗衡离子。苯基噻唑配体1可以经由伯氨基与合适的固体支持物材料共价偶联，并且用于分离结合蛋白质。苯基噻唑配体1的合成在实施例1中描述。根据本发明，表达“苯基噻唑配体1”还包括这样的化合物，其包含等同核心但具有另一个接头，优选与并非环状结构的部分的氮偶联，用于与固体支持物连接。一般地，接头具有8、9或10个原子的主链。接头可以包含羧基、羟基或氨基活性基团。

因此，在一个优选实施方案中，表达“苯基噻唑配体1”还包括这样的化合物，其具有相同的N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心但包括在N-原子处的另一个接头，例如C1-C8烷基羰基或C1-C8烷基氨基羰基，其中任何一个任选由下述取代：卤素、羟基、氨基、C1-C8-烷氨基、C1-C8-烷氧羰基、任选由羟基取代的C1-C8-烷氧基、或任选由羟基或卤素取代的C1-C8-烷基。此外，这个表达还包括如上所述的化合物，其具有另一个卤素例如溴代替4-氯残基，或在苯环上例如由卤素进一步取代。此外，代替甲磺酰基，还可能存在任选由卤素取代的另一个基团如羟基、羧基或C1-C8烷基。

在一个特别优选的实施方案中，归入表达“苯基噻唑配体1”的化合物选自3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐、3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺、和具有相同的N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心的化合物，所述化合物仅在N-原子处由C1-C8烷基羰基或C1-C8烷基氨基羰基进一步取代，其中任何一个任选由下述取代：卤素、羟基、氨基、C1-C8-烷氨基、C1-C8-烷氧羰基、任选由羟基取代的C1-C8-烷氧基、或任选由羟基或卤素取代的C1-C8-烷基。

根据本发明，“PI3K”包括PI3K家族的所有成员，包括类别IA(例如PI3Kα、β和δ)、类别IB(例如PI3Kγ)、类别II(例如PI3KC2α、β和γ)和类别III(例如Vps34酵母同系物)。

人PI3Kγ(类别IB迄今为止唯一已知的成员)的序列在图4中给出。

PI3Kδ(类别IA的成员)的序列在图5中给出。

根据本发明，表达“PI3K”指这个家族的人和其他蛋白质。该表达特别包括其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同系物、或由在低严格条件下与编码所述蛋白质的核酸杂交的核酸编码的变体。优选地，这些低严格条件包括在包含35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％BSA、100ug/ml变性鲑精DNA和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖的缓冲液中于40℃杂交18-20小时，在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中于55℃洗涤1-5小时，并且在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中于60℃洗涤1.5小时。

根据本发明，“ATM”意指毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白质。ATM蛋白质是蛋白质的磷脂酰肌醇-3激酶家族的成员，其通过使涉及DNA修复和/或细胞周期控制的关键底物磷酸化而响应DNA损伤(Shilo，2003.Nature Reviews Cancer 3，155-168)。

根据本发明，“ATR”意指毛细血管扩张性共济失调症和RAD3相关蛋白质(同义词FRAP相关蛋白质1、FRP1)。

根据本发明，“DNAPK”意指DNA依赖性蛋白质激酶。PRKDC基因编码核DNA依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(DNA-PK)的催化亚单位。第二个组分是自身免疫抗原Ku(152690)，其由在染色体22q上的G22P1基因编码。单独地，DNA-PK的催化亚单位是无活性的，并且依赖于G22P1组分，以将其导向DNA且触发其激酶活性；PRKDC必须与DNA结合以表达其催性质。

根据本发明，“mTOR”意指雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR，也称为FRAP或RAFT1)(Tsang等人，2007，Drug Discovery Today 12，112-124)。mTOR蛋白质是289kDA的大激酶，其出现在迄今为止测序的所有真核生物中。羧基末端“磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)相关激酶”(PIKK)结构域的序列在物种之间是高度保守的，并且显示丝氨酸和苏氨酸激酶活性但无可检测的脂质激酶活性。

根据本发明，表达“ATM”、“ATR”、“DNAPK”或“mTOR”涉及这个家族的人和其他蛋白质(Shilo，2003.Nature Reviews Cancer 3，155-168)。该表达特别包括其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同系物、或由在低严格条件下与编码所述蛋白质的核酸杂交的核酸编码的变体。优选地，这些低严格条件包括在包含35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％BSA、100ug/ml变性鲑精DNA和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖的缓冲液中于40℃杂交18-20小时，在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中于55℃洗涤1-5小时，并且在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中于60℃洗涤1.5小时。

苯基噻唑配体1是关于PI3K的所有同种型的配体(参见上文)。然而，本发明自始至终，优选PI3K是PI3Kγ或PI3Kδ，特别是其人同种型。

在本发明的某些方面，首先提供了包含PI3K的蛋白质制剂。本发明的方法可以用任何蛋白质制剂作为原材料执行，只要PI3K溶解于制剂中。例子包括几种蛋白质的液体混合物、细胞裂解物、包含在原始细胞或几种细胞裂解物的组合中存在的并非所有蛋白质的部分细胞裂解物，特别是在其中并非每一种目的靶蛋白质都存在于每一种细胞裂解物中的情况下。术语“蛋白质制剂”还包括溶解的纯化蛋白质。

PI3K蛋白质种类在目的蛋白质制剂中的存在可以在用抗体探测的蛋白质印迹上进行检测，所述抗体特异性针对PI3K。在PI3K是特异性同种型(例如PI3Kγ和/或PI3Kδ)的情况下，所述同种型的存在可以通过同种型特异性抗体进行测定。此类抗体是本领域已知的(Sasaki 等人，2000，Nature 406，897-902；Deora等人，1998，J.Biol.Chem.273，29923-29928)。备选地，还可以使用质谱法(MS)(参见下文)。

ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR蛋白质在目的蛋白质制剂中的存在可以在用抗体探测的蛋白质印迹上进行检测，所述抗体对于所述蛋白质特异。

通过首先分离细胞的细胞器(例如核、线粒体、核糖体、高尔基体等)，并且随后制备衍生自这些细胞器的蛋白质制剂，可以获得细胞裂解物或部分细胞裂解物。用于分离细胞的细胞器的方法是本领域已知的(第4.2章Purification of Organelles from Mammalian Cells in”Current Protocols in Protein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。

此外，通过细胞提取物的分馏，从而富集特定类型的蛋白质例如细胞质或膜蛋白质，可以制备蛋白质制剂(第4.3章Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells in”Current Protocols in Protein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。

此外，可以使用来自体液的蛋白质制剂(例如血液、脑脊髓液、腹膜液和尿)。

例如，可以使用衍生自模型生物体例如线虫(C.elegans)的限定发育期或成体期的整个胚胎裂解物。此外，整个器官例如从小鼠中解剖的心脏可以是蛋白质制剂的来源。这些器官也可以在体外进行灌注，以便获得蛋白质制剂。

此外，蛋白质制剂可以是包含已重组产生的PI3K的制剂。用于在原核和真核细胞中产生重组蛋白质的方法是广泛建立的(第5章Production of Recombinant Proteins in”Current Protocols in Protein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，1995，ISBN：0-471-14098-8)。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，蛋白质制剂的提供包括收获包含PI3K的至少一个细胞且使细胞裂解的步骤。

用于这个用途的合适细胞是表达PI3K家族成员的那些细胞或组织。PI3K家族的成员在大多数细胞和组织中表达。PI3Kγ在造血***的细胞(例如粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和血小板)中优先表达，而且在心肌细胞、血管平滑肌和血管上皮细胞中表达。PI3Kδ在淋巴细胞、粒细胞和肥大细胞中以显著表达进行遍在表达。

因此，在一个优选实施方案中，从外周血中分离的细胞代表合适的生物材料。用于分离和培养得自外周血的人淋巴细胞和淋巴细胞亚群(PBLs)的操作是广泛已知的(W.E Biddison，第2.2章“Preparation and culture of human lymphocytes”in Current Protocols in Cell Biology，1998，John Wiley & Sons，Inc.)。例如，密度梯度离心是用于使淋巴细胞与其他血细胞群体(例如红细胞和粒细胞)分离的方法。人淋巴细胞亚群可以经由其特异性细胞表面受体进行分离，所述细胞表面受体可以由单克隆抗体识别。物理分离方法涉及这些抗体试剂与磁珠的偶联，所述磁珠允许富集由这些抗体结合的细胞(阳性选择)。通过加入针对T细胞受体或共受体例如CD-3的抗体以起始T细胞受体信号和PI3K的后续磷酸化，可以进一步培养且刺激经分离的淋巴细胞(Houtman等人，2005，The Journal of Immunology 175(4)，2449-2458)。

作为原代人细胞的备选物，可以使用经培养的细胞系(例如MOLT-4细胞或大鼠嗜碱细胞性白血病(RBL-2H3)细胞)。通过经由多价抗原交联关于IgE的高亲和力受体(FcεRI)以诱导PI3K的激活，可以刺激RBL-2H3(Kato等人，2006，J.Immunol.177(1)：147-154)。

在一个优选实施方案中，细胞是细胞培养***的部分，并且用于从细胞培养***中收获细胞的方法是本领域已知的(同上的文献)。

细胞的选择将主要依赖于PI3K的表达，因为必须确保蛋白质主要存在于选择的细胞中。为了测定给定细胞是否是用于本发明的方法的合适起始***，方法如蛋白质印迹、基于PCR的核酸检测方法、RNA印迹和DNA微阵列方法(“DNA芯片)可能是合适的，以便测定目的给定蛋白质是否存在于细胞中。

细胞的选择还可以受研究目的影响。如果需要分析关于给定药物的体内功效，那么可以选择其中发生所需疗效的细胞或组织(例如粒细胞或肥大细胞)。相比之下，为了阐明介导不希望有的副作用的蛋白质靶，可以分析其中观察到副作用的细胞或组织(例如心肌细胞、血管平滑肌或上皮细胞)。

此外，在本发明内设想包含PI3K的细胞可以例如通过活组织检查得自生物体。相对应方法是本领域已知的。例如，活组织检查是用于获得小量组织的诊断操作，其随后可以用显微镜或用生物化学方法进行检查。活组织检查对于诊断、分类和分级疾病是重要的，对于评估和监控药物治疗也是重要的。

在本发明内包括的是，通过至少一个细胞的收获，同时执行裂解。然而，同样优选首先收获细胞并且随后分开裂解。

用于细胞裂解的方法是本领域已知的(Karwa和Mitra：Sample preparation for the extraction，isolation，and purification of Nuclei Acids；“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry”中的第8章，Wiley 2003，编辑：Somenath Mitra，出版ISBN：0471328456；在线ISBN：0471457817)。通过匀浆器(例如，波特(Potter)匀浆器)、超声磨碎机、酶促裂解、去污剂(例如NP-40、Triton X-100、CHAPS、SDS)、渗透休克、反复冻融或这些方法的组合，可以达到不同细胞类型和组织的裂解。

根据本发明的方法，在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使包含PI3K的蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触。

在本发明中，术语“苯基噻唑配体1-PI3K复合物”指示其中苯基噻唑配体1例如通过共价或最优选地通过非共价结合与PI3K相互作用的复合物。相同定义还应用于苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK或mTOR之间的复合物。

技术人员应了解可以应用何种条件，以便使得苯基噻唑配体1-PI3K复合物的形成成为可能。

在本发明的背景中，术语“在允许复合物形成的条件下”包括在其下此类形成优选此类结合是可能的所有条件。这包括具有在固定相上的固体支持物且将裂解物倾倒在其上的可能性。在另一个优选实施方案中，还包括固体支持物是颗粒形式且与细胞裂解物相混合。

在非共价结合的背景中，苯基噻唑配体1和PI3K之间的结合例如经由盐桥、氢键、疏水性相互作用或其组合。

在一个优选实施方案中，苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的步骤在基本生理条件下执行。蛋白质在细胞内的物理状况在Petty，1998(Howard R.Petty，第1章，Unit 1.5 in：Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，Joe B.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，and Kenneth M.Yamada(编辑)Current Protocols in Cell Biology Copyright 2003 John Wiley & Sons，Inc.保留所有权利。DOI：10.1002/0471143030.cb0101s00在线公布日期：2001年5月印刷出版日期：1998年10月)中描述。

在基本生理条件下的接触具有下述优点：配体、细胞制剂(即待表征的激酶)和任选地化合物之间的相互作用尽可能多地反映自然条件。“基本生理条件”尤其是存在于原始、未加工的样品材料中的那些条件。它们包括生理学蛋白质浓度、pH、盐浓度、缓冲容量和所涉及蛋白质的翻译后修饰。术语“基本生理条件”不需要与样品由其衍生的原始活生物体中的那些等同的条件，而是基本上细胞样的条件或接近于细胞条件的条件。当然，本领域技术人员应认识到，由于将最终导致较少细胞样条件的实验设置可能出现特定限制。例如，当从活生物体中获得且加工样品时，最终必需的细胞壁或细胞膜断裂可能要求与生物体中发现的生理条件不等同的条件。用于实践本发明的方法的生理条件的合适变异对于本领域技术人员是显而易见的，并且由如本文所使用的术语“基本生理条件”包括。总之，应当理解术语“基本生理条件”指接近于如例如在天然细胞中发现的生理条件的条件，但不一定要求这些条件是等同的。

例如，“基本生理条件”可以包括50-200mM NaCl或KCl、pH 6.5-8.5、20-37℃和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++、Ca++)；更优选约150m NaCl或KCl、pH7.2至7.6、5mM二价阳离子，并且通常包括0.01-1.0％非特异性蛋白质(例如BSA)。通常可以存在非离子型去污剂(Tween、NP-40、Triton-X100)，通常以约0.001至2％、一般0.05-0.2％(体积/体积)。关于一般指导，可以应用下述缓冲水性条件：10-250mM NaCl、5-50mM Tris HCl、pH5-8，伴随一种或多种二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子型去污剂的任选添加。

优选地，“基本生理条件”意指6.5至7.5、优选7.0至7.5的pH，和/或10至50mM、优选25至50mM的缓冲浓度，和/或120至170mM、优选150mM的单价盐(例如Na或K)浓度。二价盐(例如Mg或Ca)可以进一步以1至5mM、优选1至2mM的浓度存在，其中更优选地缓冲剂选自Tris-HCl或HEPES。

在本发明的背景中，苯基噻唑配体1固定在固体支持物上。本发明自始至终，术语“固体支持物”指能够在其表面上固定小分子配体的每一种不溶解的支持物。

根据一个进一步优选的实施方案，固体支持物选自琼脂糖、经修饰的琼脂糖、琼脂糖珠(例如NHS活化的琼脂糖)、乳胶、纤维素和铁磁性或亚铁磁性颗粒。

苯基噻唑配体1可以与固体支持物共价或非共价偶联。非共价结合包括经由与链霉亲和素基质结合的生物素亲和配体的结合。

优选地，苯基噻唑配体1与固体支持物共价偶联。

在偶联前，基质可以包含活性基团例如NHS、碳化二亚胺等，以使得与苯基噻唑配体1的偶联反应成为可能。苯基噻唑配体1可以通过直接偶联(例如使用官能团例如氨基、巯基、羧基、羟基、醛和酮基团)和通过间接偶联(例如经由生物素、与苯基噻唑配体1共价附着的生物素和生物素与链霉亲和素(其与固体支持物直接结合)的非共价结合)与固体支持物偶联。

与固体支持物材料的连接可以涉及可切割和不可切割接头。切割可以通过酶促切割或用合适的化学方法处理来达到。

用于使苯基噻唑配体1与固体支持物材料结合的优选结合界面是具有C-原子主链的接头。一般地接头具有8、9或10个原子的主链。接头可以包含羧基或氨基活性基团。

技术人员应当理解在本发明的方法的个别步骤之间，洗涤步骤可能是必需的。此类洗涤是本领域技术人员知识的部分。洗涤作用于从固体支持物中去除细胞裂解物的非结合组分。非特异性(例如简单离子)结合相互作用可以通过加入低水平的去污剂或通过适度调整至洗涤缓冲液中的盐浓度降到最低。

根据本发明的鉴定方法，读出***是PI3K的检测或测定(本发明的第一个方面)、苯基噻唑配体1-PI3K复合物的检测(本发明的第二个方面)、或苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量的测定(本发明的第二个、第三个和第四个方面)。

本发明自始至终，用于测定或检测PI3K、检测苯基噻唑配体1-PI3K复合物、或测定苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量的相同读出***可以用于检测ATM、ATR、DNAPK或mTOR，或检测或测定苯基噻唑配体1与所述蛋白质之间的复合物的量。这暗示在其中使用对于PI3K特异的试剂(例如抗体)的情况下，必须使用对于ATM、ATR、DNAPK或mTOR特异的抗体代替。因此，下文给出的实施方案和说明也应用于检测ATM、ATR、DNAPK或mTOR，或检测复合物，或测定苯基噻唑配体1与所述蛋白质之间的复合物的量。

在根据本发明的第一个方面的方法中，经分离的PI3K的检测或测定优选指示化合物能够使PI3K与经固定的苯基噻唑配体1分离的事实。这种能力指示分别的化合物与PI3K相互作用，优选结合至PI3K，这指示其治疗潜力。

在根据本发明的第二个方面的方法的一个实施方案中，检测出在本发明的方法过程中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物。此类复合物形成的事实优选指示化合物不完全抑制复合物的形成。另一方面，如果未形成复合物，那么推测化合物是与PI3K的强相互作用物，这指示其治疗潜力。

根据本发明的第二个、第三个和第四个方面的方法，测定在方法的过程中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。一般而言，在分别化合物的存在下形成越少的复合物，分别化合物与PI3K的相互作用越强，这指示其治疗潜力。

根据本发明的第二个方面苯基噻唑配体1-PI3K复合物的检测可以通过使用针对PI3K的经标记的抗体和合适的读出***来进行。

根据本发明的第二个方面的一个优选实施方案，苯基噻唑配体1-PI3K复合物通过测定其量进行检测。

在本发明的第二个、第三个和第四个方面的过程中，优选PI3K与经固定的苯基噻唑配体1分离，以便测定苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

根据本发明，分离意味着破坏苯基噻唑配体1与PI3K之间的相互作用的每一个动作。在一个优选实施方案中，这包括从经固定的苯基噻唑配体1中洗脱PI3K。

洗脱可以通过如下文详细描述的使用非特异性试剂来达到(离子强度、pH值、去污剂)。此外，可以测试目的化合物是否可以从苯基噻唑配体1中特异性洗脱PI3K。此类PI3K相互作用化合物在下述部分中进一步描述。

用于破坏相互作用的此类非特异性方法原则上是本领域已知的，并且依赖于配体酶相互作用的性质。原则上，离子强度的改变、pH值、温度或与去污剂温育是使靶酶与经固定的配体解离的合适方法。洗脱缓冲液的应用可以通过极端pH值(高或低pH；例如通过使用0.1M柠檬酸盐，pH2-3降低pH)，改变离子强度(例如使用NaI、KI、MgCl2或KCl的高盐浓度)，破坏疏水性相互作用的极性还原剂(例如二噁烷或乙二醇)，或变性剂(离液盐或去污剂例如十二烷基硫酸钠，SDS；Review：Subramanian A.，2002，Immunoaffinty chromatography)来解离结合配偶体。

在某些情况下，固体支持物已优选与所释放的材料分离。关于这点的个别方法依赖于固体支持物的性质，并且是本领域已知的。如果固体材料包含在柱内，那么所释放的材料可以作为柱流出物(flowthrough)进行收集。在支持物材料与裂解物组分相混合的情况下(所谓的批操作)，另外的分离步骤例如温和离心可能是必需的，并且所释放的材料作为上清液进行收集。备选地，磁珠可以用作固体支持物，从而使得珠可以通过使用磁性装置从样品中消除。

在根据本发明的第一个方面的方法的步骤d)中，测定PI3K是否已与经固定的苯基噻唑配体1分离。这可以包括PI3K的检测或PI3K量的测定。

因此，至少在本发明的所有鉴定方法的优选实施方案中，使用用于检测经分离的PI3K或用于测定其量的方法。此类方法是本领域已知的，并且包括物理化学方法例如蛋白质测序(例如Edmann降解)、通过质谱法的分析或采用针对PI3K的抗体的免疫检测方法。

本发明自始至终，如果使用抗体以便检测PI3K或以便测定其量(例如经由ELISA)，那么技术人员应当理解，如果待检测PI3K的特定同种型，或待测定PI3K的特定同种型的量，那么可以使用同种型特异性抗体。如上所述，此类抗体是本领域已知的。此外，技术人员知道用于产生抗体的方法。

优选地，检测PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR，或通过质谱法或免疫检测方法测定所述蛋白质的量。在下文中，这将通过提及PI3K更详细地说明，但下文描述的实施方案和说明也应用于ATM、ATR、DNAPK或mTOR。

用质谱分析(质谱法)鉴定蛋白质是本领域已知的(Shevchenko 等人，1996，Analytical Chemistry 68：850-858；Mann等人，2001，Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry，Annual Review of Biochemistry 70，437-473)，并且在实施例部分进一步举例说明。

优选地，质谱分析以定量方式执行，例如通过使用iTRAQ技术(关于相对和绝对定量的等压标记物)或cICAT(可切割的同位素编码的亲和标记物)(Wu等人，2006.J.Proteome Res.5，651-658)。

根据本发明的一个进一步优选的实施方案，通过鉴定PI3K的蛋白分型(proteotypic)肽来执行通过质谱法(MS)的表征。想法是PI3K用蛋白酶进行消化，并且所得到的肽通过MS进行测定。因此，关于来自相同来源蛋白质的肽的肽频率相差很大程度，“一般”促成这种蛋白质鉴定的最通常观察到的肽被称为“蛋白分型肽”。因此，如本文所使用的，蛋白分型肽是独特地鉴定特定蛋白质或蛋白质同种型的在实验上可良好观察的肽。

根据一个优选实施方案，通过使在实践本发明的方法的过程中获得的蛋白分型肽与已知蛋白分型肽相比较来执行表征。因为当使用通过蛋白酶消化制备的片段用于鉴定MS中的蛋白质时，通常对于给定酶观察到相同蛋白分型肽，所以可以使对于给定样品获得的蛋白分型肽与对于给定酶类别的酶已知的蛋白分型肽相比较，并且从而鉴定样品中存在的酶。

作为质谱分析的备选方法，可以检测经洗脱的PI3K(包括共洗脱的结合配偶体或支架蛋白质)，或通过使用针对PI3K的特异性抗体(或针对PI3K的同种型，参见上文)可以测定其量。

此外，在另一个优选实施方案中，一旦共洗脱的结合配偶体的特性已通过质谱分析进行确认，每个结合配偶体就可以用针对这种蛋白质的特异性抗体进行检测。

合适的基于抗体的测定法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测定法、夹心ELISA测定法和抗体阵列或其组合。此类测定法的建立是本领域已知的(Short Protocols in Molecular Biology.第4版中的第11章，Immunology，第11-1至11-30页，由F.M.Ausubel等人编辑，Wiley，New York，1999)。

这些测定法不仅可以以检测且定量目的PI3K相互作用蛋白质的方法进行配置(例如，PI3K复合物的催化或调节亚单位)，还可以分析翻译后修饰模式例如磷酸化或遍在蛋白修饰。

此外，本发明的鉴定方法涉及化合物的使用，所述化合物就其成为PI3K相互作用化合物的能力进行测试。

原则上，根据本发明，此类化合物可以是能够与PI3K相互作用的每一种分子，例如通过抑制其与苯基噻唑配体1的结合。优选地，化合物对PI3K具有作用，例如刺激或抑制作用。

优选地，所述化合物选自合成或天然存在的化学化合物或有机合成药物，更优选小分子、有机药物或天然小分子化合物。优选地，所述化合物从包含此类化合物的文库开始进行鉴定。随后，在本发明的过程中，筛选此类文库。

此类小分子优选不是蛋白质或核酸。优选地，小分子显示出小于1000Da、更优选小于750Da、最优选小于500Da的分子量。

根据本发明的“文库”涉及以分类方式提供的(众多)不同化学实体的(主要是大的)集合，所述分类方式使得不同个别实体的快速功能分析(筛选)成为可能，并且同时提供形成文库的个别实体的快速鉴定。例子是在表面上的管或孔或斑点的集合，其包含可以以高通量形式与一种或多种限定的潜在相互作用配偶体一起加入反应内的化学化合物。在鉴定2种配偶体的所需“正”相互作用后，由于文库构建，可以容易地鉴定分别化合物。合成和天然来源的文库可以进行购买或通过技术人员进行设计。

文库构建的例子在例如Breinbauer R，Manger M，Scheck M，Waldmann H.Natural product guided compound library development.Curr Med Chem.2002Dec；9(23)：2129-45中提供，其中描述了用于设计组合文库的生物学验证初始点的自然产物，因为它们具有经证明的生物学关联性记录。根据关于由结构生物学和生物信息学获得的蛋白质的结构域体系结构，可以解释自然产物在药物化学和化学生物学中的专门作用。为了实现在结构域家族内个别结合袋的特定需求，可能必须通过化学变异最佳化自然产物结构。固相化学被说成变成用于这个最佳化过程的有效工具，并且这个领域中的近期进展在这个综述文章中突出显示。其他相关参考文献包括Edwards PJ，Morrell AI.Solid-phasecompound library synthesis in drug design and development.Curr Opin Drug Discov Devel.2002 Jul；5(4)：594-605.；Merlot C，Domine D，Church DJ.Fragment analysis in small molecule discovery.Curr Opin Drug Discov Devel.2002 May；5(3)：391-9.Review；Goodnow RA Jr.Current practices in generation of small molecule new leads.J Cell Biochem Suppl.2001；Suppl 37：13-21；这描述了在许多药物公司中的目前药物开发过程需要大的和增长中的高品质先导物(lead)结构集合用于在高通量筛选测定法中使用。具有多样结构和“药物样”性质的小分子的集合在过去已通过几种方法获得：通过先前内部先导物最佳化努力的档案，通过从化合物卖主购买，和通过在公司合并后的分开集合的联合。尽管高通量/组合化学被描述为新先导物产生的过程中的主要组分，但用于文库成员的合成和后续设计的文库设计的选择已进化为激发和重要的新水平。针对多重生物学靶筛选多重小分子化合物文库设计的潜在利益提供了开发新先导物结构的重要机会。

在本发明的第二个和第三个方面的一个优选实施方案，包含PI3K的蛋白质制剂首先与化合物温育，并且随后与经固定的苯基噻唑配体1温育。然而，化合物和经固定的苯基噻唑配体1(共温育)与包含PI3K的蛋白质制剂的同时温育同样是优选的(竞争结合测定法)。

在与化合物的温育首先的情况下，在4℃至37℃、更优选4℃至25℃、最优选4℃下，PI3K优选首先与化合物温育10至60分钟、更优选30至45分钟。优选地化合物以1μM至1mM、优选地10至100μM的浓度使用。第二个步骤，与经固定的配体接触，优选在4℃下执行10至60分钟。

在同时温育的情况下，在4℃至37℃、更优选4℃至25℃、最优选4℃下，PI3K优选与化合物和苯基噻唑配体1一起同时温育30至120分钟、更优选60至120分钟。优选地，化合物以1μM至1mM、优选地10至100μM的浓度使用。

此外，本发明的第二个方面的步骤a)至c)可以用几种蛋白质制剂执行，以便测试不同化合物。这个实施方案在中等或高通量筛选中特别有利(参见下文)。

在根据第三个或第四个方面的本发明的方法的一个优选实施方案中，使步骤c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量与步骤b)中形成的量相比较。

在根据第三个或第四个方面的本发明的方法的一个优选实施方案中，与步骤b)中相比较，在步骤c)中形成减少量的苯基噻唑配体1-PI3K复合物指示PI3K是化合物的靶。这起因于下述事实：在本发明的这种方法的步骤c)中，化合物与配体竞争结合PI3K。如果在与化合物温育的等分试样中存在较少的PI3K，那么这优选意味着化合物已与抑制剂竞争与酶相互作用，并且因此是蛋白质的直接靶，并且反之亦然。

优选地，本发明的鉴定方法作为中等或高通量筛选执行。

根据本发明鉴定的相互作用化合物可以通过测定它对PI3K例如对其激酶活性是否具有作用进行进一步表征(Carpenter等人，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。此类测定法是本领域已知的，也以允许中等至高通量筛选的形式(Fuchikami等人，2002，J.Biomol.Screening 7，441-450)。

此外，根据本发明鉴定的相互作用化合物可以通过测定它对ATM、ATR、DNAPK或mTOR例如对其激酶活性是否具有作用进行进一步表征(Knight等人，2004.Bioorganic and Medicinal Chemistry 12，4749-4759；Knight等人，2006，Cell 125，733-747)。

简言之，PI3K脂质激酶活性可以使用利用磷脂囊泡的基于溶液的测定法进行测量。通过添加酸化的有机溶剂和通过萃取或薄层色谱法分析的后续相分离来终止反应(Carpenter等人，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。

备选地，可以使用荧光偏振测定法形式。简言之，使PI3K与合适的磷酸肌醇底物温育。在反应完成后，使反应产物与特定的磷酸肌醇检测蛋白质和荧光磷酸肌醇探针相混合。随着与磷酸肌醇检测蛋白质结合的探针由反应产物替换，偏振(mP)值减少。荧光探针的偏振程度与PI3K反应的产物量成反比(Drees等人，2003，Comb.Chem.High Throughput Screening 6，321-330)。

对于PI3K蛋白质激酶活性的测定，可以使用具有合适的肽底物的荧光偏振测定法。简言之，荧光素标记的肽底物可以与PI3K(例如PI3Kδ)、ATP和抗磷酸丝氨酸抗体温育。随着反应进展，磷酸化的肽与抗磷酸丝氨酸抗体结合，导致偏振信号的增加。抑制激酶的化合物导致低偏振信号。

根据本发明鉴定的化合物可以进一步进行最佳化(先导物最佳化)。由于在这些先导物产生文库中编码的结构-活性关系(SAR)信息，通常加速此类化合物的这种后续最佳化。由于高通量化学(HTC)方法用于后续合成的容易适用性，通常促进先导物最佳化。

此类文库和先导物最佳化的一个例子是对于PI3Kγ的描述(Pomel 等人，2006，J.Med.Chem.49，3857-3871)。

本发明的方法包括这样的方法步骤：其中测定化合物是否还能够使ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR与经固定的苯基噻唑配体1分离(本发明的第一个方面)，或是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR之间的复合物。如上所述，这些步骤可以基本上如上文对于PI3K所述来执行，其中需要时，使用试剂例如对于给定激酶特异的抗体。

在这些方法步骤后的原理是可以测定经鉴定的PI3K相互作用化合物的特异性。在本发明的背景中，优选鉴定对于PI3K特异的PI3K相互作用化合物，即其与ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR在较少程度上结合，或更加优选，不与这些蛋白质中的一种或全部结合。

本发明进一步涉及用于制备药物组合物的方法，其包括步骤

a)如上所述鉴定PI3K相互作用化合物，和

b)将相互作用化合物配制成药物组合物。

因此，本发明提供了用于制备药物组合物的方法，其可以以有效量施用于受试者。在一个优选方面，治疗剂是基本上纯化的。待治疗的受试者优选是动物，包括但不限于动物例如牛、猪、马、鸡、猫、犬等，并且优选是哺乳动物，并且最优选人。在一个特别实施方案中，非人哺乳动物是受试者。

根据本发明鉴定的化合物用于预防或治疗其中PI3K起作用的疾病，例如癌症(例如乳腺癌、结肠癌或卵巢癌)、代谢病症(例如糖尿病或肥胖)或自身免疫/炎性病症(例如类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、哮喘或过敏反应)。

因此，本发明还涉及通过本发明的方法鉴定的化合物在制备用于治疗上述疾病中的一种或多种的药物中的用途。此外，本发明涉及包括所述化合物的药物组合物。

一般而言，本发明的药物组合物包括治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的载体。在一个特别实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦管理机构或州政府批准或在美国药典或其他一般公认的药典中列出用于在动物且更特别地在人中使用。术语“载体”指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成起源的那些，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经口施用时，水是优选载体。当药物组合物静脉内施用时，盐水和含水右旋糖是优选载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液优选用作用于可注射溶液的液体载体。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。需要时，组合物还可以包含微量湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等的形式。组合物可以用常规粘合剂和载体例如甘油三酯配制为栓剂。经口制剂可以包括标准载体例如药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药学载体的例子由E.W.Martin在″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述。此类组合物将包含治疗有效量的优选以纯化形式的治疗剂，连同合适量的载体，以便提供用于适当施用于患者的形式。制剂应适合施用方式。

在一个优选实施方案中，依照常规操作，组合物配制为适合于静脉内施用于人类的药物组合物。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。需要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位处的疼痛。一般地，成分分开供应或以单位剂型混合在一起，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器例如安瓿或囊(原文为sachette，疑为sachet)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物待通过输注施用时，它可以用包含无菌药学级别的水或盐水的输液瓶调配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。

本发明的治疗剂可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括由游离羧基形成的那些，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，由游离胺基形成的那些，例如衍生自异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些，以及衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙和铁等的那些。

在治疗特定病症或病状中有效的本发明的治疗剂的量将依赖于病症或病状的性质，并且可以通过标准临床技术进行测定。此外，可以任选采用体外测定法，以帮助鉴定最佳剂量范围。在制剂中待采用的精确剂量还将依赖于施用途径、和疾病或病症的严重度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。然而，用于静脉内施用的合适剂量范围一般是约20-500微克活性化合物/千克体重。用于鼻内施用的合适剂量范围一般是约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可以从衍生自体外或动物模型测试***的剂量应答曲线进行推断。一般而言，栓剂可以包含0.5重量％至10重量％的活性成分；经口制剂优选包含10％至95％的活性成分。

各种递送***是已知的，并且可以用于施用本发明的治疗剂，例如在脂质体、微粒和微胶囊中封装：能够表达治疗剂的重组细胞的使用，受体介导的内吞作用的使用(例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)；治疗核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分的构建等。引入的方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜上和经口途径。化合物可以通过任何方便的途径进行施用，例如通过输注、通过弹丸注射、通过经过上皮或皮肤粘膜衬里(例如、口腔、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，可能希望通过任何合适的途径包括心室内和鞘内注射，将本发明的药物组合物引入中枢神经***内；通过例如与贮器(例如Ommaya贮器)附着的心室内导管可以促进心室内注射。还可以采用肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，和用雾化试剂配制。

在一个特别实施方案中，可能希望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的区域。这可以例如通过但不限于在手术过程中的局部输注、局部应用例如在手术后与创伤辅料结合、通过注射、借助于导管、借助于栓剂、或借助于埋植剂，所述埋植剂是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜例如sialastic膜或纤维。在一个实施方案中，施用可以是通过在恶性瘤或赘生或赘生前组织的部位(或先前部位)处的直接注射。

在另一个实施方案中，治疗剂可以在囊泡特别是脂质体中进行递送(Langer，1990，Science 249：1527-1533)。

在另外一个实施方案中，治疗剂可以经由控制释放***进行递送。在一个实施方案中，可以使用泵(Langer，同上)。在另外一个实施方案中，控制释放***可以放置在治疗靶即脑的附近，从而仅需要全身剂量的一部分。

在本发明的背景中，已发现苯基噻唑配体1是关于ATM、ATR、DNAPK和mTOR的配体。因此，本发明还涉及用于鉴定与ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR相互作用的化合物的方法。这些方法如上文在PI3K相互作用化合物鉴定的背景中所述来执行。此外，在本发明内设想用于鉴定ATM、ATR、DNAPK或mTOR相互作用化合物的这些方法可以包含或不包含下述步骤：测定给定化合物是否还能够与如本发明中限定的其他PIKK激酶相互作用。

本发明进一步涉及用于纯化ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的方法，其包括步骤

a)提供包含所述蛋白质中的一种或多种的蛋白质制剂，

b)在允许苯基噻唑配体1-蛋白质复合物形成的条件下，使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和

c)使蛋白质与经固定的苯基噻唑配体1分离。

如上所述，已令人惊讶地发现苯基噻唑配体1是识别这些蛋白质的配体。这使得用于这些蛋白质的有效纯化方法成为可能。

如上文对于本发明的鉴定方法限定的实施方案也应用于本发明的纯化方法。

优选地，所述纯化如上所述使用同种型特异性抗体来执行。

在一个优选实施方案中，本发明的纯化方法在步骤c)后进一步包括鉴定能够与ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR结合的蛋白质。当在基本生理条件下执行复合物的形成时，这是特别有利的，因为随后有可能保存酶的自然条件，所述自然条件包括结合配偶体的存在、酶亚单位或翻译后修饰，这随后可以借助于质谱法(MS)进行鉴定。

因此，在一个优选实施方案中，本发明的纯化方法在步骤c)后进一步包括测定给定蛋白质是否例如通过遍在蛋白修饰进行进一步翻译后修饰。

本发明进一步涉及苯基噻唑配体1用于鉴定ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR相互作用化合物和用于纯化PI3K的用途。如上限定的实施方案也应用于本发明的用途。

在本发明的一个优选实施方案，不仅苯基噻唑配体1，而且另外一种配体可以用于鉴定相互作用化合物，即如图16中所示的苯替吗啉-色原(phenylmorpholin-chromen)配体(8-(4-氨基甲基-苯基)-2-吗啉-4-基-色原(chromen)-4-酮)或其衍生物，例如这样的化合物，其包含等同核心但具有另一个接头，优选与并非环状结构的部分的氮偶联，用于与固体支持物连接。因此，在本发明的这些实施方案冲，固定2种配体。在这个背景中，在使用珠的情况下，包括固定在相同珠上的2种配体，或一种配体固定在一种珠上，并且另一种配体固定在另一种珠上。在这个背景中，一般地接头具有8、9或10个原子的主链。接头可以包含羧基、羟基或氨基活性基团。

本发明通过下述附图和实施例进行进一步举例说明，所述附图和实施例不视为关于由本申请的权利要求赋予的保护范围的限制。

附图简述

图1：苯基噻唑配体1的合成和结构。

苯基噻唑配体1如实施例1中所述进行合成。

图2：用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出(pulldown)实验和PI3K蛋白质的蛋白质印迹检测。

作为生物材料，使用由MOLT-4细胞制备的细胞裂解物。药物牵出实验如实施例2中所述进行，使用包含50mg蛋白质的裂解物样品。经捕获的蛋白质用包含DMSO的缓冲液(泳道1)、100μM游离苯基噻唑配体1或SDS样品缓冲液(泳道3)进行洗脱。经洗脱的样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并且转移至膜。印迹首先与针对PI3Kγ(图2A)和PI3Kδ(图2B)的特异性抗体温育。由用于检测的荧光染料标记的第二检测抗体与Odyssey红外成像***一起使用。

泳道1：DMSO洗脱对照；泳道2：用100μM游离苯基噻唑配体1洗脱；

泳道3：SDS洗脱。

图3：用于蛋白质的质谱分析的用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出实验。

显示了在用考马斯亮蓝染色后的蛋白质凝胶。所指示的凝胶区域作为凝胶切片切掉，并且对蛋白质实施通过质谱法的分析。

药物牵出实验如实施例2中所述进行，使用包含50mg蛋白质的MOLT-4细胞裂解物样品。用SDS样品缓冲液洗脱与经固定的苯基噻唑配体1结合的蛋白质，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。

图4：PI3Kγ鉴定的肽。

通过人PI3Kδ序列的质谱分析鉴定的肽以粗体且加下划线显示。

图5：PI3Kδ鉴定的肽。

通过人PI3Kγ序列的质谱分析鉴定的肽以粗体且加下划线显示。

图6：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的洗脱测定法。

实验如实施例3中所述进行。PI3Kγ蛋白质通过经固定的苯基噻唑配体1从MOLT-4细胞裂解物中捕获，并且如所示的通过化合物洗脱。将洗脱物转移至硝酸纤维素膜，并且用Odyssey红外成像***检测PI3Kγ。第一抗体：抗PI3Kγ(Jena Bioscience ABD-026S；小鼠抗体)。第二抗体：抗小鼠IRDye800(Rockland，610-732-124)。显示了累积强度(累积kilopixel/mm²)。

用于洗脱的化合物：

化合物1(LY294002)；IC₅₀＞100μM；化合物2(AS-605240)：IC₅₀＝26nM；化合物3(AS-604850)；IC₅₀＝1.7μM，

图7：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的竞争结合测定法。

实验如实施例4中所述进行。将以所示浓度的测试化合物和亲和基质加入MOLT-4细胞裂解物中，并且通过在亲和基质上经固定的苯基噻唑配体1捕获不与测试化合物相互作用的PI3Kγ蛋白质。使亲和基质与裂解物分离，并且用SDS样品缓冲液洗脱结合的蛋白质，并且将洗脱物转移至硝酸纤维素膜。用Odyssey红外成像***测定PI3Kγ的量。

7A：用抗体探测的斑点印迹，和用Odyssey红外成像***检测的信号。第一抗体：抗PI3Kγ(Jena Bioscience ABD-026S；小鼠抗体)。第二抗体：抗小鼠IRDye800(Rockland，610-732-124)。

7B：竞争结合曲线。针对化合物浓度标绘相对Odyssey单位(累积强度；累积kilopixel/mm²)，并且计算一半最大结合竞争(IC)值。化合物1(LY294002)：IC₅₀＞30μM；化合物2(AS-605240)：IC₅₀＝4.6μM；化合物3(AS-604850)：IC₅₀＝176nM。

图8：通过将化合物加入细胞裂解物中(裂解物测定法)或通过使化合物与活的RAW264.7细胞温育(细胞测定法)的化合物概况分析。

实验如实施例5中所述进行。化合物以10μM的浓度在2种测定法中使用，并且PI3Kδ的量用Odyssey红外成像***进行定量。

图9：使用质谱法定量的PI3K抑制剂的选择性概况分析。

实验在如实施例6中所述作为在Ramos细胞裂解物中的Kinobeads 竞争结合测定法执行。基于定量质谱法，显示了关于个别靶的IC₅₀值(μM)的概况分析。

A：化合物CZC00015097

B：化合物CZC00018052

C：化合物CZC00019091

图10：化合物CZC18052的剂量应答曲线。

化合物用激酶的多路免疫检测在竞争结合测定法中进行测试，如实施例7中所述。在单个测定法中，测量了化合物对于PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ、PI3Kδ和DNAPK的结合亲和力。简言之，使Molt-4和Jurkat 细胞裂解物的1∶1混合物与亲和基质(具有经固定的苯基噻唑配体1的珠和具有苯替吗啉-色原配体的珠1∶1混合物)和化合物CZC18052温育。洗涤珠，并且洗脱结合的激酶。将洗脱物的等分试样点在5个不同的硝酸纤维素膜上，其各自与分别的靶抗体温育且随后与荧光第二抗体温育。使用红外扫描仪定量荧光信号。化合物显示对于下述激酶范围的有效结合：

PI3Kα(IC₅₀＝0.027μM)、PI3Kβ(IC₅₀＝0.034μM)、PI3Kγ(IC₅₀＝0.43μM)、PI3Kδ(IC₅₀＝0.14μM)和DNAPK(IC₅₀＝0.038μM)。

图11：关于化合物CZC19950的剂量应答曲线。

实验如实施例7中所述进行。化合物显示与下述激酶的结合：PI3Kα(IC₅₀＞7μM)、PI3Kβ(IC₅₀＝1.7μM)、PI3Kγ(IC₅₀＝0.17μM)、PI3Kδ(IC₅₀＞3μM)和DNAPK(IC₅₀＞6μM)。化合物CZC19950显示仅与PI3Kγ的有效结合(IC₅₀＝0.17μM)。

图12：用于蛋白质的质谱分析的用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出实验。

显示了在用考马斯亮蓝染色后的蛋白质凝胶。所指示的凝胶区域作为凝胶切片切掉，并且对蛋白质实施通过质谱法的分析。药物牵出实验如实施例2中所述进行，使用包含50mg蛋白质的Jurkat和Ramos细胞裂解物样品的1∶1混合物。用SDS样品缓冲液洗脱与经固定的苯基噻唑配体1结合的蛋白质，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。在这个实验中鉴定了下述蛋白质：DNA-PK、ATM和mTOR。

图13：在用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出后，通过DNA-PK的质谱法鉴定的肽。经鉴定的肽是加下划线的。

图14：在用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出后，通过ATM的质谱法鉴定的肽。

图15：在用经固定的苯基噻唑配体1的药物牵出后，通过mTOR的质谱法鉴定的肽。

图16：苯替吗啉-色原配体(8-(4-氨基甲基-苯基)-2-吗啉-4-基-色原-4-酮)的合成和结构。配体如实施例8中所述进行合成。显示了配体的结构[G]。

图17：用于蛋白质的质谱分析的用经固定的苯替吗啉-色原配体的药物牵出实验。

显示了在用考马斯亮蓝染色后的蛋白质凝胶。所指示的凝胶区域作为凝胶切片切掉，并且对蛋白质实施通过质谱法的分析。药物牵出实验如实施例2中所述进行，使用包含50mg蛋白质的HeLa和K-562细胞裂解物样品的1∶1混合物。用SDS样品缓冲液洗脱与苯替吗啉-色原配体结合的蛋白质，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。

图18：在用经固定的苯替吗啉-色原配体从HeLa-K562裂解物混合物中的药物牵出后，通过人ATR的质谱法鉴定的肽。

图19：在用经固定的苯替吗啉-色原配体从HeLa-K562裂解物混合物中的药物牵出后，通过人ATM的质谱法鉴定的肽。

图20：在用经固定的苯替吗啉-色原配体从HeLa-K562裂解物混合物中的药物牵出后，通过人mTOR的质谱法鉴定的肽。

实施例1：亲和基质的制备

这个实施例举例说明了用于从细胞裂解物亲和捕获PI3K激酶的亲和基质的制备。捕获配体使用氨基官能团共价通过共价连接固定在固体支持物上。这种亲和基质在实施例2、实施例3和实施例4中使用。

苯基噻唑配体1(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐)的合成

步骤1-3：根据WO 2003/072557中描述的操作制备1-溴-1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙-2-酮

步骤4：5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺

使1-溴-1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙-2-酮(480mg 1.5mmol)和硫脲(114mg 1.5mmol)在乙醇(12ml)中相组合，并且加热至70℃2小时。允许反应混合物冷却至室温，并且通过过滤收集固体产物，并且在真空下干燥，以得到作为灰白色固体的5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(375mg)。¹H NMR(400MHz DMSO-d₆)δ9.4(br s，2H)，8.0(d，1H)，7.9(d，1H)，7.8(dd，1H)，3.4(s，3H)，2.3(s，3H)。

步骤5：(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯

使3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(690mg 1.9mmol)、EDAC(403mg 2.1mmol)、HOBT(284mg2.1mmol)、NMM(420uL 3.8mmol)和5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(520mg 1.7mmol)在二甲基甲酰胺(16ml)中相组合，并且在室温下搅拌过夜。在减压下去除溶剂，并且使残基溶解于二氯甲烷(150ml)中，用1M HCl水溶液(50ml)和饱和含水碳酸氢钠(50ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤并且蒸发。通过使用50g IST硅快速药筒用0-2％甲醇/二氯甲烷洗脱的快速色谱法纯化残渣，以得到作为油的(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(存在1.1g残留溶剂)¹H NMR(400MHz CDCl3)10.3(br s，1H)，8.2(s，1H)，7.6(m，2H)，7.2(br s，1H)，3.9(t，2H)3.8-3.5(br m，14H)，3.3(br m，5H)，2.8(t，2H)，2.4(s，3H)，1.4(s，9H)。

步骤6：3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐

使(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(1.0g 1.5mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，并且用HCl(4ml在二噁烷中的4M溶液)处理。使反应在室温下搅拌3小时。使溶剂蒸发，并且使残渣在真空下干燥，以得到作为黄色粘稠油的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐(存在830mg残留溶剂)¹H NMR(400MHz CDCl3)8.4(br s，3H)，8.2(s，1H)，7.7(br d，1H)，7.6(br d，1H)3.9(br m，4H)，3.8-3.6(br m，12H)，3.3(s，3H)，3.3(br m，2H)，3.1(br m，2H)，2.6(s，3H)。NMR谱在Bruker dpx400上获得。

表1：使用的缩写

br	宽
		CDCl3	氘代氯仿
d	双重峰
		dd	双重峰的双重峰
DMSO	二甲基亚砜
		EDAC	1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
g	克
		HCl	盐酸
HOBT	N-羟基苯并***
		m	多重峰
mg	毫克
		ml	毫升
mmol	毫摩尔
		M	摩尔
MHz	兆赫
		NMM	N-甲基吗啉
NMR	核磁共振
		q	四重峰

s	单重峰
		t	三重峰

苯基噻唑配体1固定在珠(亲和基质)上

NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，17-0906-01)用无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648，H20＜＝0.005％)进行平衡。将1ml沉降珠置于15ml Falcon管中，加入化合物母液(通常为在DMF或DMSO中100mM)(终浓度0.2-2μmol/ml珠)以及15μl三乙胺(Sigma，T-0886，99％纯)。珠在室温下在黑暗中在立式(end-over-end)振荡器(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上温育16-20小时。通过HPLC测定偶联效率。通过在室温下在立式振荡器上与氨基乙醇温育过夜来封闭非反应的NHS基团。珠用10ml DMSO进行洗涤，并且在异丙醇中贮藏于-20℃下。这些珠在实施例2、3和4中用作亲和基质。如上所述通过与氨基乙醇温育封闭NHS基团而产生对照珠(未固定配体)。

实施例2：使用经固定的苯基噻唑配体1的PI3K的药物牵出这个实施例证实了经固定的苯基噻唑配体1用于从人T细胞系(MOLT-4细胞；ATCC编号CRL-1582)的细胞裂解物中鉴定PI3K蛋白质的用途。为此，使MOLT-4细胞的裂解物与实施例1中描述的亲和基质接触。通过蛋白质印迹和质谱(MS)分析鉴定与苯基噻唑配体1结合的蛋白质。

对于蛋白质印迹分析，结合的蛋白质从亲和基质中进行洗脱，并且随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。用特异性抗体检测PI3Kγ和PI3Kδ(图2)。蛋白质印迹分析的结果显示经固定的苯基噻唑配体1从细胞裂解物中捕获(牵出)PI3Kγ和PI3Kδ。

对于通过质谱分析的蛋白质鉴定，将由亲和基质捕获的蛋白质进行洗脱，并且随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(图3)。切掉合适的染色条带，并且实施用胰蛋白酶的凝胶内蛋白水解消化，并且通过LC-MS/MS质谱法进行分析。

PI3K家族成员的鉴定在表3中得到证明。PI3Kγ的肽序列覆盖显示于图4中，并且对于PI3Kδ显示于图5中。

1.细胞培养

MOLT-4细胞(ATCC编号1582)在1升旋转瓶(Integra Biosciences，#182101)中在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，#21875-034)中以0.15x10⁶至1.2x10⁶细胞/ml的密度悬浮生长。细胞通过离心进行收获，用1xPBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)洗涤1次，并且使细胞团块在液氮中冷冻，并且随后贮藏于-80℃。

2.细胞裂解物的制备

使MOLT-4细胞在Potter S匀浆器中在裂解缓冲液中进行匀浆化处理：50mM Tris-HCl、0.8％NP40、5％甘油、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM正钒酸钠、1mM DTT，pH 7.5。加入一片完整的无EDTA片(蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)，Roche Diagnostics，1873 580)/25ml缓冲液。材料使用机械化的POTTER S dounced 10次，转移至50ml falcon管，在冰上温育30分钟，并且在20,000g下于4℃旋转10分钟(在Sorvall SLA600中10,000rpm，预冷却)。将上清液转移至超速离心机(UZ)聚碳酸酯管(Beckmann，355654)，并且在100.000g下于4℃旋转1小时(在Ti50.2中33.500rpm，预冷却)。将上清液转移至新鲜的50ml falcon管，通过Bradford测定法(BioRad)测定蛋白质浓度，并且制备包含50mg蛋白质/等分试样的样品。样品立即用于实验或在液氮中冷冻且冷冻贮藏于-80℃。

3.化合物牵出实验

具有经固定的化合物的Sepharose珠(100μl珠/牵出实验)在裂解缓冲液中平衡，并且与包含50mg蛋白质的细胞裂解物样品一起在立式振荡器(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上于4℃温育2小时。收集珠，转移至Mobicol-柱(MoBiTech 10055)，并且用包含0.5％NP40去污剂的10ml裂解缓冲液洗涤，随后用具有0.25％去污剂的5ml裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白质，加入60μl 2xSDS样品缓冲液，使柱在50℃下加热30分钟，并且通过离心将洗脱物转移至微量离心管。随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。

4.通过蛋白质印迹分析的蛋白质检测

根据标准操作执行蛋白质印迹，并且通过使用特异性抗PI3K抗体(第一抗体)、荧光标记的第二抗体和来自LI-COR Biosciences (Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***检测且定量PI3K蛋白质，并根据由制造商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences公开，www.licor.com)。

小鼠抗PI3Kγ抗体(Jena Bioscience，目录号ABD-026S)以1∶200的稀释度使用，并且与印迹一起于4℃温育过夜。抗小鼠IRDye^TM800第二抗体(Rockland，目录号610-732-124)以1∶15000的稀释度使用。兔抗PI3Kδ抗体(Santa Cruz，目录号sc-7176)1∶600稀释，并且于4℃温育过夜。作为第二检测抗体，抗兔IRDyeTM 800抗体1∶20000稀释(LICOR，目录号926-32211)。

5.通过质谱法的蛋白质鉴定

5.1在质谱分析前的蛋白质消化

基本上根据由Shevchenko等人，1996，Anal.Chem.68：850-858描述的操作，使凝胶分离的蛋白质在凝胶中还原，烷基化且消化。简言之，使用干净的解剖刀从凝胶中切下凝胶分离的蛋白质，使用10mM DTT进行还原(在5mM碳酸氢铵中，54℃，45分钟)，并且随后用55mM碘乙酰胺(在5mM碳酸氢铵中)在室温下在黑暗中进行烷基化(30分钟)。还原且烷基化的蛋白质在凝胶中用猪胰蛋白酶(Promega)以在5mM碳酸氢铵中12.5ng/μl的蛋白酶浓度进行消化。允许消化在37℃下进行4小时，并且随后使用5μl 5％甲酸终止反应。

5.2在通过质谱法分析前的样品制备

凝胶塞用20μl 1％TFA萃取2次，并且与酸化的消化上清液合并。使样品在真空离心机中干燥，并且重悬浮于10μl 0.1％甲酸中。

5.3.质谱法数据采集

将肽样品注入纳米LC***(CapLC，Waters或Ultimate，Dionex)内，所述纳米LC***与四级TOF(QTOF2，QTOF Ultima，QTOF Micro，Micromass)或离子陷阱(LCQ Deca XP)质谱仪直接偶联。肽在LC***上进行分离，使用水和有机溶剂的梯度(参见下文)。溶剂A是在0.5％甲酸中的5％乙腈，并且溶剂B是在0.5％甲酸中的70％乙腈。

表2：从LC***中洗脱的肽在质谱仪内进行部分测序。

时间(分钟)	溶剂A％	溶剂B％
			0	95	5
5.33	92	8
			35	50	50
36	20	80
			40	20	80
41	95	5
			50	95	5

5.4.蛋白质鉴定

在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和断裂数据用于查询在NCBI(关于NCBInr、dbEST以及人和小鼠基因组)和European Bioinformatics Institute(EBI，关于人、小鼠、黑腹果蝇(D.melanogaster)和线虫蛋白质组数据库)维持且定期更新的fasta格式化的蛋白质和核苷酸序列数据库。使用软件工具Mascot(Matrix Science；Perkins等人，1999.Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.Electrophoresis 20，3551-3567)，通过使所测量的肽质量和断裂数据与从数据库中的实体计算的相同数据相关联来鉴定蛋白质。搜索标准依赖于何种质谱仪用于分析而改变。

表3：通过质谱法鉴定的PI3K蛋白质(MOLT-4细胞；实验P15234B；MS样品指从聚丙烯酰胺凝胶中切掉的凝胶切片(图3)。

实施例3：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的洗脱测定法

如实施例1中所述完成苯基噻唑配体1亲和基质的制备。为了在96孔平板中最大限度地筛选80种化合物，如下所述执行洗脱实验。

洗脱测定法

亲和基质(1200μl珠)用30ml 1x DP缓冲液洗涤2x。在每个洗涤步骤后，通过在Heraeus离心机中在1200rpm下于4℃离心2分钟收集珠。弃去上清液。最后，使珠在15ml结合缓冲液(1x DP缓冲液/0.4％NP40)中平衡。在这个温育时间后，收获珠，并且在50ml falcon 管中与MOLT-4细胞裂解物相混合(以5mg/ml的蛋白质浓度)，其中总量为75mg蛋白质。裂解物的制备如实施例2中所述完成。使珠和裂解物在4℃下温育2小时。在与裂解物温育后，珠如所述的通过离心进行收集，并且转移至2ml柱(MoBiTec，#S10129)，并且用10ml 1x DP缓冲液/0.4％NP40和5ml 1x DP缓冲液/0.2％NP40洗涤。一旦洗涤缓冲液已运行完全通过柱后，计算柱中留下的珠的体积(约1000μl)。使珠重悬浮于4倍过量的1x DP缓冲液/0.2％NP40(4ml)中，以产生20％浆。对于化合物洗脱测试，将50μl这种悬浮液加入96孔平板(Millipore MultiScreenHTS，MSBVN1210，具有盖和1.2um亲水的低蛋白质结合Durapore膜)的每个孔中。为了去除残留缓冲液，使96孔平板与Assemble滤器和收集平板装配，并且使这种夹层装配在离心机中在800rpm下旋转10秒。随后将补充有测试化合物的40μl洗脱缓冲液(1x DP缓冲液/0.2％NP40)加入珠中。从在DMSO中的40倍浓缩母液开始通过使其在稀释缓冲液中稀释来制备测试化合物。使平板装配上收集平板上，固定在Eppendorf温箱上，并且于4℃在650rpm振荡下温育30分钟。为了收获洗脱物，使装配在96孔收集平板上的96孔过滤平板在800rpm下在台式离心机中于4℃(Heraeus)离心1分钟。通过使用斑点印迹操作，就PI3Kγ和PI3Kδ的存在检查洗脱物。

经洗脱的PI3Kγ的检测

通过斑点印迹操作，使用针对PI3Kγ的抗体(Jena Bioscience，#ABD-026S)、荧光标记的第二抗小鼠IRDye^TM 800(Rockland，#610-732-124)和来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***检测且定量经洗脱的PI3Kγ蛋白质，且根据由制造商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences公开，www.licor.com)。

硝酸纤维素膜用20％乙醇处理，并且随后用1x PBS缓冲液洗涤。使洗脱物(如上所述)与12μl 4x SDS上样缓冲液(200mM Tris-HClpH6.8，8％SDS、40％甘油、0.04％溴酚蓝)相组合，并且用斑点印迹装置(BioRad，#170-6545)应用于硝酸纤维素膜。

对于PI3Kγ的检测，膜首先通过与Odyssey封闭缓冲液温育1小时进行封闭。经封闭的膜与第一抗体(来自Jena Bioscience的小鼠抗PI3Kγ，ABD-026S)于4℃温育16小时，所述第一抗体在补充有0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中1∶100稀释。在膜用包含0.1％Tween 20的1x PBS缓冲液洗涤4次共5分钟后，使膜与检测抗体(来自Rockland 的抗小鼠IRDye^TM 800，610-732-124)温育40分钟，所述检测抗体在补充有0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中1∶10000稀释。然后，膜用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤4次共5分钟，并且用1x PBS缓冲液洗涤1次共5分钟。然后膜用Odyssey阅读器进行扫描，并且分析数据。

表4：5x-DP缓冲液的制备

使5x-DP缓冲液经过0.22μm滤器过滤，并且以40ml等分试样贮藏于-80℃。这些溶液得自下述供应商：1.0M Tris/HCl pH 7.5(Sigma，T-2663)、87％甘油(Merck，目录号04091.2500)；1.0M MgCl₂(Sigma，M-1028)；5.0M NaCl(Sigma，S-5150)。

用于洗脱的测试化合物

在如下所述稀释后，下文列出的测试化合物用于洗脱实验。一般地，所有化合物都在100％DMSO(Fluka，目录号41647)中以100mM或50mM的浓度溶解。化合物贮藏于-20℃下。测试化合物用于洗脱实验的稀释：通过用100％DMSO 1∶1稀释100mM原液制备50mM原液。对于洗脱实验，用洗脱缓冲液(1x DP缓冲液/0.2％NP40)进一步稀释化合物。

用于洗脱的化合物：

化合物1：PI3K抑制剂LY294002(Tocris 1130；Vlahos等人，1994，J.Biol.Chem.269，5241-5248)。

化合物2：PI3Kγ抑制剂(Calbiochem 528106；AS-605240；Camps 等人，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

化合物3：PI3Kγ抑制剂II(Calbiochem 528108；AS-604850；Camps等人，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

实施例4：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的竞争结合测定法

这个实施例证实了其中测试化合物直接加入细胞裂解物内的竞争结合测定法。将测试化合物(以各种浓度)和具有苯基噻唑配体1的亲和基质加入裂解物等分试样中，并且允许与裂解物样品中包含的蛋白质结合。在温育时间后，使具有经捕获的蛋白质的珠与裂解物分离。随后洗脱结合的蛋白质，并且在斑点印迹操作中使用特异性抗体和Odyssey 红外检测***检测且定量PI3Kγ的存在(图7A)。产生关于3种化合物的剂量应答曲线(图7B)。

亲和基质的洗涤

如实施例1中所述的亲和基质(1.1ml干体积)用15ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液洗涤2次，并且重悬浮于5.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中(20％珠浆)。

测试化合物的制备

在DMSO中制备相应于与最终所需测试浓度相比较浓度高100倍的测试化合物的母液(例如，对于4μM的最终测试浓度制备4mM母液)。这种稀释方案导致1％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含1％DMSO的缓冲液，从而使得所有测试样品都包含1％DMSO。

化合物1：PI3K抑制剂LY294002(Tocris 1130；Vlahos等人，1994，J.Biol.Chem.269，5241-5248)。

化合物3：PI3Kγ抑制剂II(Calbiochem 528108；AS-604850；Camps等人，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

化合物4(CZC00015387)。

细胞裂解物的稀释

细胞裂解物如实施例2中所述进行制备。对于一般实验，使包含50mg蛋白质的1个裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，并且随后维持在4℃下。向裂解物中加入1体积的1xDP缓冲液，从而使得达到0.4％的最终NP40浓度。随后，加入50倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液的1/50最终体积(1片蛋白酶抑制剂溶解于0.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中；来自Roche Diagnostics的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片，目录号41647)。通过加入包含0.4％NP40的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物，从而使得达到5mg/ml的最终蛋白质浓度。

裂解物与测试化合物和亲和基质温育

将100μl体积的稀释裂解物分配到96孔过滤平板的每个孔内。随后加入在DMSO中稀释的1.5μl测试化合物。对于对照反应，使用1.5μl不含测试化合物的DMSO。随后加入50μl亲和基质(20％浆)/孔。使平板于4℃在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育2小时。

使用多头抽真空装置(Millipore，MAVM 096 0R)洗涤平板。每个孔用400μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤4次，并且用400μ1包含0.2％NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。

对于洗脱，将过滤平板置于收集平板上，并且将40μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM TrisHCl，pH6.8；4％SDS；20％甘油；0.02％溴酚蓝)加入每个孔中。使平板在室温下在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育30分钟。随后，使平板在1100rpm下离心2分钟(Heraeus离心机)，并且将洗脱物收集到收集平板的孔内。

经洗脱的PI3Kγ的检测和定量

通过斑点印迹操作，使用针对PI3Kγ的第一抗体(来自Jena Bioscience的抗PI3Kγ，ABD-026S)和荧光标记的第二抗体(抗小鼠IRDye^TM 800，来自Rockland，610-732-124)检测且定量洗脱物中的PI3Kγ蛋白质。根据由制造商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences公开，www.licor.com)，操作来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***。

根据供应商的说明书(Bio-Dot微量过滤装置，BioRad 170-65)使用斑点印迹装置。硝酸纤维素膜(BioTrace NT Nitrocellulose，PALLBTNT30R)用20％乙醇处理，并且随后用PBS缓冲液洗涤。应用30μl洗脱样品/斑点，并且在应用真空泵前静置30分钟。

对于PI3Kγ的检测，膜首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)在室温下温育1小时进行封闭。经封闭的膜随后与第一抗体(来自Jena Bioscience的小鼠抗PI3Kγ，ABD-026S)于4℃温育16小时，所述第一抗体在含有0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中稀释。在膜用包含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤4次共5分钟后，使膜与检测抗体(来自Rockland的抗小鼠IRDye^TM800，610-732-124)温育40分钟，所述检测抗体在包含0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中稀释。然后，膜用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤4次，每次5分钟，并且用1x PBS缓冲液洗涤1次共5分钟。使膜维持在PBS缓冲液中于4℃下，并且随后用Odyssey装置进行扫描，并且根据制造商的说明书记录且分析信号。

实施例5：PI3Kδ相互作用化合物通过将化合物加入细胞裂解物或活细胞中的化合物概况分析

这个实施例证实了其中测试化合物直接加入细胞裂解物内或与活细胞(RAW264.7巨噬细胞)温育的结合测定法。

对于细胞裂解物竞争结合测定法，将化合物加入裂解物样品中，并且允许与裂解物样品中包含的蛋白质结合。随后，加入包含经固定的苯基噻唑配体的亲和基质，以便捕获未与测试化合物结合的蛋白质。在温育时间后，通过离心使具有经捕获的蛋白质的珠与裂解物分离。随后洗脱珠结合的蛋白质，并且使用特异性抗体和Odyssey红外检测***检测且定量PI3Kδ蛋白质的存在。

对于细胞概况分析实验，使活RAW264.7巨噬细胞的等分试样首先与化合物一起在细胞培养基中温育30分钟。在这个温育时间过程中，化合物可以进入细胞并且与细胞内的蛋白质靶结合。随后收获细胞，制备细胞裂解物，并且加入亲和基质，以便捕获未与测试化合物结合的蛋白质。在细胞裂解物与亲和基质温育90分钟后，通过离心使具有经捕获的蛋白质的珠与裂解物分离。随后洗脱结合的蛋白质，并且使用特异性抗体和Odyssey红外检测***检测且定量PI3Kδ的存在。

对于可渗透细胞的参考化合物PI-103，2种方法都得到相似结果(图8)。2种其他化合物(化合物5和6)在裂解物测定法中与PI3Kδ相互作用，但在细胞测定法中不显著。关于这种差异的可能原因是后面2种化合物不足以渗透细胞。

细胞培养

RAW264.7巨噬细胞(美国典型培养物中心，Rockville，MD)在达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM，4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖；Gibco #41965)中于37℃在加湿大气中在5％CO₂的存在下进行培养，所述DMEM补充有10％热灭活的胎牛血清(Gibco #10270)和1.5g/L碳酸氢钠(Gibco #25080，7.5％溶液)。通过使用细胞刮棒从培养皿中刮取在DMEM培养基中的细胞，并且使它们在新鲜培养基中重新铺平板，使巨噬细胞进行传代培养。在达到传代数3后，RAW264.7巨噬细胞用于实验。细胞用磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，Gibco #14040)洗涤1次，从培养皿中在DMEM培养基中取出，并且在1,000rpm下在室温下离心3次。使细胞团块重悬浮于DMEM培养基中，并且测定细胞数目。将25x10⁶细胞铺平板到1个10cm培养皿上，并且在新鲜DMEM培养基中温育48小时，直至它们达到约90％汇合。

A)活细胞中的化合物概况分析

用测试化合物处理细胞

巨噬细胞用D-PBS缓冲液进行洗涤，并且加入新鲜DMEM培养基。细胞用包含0.2％DMSO的DMEM培养基(媒介物对照)或具有10μMPI-103(Calbiochem，目录号528100；Knight等人，2006，Cell 125，733-747)、10μM化合物5或10μM化合物6的DMEM培养基处理经过30分钟的时间段。测试化合物在DMSO中制备为20mM母液，并且进一步稀释以达到在细胞培养基中10μM化合物和0.2％DMSO的终浓度。

细胞裂解物的制备

去除培养基，细胞用D-PBS缓冲液洗涤1次，并且加入4ml冰冷的D-PBS缓冲液。通过轻轻刮取细胞并且将其重悬浮于D-PBS缓冲液中，取出巨噬细胞。将细胞悬浮液转移到15ml Falcon管内，并且维持在冰上。使巨噬细胞悬浮液在1500rpm 4℃下在Heraeus Multifuge中离心3分钟。去除上清液，并且用冷D-PBS缓冲液洗涤细胞团块。在另外的离心步骤后，使细胞团块在液氮中速冻。使细胞在冰上解冻，并且通过加入120μl 1x裂解缓冲液(1x DP缓冲液、0.8％NP40)进行裂解。将裂解物转移到1.5ml Eppendorf管内，并且在4℃下旋转温育30分钟，并且随后在13,200rpm下于4℃离心10分钟。将上清液转移到超速离心管内，并且在TLA-120.2转子中在53,000rpm(100,000xg)下于4℃离心1小时。经澄清的上清液的等分试样用于执行Bradford 测定法(Biorad Protein Assay染料浓缩物，目录号500-0006)的蛋白质定量。其余样品在液氮中速冻，并且贮藏于-80℃下，直至在结合测定法中使用。

细胞裂解物的稀释

细胞裂解物如下所述由RAW264.7巨噬细胞进行制备。使1个裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，并且随后维持在4℃下。向裂解物中加入1体积的包含蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液(1片蛋白酶抑制剂溶解于25ml 1x DP缓冲液或25ml包含0.8％NP40的1x DP缓冲液中；来自Roche Diagnostics的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片，目录号41647)，从而使得达到0.8％的最终NP40浓度。通过加入包含0.8％NP40和蛋白酶抑制剂的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物，从而使得达到10mg/ml的最终蛋白质浓度。

亲和基质的洗涤

如实施例1中所述的亲和基质(0.25ml干珠体积)用10ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液洗涤2次，并且最终重悬浮于5.0ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液中(5％珠浆)。

细胞裂解物与亲和基质温育

将50μl体积的稀释裂解物(10mg/ml蛋白质)分配到96孔过滤平板的每个孔内。随后加入100μl亲和基质(5％浆)/孔。使平板于4℃在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育2小时。使用多头抽真空装置(Millipore，MAVM 096 0R)洗涤平板。每个孔用220μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。对于蛋白质的洗脱，将过滤平板置于收集平板上，并且将20μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM TrisHCl，pH7.4；4％SDS；20％甘油；0.0002％溴酚蓝)加入每个孔中。使平板在室温下在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育30分钟。随后使平板在1100rpm下离心4次(Heraeus离心机)，并且将洗脱物收集到收集平板的孔中。

PI3Kδ的检测和定量

通过将等分试样点在硝酸纤维素膜上并且用针对PI3Kδ的第一抗体和荧光标记的第二抗体检测，检测且定量洗脱物中的PI3Kδ蛋白质。硝酸纤维素膜(BioTrace NT Nitrocellulose，PALL BTNT30R)用20％乙醇进行预处理，并且随后用PBS缓冲液进行洗涤。

对于PI3Kδ的检测，膜首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)在室温下温育1小时进行封闭。经封闭的膜随后与第一抗体(抗PI3Kδ，来自Santa Cruz的兔多克隆抗体，目录号sc-7176)于4℃温育16小时，所述第一抗体在包含0.2％Tween 20的Odyssey 封闭缓冲液中1∶800稀释。在膜用包含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤4次共7分钟后，使膜与检测抗体(来自LICOR的山羊抗兔IRDye^TM800CW，目录号926-32211)温育60分钟，所述检测抗体在包含0.2％Tween 20和0.02％SDS的Odyssey封闭缓冲液中1∶2500稀释。然后，膜用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤4次5分钟，并且用1x PBS缓冲液洗涤1次共5分钟。使膜维持在PBS缓冲液中于4℃下，并且随后用Odyssey装置进行扫描，并且根据制造商的说明书记录且分析信号。根据由制造商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences公开，www.licor.com)，操作来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***。

B)在细胞裂解物中的化合物概况分析

细胞裂解物的制备

去除培养基，细胞用D-PBS缓冲液洗涤1次，并且加入4ml冰冷的D-PBS缓冲液。通过轻轻刮取细胞并且将其重悬浮于D-PBS缓冲液中，取出巨噬细胞。将细胞悬浮液转移到15ml Falcon管内，并且维持在冰上。使巨噬细胞悬浮液在1500rpm 4℃下在Heraeus Multifuge中离心3分钟。去除上清液，并且用冷D-PBS缓冲液洗涤细胞团块。在另外的离心步骤后，使细胞团块在液氮中速冻。使细胞在冰上解冻，并且通过加入120μl 1x裂解缓冲液(1x DP缓冲液、0.8％NP40)进行裂解。将裂解物转移到1.5ml Eppendorf管内，并且在4℃下旋转温育30分钟，并且随后在13,200rpm下于4℃离心10分钟。将上清液转移到超速离心管内，并且在TLA-120.2转子中在53,000rpm(100,000xg)下于4℃离心1小时。经澄清的上清液的等分试样用于执行Bradford 测定法(Biorad Protein Assay染料浓缩物，目录号500-0006)的蛋白质定量。其余样品在液氮中速冻，并且贮藏于-80℃下，直至在结合测定法中使用。

细胞裂解物的稀释

细胞裂解物如下所述由RAW264.7巨噬细胞进行制备。使1个裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，并且随后维持在4℃下。向裂解物中加入1体积的包含蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液(1片蛋白酶抑制剂溶解于25ml 1x DP缓冲液或25ml包含0.8％NP40的1x DP缓冲液中；来自Roche Diagnostics的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片，目录号41647)，从而使得达到0.8％的最终NP40浓度。通过加入包含0.8％NP40和蛋白酶抑制剂的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物，从而使得达到10mg/ml的最终蛋白质浓度。

亲和基质的洗涤

如实施例1中所述的亲和基质(0.25ml干珠体积)用10ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液洗涤2次，并且最终重悬浮于5.0ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液中(5％珠浆)。

测试化合物的制备

对于裂解物竞争实验，在DMSO中制备相应于与测定法中的终浓度相比较浓度高50倍的测试化合物的母液(例如，对于10μM的最终测试浓度制备500μM母液)。这种稀释方案导致测定法中2％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含2％DMSO的缓冲液，从而使得所有测试样品都包含2％DMSO。

细胞裂解物与测试化合物和亲和基质温育

将50μl体积的稀释裂解物(10mg/ml蛋白质)分配到96孔过滤平板的每个孔内。随后加入在DMSO中稀释的3.0μl测试化合物。对于对照反应，使用3.0μl不含测试化合物的DMSO。随后加入100μl亲和基质(5％浆)/孔。使平板于4℃在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育2小时。使用多头抽真空装置(Millipore，MAVM 096 0R)洗涤平板。每个孔用220μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。对于蛋白质的洗脱，将过滤平板置于收集平板上，并且将20μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM TrisHCl，pH7.4；4％SDS；20％甘油；0.0002％溴酚蓝)加入每个孔中。使平板在室温下在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育30分钟。随后，使平板在1100rpm下离心4分钟(Heraeus离心机)，并且将洗脱物收集到收集平板的孔内。PI3Kδ的检测和定量如上所述执行。

实施例6：PI3K相互作用化合物使用定量质谱法的选择性概况分析

这个实施例证实了其中测试化合物直接加入细胞裂解物内的竞争结合测定法。将测试化合物(以各种浓度)和亲和基质(珠与经固定的苯基噻唑配体1和珠与经固定的苯替吗啉-色原配体的1∶1混合物)加入裂解物等分试样中，并且允许与裂解物样品中包含的蛋白质结合。在温育时间后，使具有经捕获的蛋白质的珠与裂解物分离。随后洗脱结合的蛋白质，并且使用基于ITRAQ方法的定量质谱法测量激酶的存在。测定关于3种化合物与几种激酶相互作用的IC₅₀值(图9)。

亲和基质的洗涤

亲和基质(珠与经固定的苯基噻唑配体1和珠与经固定的苯替吗啉-色原配体的1∶1混合物)用15ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液洗涤2次，并且重悬浮于5.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中(20％珠浆)。

测试化合物的制备

在DMSO中制备相应于与最终所需测试浓度相比较浓度高100倍的测试化合物的母液(例如，对于4μM的最终测试浓度制备4mM母液)。这种稀释方案导致1％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含1％DMSO的缓冲液，从而使得所有测试样品都包含1％DMSO。

化合物CZC00018052：双重PI3K/mTOR激酶抑制剂PI-103(Calbiochem目录号528100；Knight等人，2006，Cell 125，733-747)。

化合物CZC00015097：PI3Kγ抑制剂I(Calbiochem 528106；AS-605240；Camps等人，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

细胞裂解物的稀释

细胞裂解物如实施例2中所述由Ramos细胞(ATCC编号CRL-1596)进行制备。对于一般实验，使包含50mg蛋白质的1个裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，并且随后维持在4℃下。向裂解物中加入1体积的1xDP缓冲液，从而使得达到0.4％的最终NP40浓度。随后，加入50倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液的1/50最终体积(1片蛋白酶抑制剂溶解于0.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中；来自Roche Diagnostics 的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片，目录号41647)。通过加入包含0.4％NP40的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物，从而使得达到5mg/ml的最终蛋白质浓度。

裂解物与测试化合物和亲和基质温育

将100μl体积的稀释裂解物分配到96孔过滤平板的每个孔内。随后加入在DMSO中稀释的1.5μl测试化合物。对于对照反应，使用1.5μl不含测试化合物的DMSO。随后加入50μl亲和基质(20％浆)/孔。使平板于4℃在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育2小时。

使用多头抽真空装置(Millipore，MAVM 096 0R)洗涤平板。每个孔用400μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤4次，并且用400μl包含0.2％NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。

对于洗脱，将过滤平板置于收集平板上，并且将40μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM TrisHCl，pH6.8；4％SDS；20％甘油；0.02％溴酚蓝)加入每个孔中。使平板在室温下在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf 上 750rpm)温育30分钟。随后，使平板在1100rpm下离心2分钟(Heraeus离心机)，并且将洗脱物收集到收集平板的孔内。

通过质谱法检测和定量激酶

如实施例2中所述通过质谱法检测洗脱物中的激酶，并且如先前所述执行使用ITRAQ方法的定量分析(WO 2006/134056；Bantscheff等人，2007.Nature Biotechnology 25，1035-1044)，并且计算关于个体化合物和激酶的相互作用的IC₅₀值(图9)。

实施例7：PI3K相互作用化合物使用多路免疫检测的选择性概况分析

这个实施例证实了其中测试化合物直接加入细胞裂解物内的竞争结合测定法。将测试化合物(以各种浓度)和亲和基质(珠与经固定的苯基噻唑配体1和珠与经固定的苯替吗啉-色原配体的1∶1混合物)加入裂解物等分试样中，并且允许与裂解物样品中包含的蛋白质结合。在温育时间后，使具有经捕获的蛋白质的珠与裂解物分离。随后洗脱结合的蛋白质，并且使用多路免疫检测形式检测且定量激酶的存在。产生关于个体激酶的剂量应答曲线，并且计算IC₅₀值(图10和11)。

亲和基质的洗涤

亲和基质(珠与经固定的苯基噻唑配体1和珠与经固定的苯替吗啉-色原配体的1∶1混合物)用15ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液洗涤2次，并且重悬浮于5.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中(20％珠浆)。

测试化合物的制备

在DMSO中制备相应于与最终所需测试浓度相比较浓度高100倍的测试化合物的母液(例如，对于4μM的最终测试浓度制备4mM母液)。这种稀释方案导致1％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含1％DMSO的缓冲液，从而使得所有测试样品都包含1％DMSO。化合物CZC00018052：双重PI3K/mTOR激酶抑制剂PI-103(Calbiochem目录号528100；Knight等人，2006，Cell 125，733-747)。

细胞裂解物的稀释

细胞裂解物如实施例2中所述进行制备。对于这个实验，使用包含Jurkat(ATCC目录号TIB-152 Jurkat，cloe E6-1)和Molt-4(ATCC目录号CRL-1582)细胞裂解物样品的1∶1混合物。对于一般实验，使包含50mg蛋白质的1个裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，并且随后维持在4℃下。向裂解物中加入1体积的1xDP缓冲液，从而使得达到0.4％的最终NP40浓度。随后，加入50倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液的1/50最终体积(1片蛋白酶抑制剂溶解于0.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液中；来自Roche Diagnostics的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片，目录号41647)。通过加入包含0.4％NP40的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物，从而使得达到5mg/ml的最终蛋白质浓度。

裂解物与测试化合物和亲和基质温育

向96孔过滤平板(Multiscreen Solvinert Filter Plate，Millipore MSRL N04 10)中加入：100μl亲和基质(珠)/孔、3μl化合物溶液和50μl细胞裂解物。使平板密封且在冷室中在Thermoxer 上伴随振荡(750rpm)温育2小时。然后，平板用220μl洗涤缓冲液洗涤2次。珠随后用20μl样品缓冲液进行洗脱。洗脱物在-80℃下速冻并且贮藏于-20℃下。

经洗脱的激酶的检测和定量

通过在硝酸纤维素膜上的点样操作，使用针对目的激酶的第一抗体和荧光标记的第二抗体(来自Rockland的抗小鼠或抗兔IRDye^TM抗体)，检测且定量洗脱物中的激酶。根据由制造商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-colorWestern blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences公开，www.licor.com)，操作来自LI-CORBiosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***。

在洗脱物点样后，硝酸纤维素膜(BioTrace NT，Millipore #66485)首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)在室温下温育1小时进行封闭。经封闭的膜随后与第一抗体于25℃温育16小时，所述第一抗体在包含0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中稀释。然后，膜用包含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤4次共7分钟。随后使膜与检测抗体(来自Rockland的IRDye^TM标记的抗体)在室温下温育60分钟，所述检测抗体在包含0.2％Tween 20和0.02％SDS的Odyssey封闭缓冲液中稀释。然后，膜用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤4次，7分钟，并用1x PBS缓冲液洗涤一次，5分钟。使膜维持在PBS缓冲液中于4℃下，并且随后用Odyssey装置进行扫描。根据制造商的说明书记录且分析荧光信号。

抗体的来源：

抗PI3Kγ小鼠(Jena Bioscience ABD-026)；抗PI3Kδ(Santa Cruz #sc-7176)；抗PI3Kα(Cell signaling #4255)；抗DNAPK(Calbiochem #NA57)；Licor IRDye 800小鼠(926-32210)；Licor IRDye 680兔(926-32221)；Licor IRDye 800兔(926-32211)；Licor IRDye 680小鼠(926-32220)。

实施例8：具有苯替吗啉-色原配体的亲和基质的制备

这个实施例描述了苯替吗啉-色原配体(8-(4-氨基甲基-苯基)-2-吗啉-4-基-色原-4-酮)的合成(图16)。这种捕获配体通过共价连接使用氨基官能团固定在固体支持物上，并且用于从细胞裂解物中捕获蛋白质(参见例如图17)。

8-(4-氨基甲基-苯基)-2-吗啉-4-基-色原-4-酮的合成

步骤1

使2，3-二羟基-苯甲酸[A](25g，0.16mol)(Sigma-Aldrich，目录号126209)在具有浓缩硫酸(1ml)的甲醇(125ml)中搅拌，并且使反应加热至轻柔回流过夜。随后使其浓缩，并且残基在乙酸乙酯和饱和含水碳酸氢钠之间分开。有机层用进一步饱和的含水碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，过滤且浓缩以提供2，3-二羟基-苯甲酸甲酯[B]。得率15.2g，57％。

HPLC(方法B)：(M-H⁺)167；RT＝2.3分钟。¹H NMR：(CDCl₃)δ10.92(s，1H)；7.39(dd，1H)；7.13(dd，1H)；6.82(dt，1H)；5.70(s，1H)；3.98(s，3H)。

步骤2

使2，3-二羟基-苯甲酸甲酯[B](15.g，89mmol)溶解于具有吡啶(3.6ml，44.6mmol，0.5当量)和DMAP(272mg，2.2mmol，0.025当量)的二氯甲烷(100ml)中，并且使反应在冰/水浴中冷却。加入三氟甲磺酸酐(16.2ml，98.2mmol，1.1当量)，并且允许反应加温至室温并且搅拌过夜。用二氯甲烷稀释反应混合物，用1M盐酸(150ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤且蒸发。产物由乙酸乙酯重结晶，以提供2-羟基-3-三氟甲磺酰氧-苯甲酸甲酯[C]。得率收获1，6.5g，24％。进一步的重结晶提供第二个收获，6.8g，26％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ11.11(s，1H)；7.80(dd，1H)；7.36(dd，1H)；6.86(t，1H)；3.93(s，3H)。

步骤3

使在氮下在30ml干四氢呋喃中的N-乙酰吗啉(1.72g，13.3mmol，2当量)溶液在丙酮/干冰浴(-78℃)中冷却，并且用LDA(10ml，在THF中的2M溶液，3当量)处理。使反应混合物搅拌60分钟，随后加入2-羟基-3-三氟甲磺酰氧-苯甲酸甲酯[C](2g，6.6mmol，1当量作为在10ml干THF中的溶液)。允许反应混合物从-78℃加温至室温并且搅拌过夜。反应用水(4ml)随后为2M盐酸(40ml)稀释，随后用二氯甲烷萃取3次。使萃取物合并，用卤水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤且蒸发。粗产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯洗脱进行纯化，以提供三氟甲磺酸2-羟基-3-(3-吗啉-4-基-3-氧-丙酰)-苯酯[D]。得率1.06g，40％

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.96(dd，1H)；7.49(dd，1H)；7.00(t，1H)；4.14(s，2H)；3.65-3.73(m，6H)，3.56(t，2H)。

步骤4

在二氯甲烷(30ml)中的三氟甲磺酸2-羟基-3-(3-吗啉-4-基-3-氧-丙酰)-苯酯[D](1.06g，2.7mmol)用三氟甲磺酸酐处理，并且在室温下搅拌过夜。随后使反应混合物浓缩，重新溶解于甲醇中并且搅拌另外2小时。溶液用水稀释且碱化至pH8。它随后用二氯甲烷萃取3次，使萃取物合并，用卤水洗涤，用硫酸镁干燥且蒸发，以得到作为褐色油的粗产物。用醚研磨得到三氟甲磺酸2-吗啉-4-基-4-氧-4H-色原-8-基酯[E]的褐色固体。得率210mg，20％。

HPLC(方法B)：RT＝2.8分钟。¹H NMR(CDCl₃)：δ8.16(dd，1H)；7.49(dd，1H)；7.40(t，1H)；5.62(s，1H)；3.85(dd，4H)，3.60(dd，4H)。

步骤5

使三氟甲磺酸2-吗啉-4-基-4-氧-4H-色原-8-基酯[E](380mg，1.0mmol)、4-(N-Boc-氨基甲基)苯硼酸(280mg，1.1mmol，1.1当量)、碳酸钾(275mg，2.0mmol，2当量)和四三苯基膦钯(0)(60mg，0.05mmol0.05当量)在二噁烷(4ml)中搅拌，并且加热至80℃4小时。随后使冷却反应物过滤，并且使滤液在真空中浓缩。残渣通过快速色谱法使用在二氯甲烷中的0-3％甲醇洗脱进行纯化，以提供[4-(2-吗啉-4-基-4-氧-4H-色原-8-基)-苯甲基]-氨基甲酸叔丁酯[F]。得率238mg，54％。

HPLC(方法A)：(MH⁺)437，(MNa⁺)459；RT 3.0分钟。¹H NMR(CDCl₃)δ8.17(dd，1H)；7.55(dd，1H)；7.49(d，2H)；7.37-7.42(m，3H)；5.51(s，1H)，5.00(brs，1H)，4.39(d，2H)；3.74(dd，4H)；3.35(dd，4H)；1.48(s，9H)。

步骤6

使在二氯甲烷(5ml)中的[4-(2-吗啉-4-基-4-氧-4H-色原-8-基)-苯甲基]-氨基甲酸叔丁酯[F](230mg，0.53mmol)用在二噁烷(2ml)中的4M氯化氢处理。使反应在室温下搅拌3小时，在这个时间期间形成沉淀物。溶剂在真空中去除，并且残渣用醚研磨。所得到的固体通过过滤收集并且干燥，以得到8-(4-氨基甲基-苯基)-2-吗啉-4-基-色原-4-酮[G]。得率189mg，定量。

HPLC(方法18)：(MH⁺)337，(MNa⁺)359；RT 1.32分钟(宽)。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.54(br s，2H)；7.99(dd，1H)；7.68-7.73(m，3H)；7.62(d，2H)；7.51(t，1H)；5.79(s，1H)；4.09(q，2H)；3.68(t，4H)；3.41(t，4H)

表5：缩写

DCM	二氯甲烷
		DMAP	4-(二甲基氨基)吡啶
LDA	二异丙胺锂
		MeOH	甲醇
THF	四氢呋喃

NMR谱在Bruker dpx400上获得。LCMS在Agilent 1100上使用ZORBAX

SB-C18，4.6x75mm，3.5微米柱执行。柱流动为1ml/分钟，并且所使用的溶剂是水和乙腈(0.1％甲酸)，注入体积为10ul。波长为254和210nm。方法在下文描述述。

表6：分析方法

苯替吗啉-色原配体固定在珠(亲和基质)上

NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，17-0906-01)用无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648，H20＜＝0.005％)进行平衡。将1ml沉降珠置于15ml Falcon管中，加入化合物母液(通常为在DMF或DMSO中100mM)(终浓度0.2-2μmol/ml珠)以及15μl三乙胺(Sigma，T-0886，99％纯)。珠在室温下在黑暗中在立式振荡器(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上温育16-20小时。通过HPLC测定偶联效率。通过在室温下在立式振荡器上与氨基乙醇温育过夜来封闭非反应的NHS基团。珠用10ml DMSO进行洗涤，并且在异丙醇中贮藏于-20℃下。这些珠在实施例2、3和4中用作亲和基质。如上所述通过与氨基乙醇温育封闭NHS基团而产生对照珠(未固定配体)。

Claims (21)

1.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)使所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物与给定化合物温育，

d)测定所述化合物是否能够使PI3K与所述经固定的苯基噻唑配体1分离，和

e)测定所述化合物是否还能够使ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR与所述经固定的苯基噻唑配体1分离。

2.权利要求1的方法，其中步骤d)包括检测经分离的PI3K或测定经分离的PI3K的量，和/或步骤e)包括检测经分离的ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR或测定经分离的ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的量。

3.权利要求2的方法，其中通过质谱法或免疫检测方法检测经分离的PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR，或测定经分离的PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的量，优选用针对PI3K、ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR的抗体。

4.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)检测在步骤b)中形成的所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物，和

d)检测在步骤b)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

5.权利要求4的方法，其中在步骤c)中所述检测通过测定苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量来进行，和/或其中在步骤d)中测定苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物的量。

6.权利要求4或5中任一项的方法，其中步骤a)至c)用几种蛋白质制剂执行，以便测试不同化合物。

7.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂的2个等分试样，

b)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使一个等分试样与固定在固体支持物上的所述苯基噻唑配体1接触，

c)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使另一个等分试样与固定在固体支持物上的所述苯基噻唑配体1以及与给定化合物接触，

d)测定在步骤b)和c)中形成的所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量，和

e)测定在步骤b)和c)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

8.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括步骤：

a)提供各自包括包含PI3K的至少一个细胞的2个等分试样，

b)使一个等分试样与给定化合物温育，

c)收获每个等分试样的细胞，

d)使所述细胞裂解，以便获得蛋白质制剂，

e)在允许苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的所述苯基噻唑配体1接触，和

f)测定在步骤e)中每个等分试样中形成的所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量，和

g)测定在步骤e)中是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和或mTOR之间的复合物。

9.权利要求7或8中任一项的方法，其中和未与所述化合物温育的等分试样相比较，在与所述化合物温育的等分试样中形成减少量的所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物指示PI3K是所述化合物的靶。

10.权利要求5-9中任一项的方法，其中通过使PI3K与所述经固定的苯基噻唑配体1分离和随后检测经分离的PI3K或随后测定经分离的PI3K的量，测定所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

11.权利要求5-10中任一项的方法，其中通过使所述蛋白质与所述经固定的苯基噻唑配体1分离和随后检测经分离的ATM、ATR、DNAPK和或mTOR或随后测定经分离的ATM、ATR、DNAPK和或mTOR的量，执行是否也已形成苯基噻唑配体1与ATM、ATR、DNAPK和/或mTOR之间的复合物的所述测定。

12.权利要求10或11中任一项的方法，其中通过质谱法或免疫检测方法检测所述蛋白质，或测定所述蛋白质的量，优选用针对所述蛋白质的抗体。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其作为中等或高通量筛选执行。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述化合物选自合成化合物或有机合成药物，更优选小分子有机药物和天然小分子化合物。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述PI3K相互作用化合物是PI3K抑制剂。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述固体支持物选自琼脂糖、经修饰的琼脂糖、琼脂糖珠(例如NHS活化的琼脂糖)、乳胶、纤维素和铁磁性或亚铁磁性颗粒。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述苯基噻唑配体1与所述固体支持物共价偶联。

18.用于制备药物组合物的方法，其包括步骤

a)根据权利要求1-17中任一项鉴定PI3K相互作用化合物，和

b)将所述相互作用化合物配制成药物组合物。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述PI3K是PI3Kγ和/或PI3Kδ。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述蛋白质制剂的提供包括收获包含PI3K的至少一个细胞且使所述细胞裂解的步骤。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述苯基噻唑配体1-PI3K复合物形成的步骤在基本生理条件下执行。

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