CN101962634A - 一种从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶和sod粗酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶和SOD复合酶的方法。从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶的方法包括以下步骤：新鲜宣木瓜果实→清洗，去皮、去籽，研磨均匀→超声提取→冷冻离心→上清液粗过滤→超滤→冷冻干燥→木瓜蛋白酶。从宣木瓜果实中提取SOD酶的方法包括以下步骤：新鲜宣木瓜果实→清洗，去皮、去籽→加提取缓冲液，研磨均匀→冷冻离心→上清液→丙酮沉淀→超滤→冷冻干燥→SOD复合酶。本方法提取木瓜蛋白酶和SOD的过程中操作简单，加工成本较低，所得酶的纯度高，活力高。
Description
一、技术背景
本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种木瓜蛋白酶和SOD酶的提取技术。
二、背景技术
木瓜蛋白酶(Papain，E C 3.4.22.2)又称木瓜酶，是一类琉基蛋白酶。广泛存在于番木瓜(Carica papaya)的果实、叶、茎和根内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富[71]。它具有热稳定性好、天然卫生安全、酶活高等特点，因此在食品、日化、饲料、医药、纺织及皮革等行业有广泛应用。又因其稳定性好，对多种蛋白质均具有较好的降解作用，并且蛋白水解能力强，目前已被广泛地应用于诸多行业。在食品行业中：用于啤酒澄清、肉类嫩化、鱼类加工和饲料添加剂；在工业行业中：用于蚕茧脱胶、明胶制造、皮革脱毛等；在医疗卫生行业中：用于治疗消化不良、驱肠虫剂、水肿以及各种炎症等疾病。
现有文献表明提取和利用木瓜蛋白酶已成为当今科技研究的热点之一。以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原科生产木瓜蛋白酶，由于番木瓜种植区主要分布于经济不发达地区，因此蛋白酶生产工艺相对落后。乙引等，就木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节进行了研究，采用单宁沉降法、烘干法等制备木瓜蛋白酶。试验结果表明：在木瓜蛋白酶的制备过程中，要提高木瓜蛋白酶的质和量，必须要加入酶活性保护剂，减少酶失活，干燥过程中温度不宜过高，同时去除杂质。常用的酶保护剂有亚硫酸氢钠、EDTA、焦亚硫酸钠等。目前，木瓜蛋白酶的提取主要采用化学方法，化学方法一方面工艺条件要求很多，操作过程比较繁琐，耗时耗能均较多；另一方面，需要使用大量的化学试剂，成本很高。木瓜蛋白酶传统提取方法存在严重缺陷：木瓜青果乳汁割收方法落后，卫生条件差，乳汁损失大，褐变严重，酶活性低。目前，市场对木瓜蛋白酶需求量增长迅速，而目前的生产方式又不能满足市场的需求。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有特定生物催化功能的蛋白质，由金属离子和蛋白质组成，自然界的植物、动物以及一些微生物体内是SOD的主要存在载体。SOD不仅可以作为蔬菜和水果的保鲜剂；还被作为抗氧化剂应用于果汁、罐头食品、啤酒等食品中，防止过氧化化物酶引起的食品腐败和变质现象。在食品中加入SOD可以增强抗炎、抗疲劳、抗辐射、抗衰老等保健作用。在应用领域的研究上，超氧化物歧化酶被用来当作选择性杀伤癌细胞的靶，通过破坏癌细胞超氧化物歧化酶活性，使癌细胞对毒性氧的防御能力丧失，最后使癌细胞凋亡。超氧化物歧化酶对治疗心肌梗塞、贝切特氏病等血管性心脏病、肺气肿、新生儿呼吸困难综合症、老年白内障、辐射病、胶原病、水肿以及等疾病也有疗效。此外，对由于化疗引起的白血球减少和骨髓损伤的患者通过静脉注射SOD，患者的恢复效果很好。超氧化物歧化酶(SOD)除应用于肝、肾、心脏等器官的保存和移植外，也可应用于小肠和心脏动脉缺血再灌注，及美容，整形、断肢再植等手术过程。此外，重组SOD是通过基因工程技术制备的，目前已广泛应用于研究以及与应用直接相关的基础理论研究。可见SOD在医药、食品及化妆保健品领域，具有广大市场前景。
现有文献表明在很多生物体中存在SOD酶，提取和利用SOD酶已成为当今科技研究的热点之一。专利申请号86100551公开了一种超氧化物歧化酶的提纯方法，它是将动物肝脏匀浆在二价铜盐的的条件下分步加热和透析沉淀除去杂质，提取SOD；采用硫酸铵分步盐析，除去杂蛋白，收集含SOD的蛋白质，再经透析、浓缩、干燥，可获得比活力为2789单位/毫克的SOD。专利申请号为91101832公开了一种大豆超氧化物歧化酶生产方法，它是以大豆(豆类)为原料生产大豆超氧化物歧化酶(大豆SOD)，其生产方法是：将大豆依次经过以下步骤：制作膨胀大豆、制取豆浆、调值处理、离心处理的上清液、加热过滤、超滤浓缩、干燥等工序获得SOD。但上面专利申请均因技术措施或选取的原料不当而未实施。宣木瓜，属蔷薇科木瓜属、落叶阔叶灌木。宣木瓜的营养价值与弥猴桃相媲美，以“百益之果”著称，是***2003年公布30个药食兼用食品之一。经过测定，宣木瓜果实中含有较高的SOD活性，但至今没有对其提取工艺进行深入的研究，经检索，未发现有关从宣木瓜果实中提取SOD酶的报道。
发明内容
本发明提供一种从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶和SOD粗酶的方法。
本发明的目的可以通过以下技术措施来实现：
一种从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将新鲜宣木瓜果实洗净，去皮、去籽；
(2)向步骤(1)处理过的果实里加蒸馏水进行研磨匀浆；
(3)将步骤(2)的研磨匀浆采用超声提取，通过冰浴的方法控制超声温度为4-12℃；
(4)将经过超声提取过的浆料用离心机冷冻离心分离，温度为3-5℃，离心机的转速为6000-10000r/min；
(5)将离心所得的上层清液采用200-600目的筛网及孔径为5μm的袋式滤器进行粗过滤，去除宣木瓜果浆中的杂质及不溶性成分，得到粗酶液；
(6)将粗酶液采用截留分子量为9000-10000道尔顿的超滤膜超滤，分离小分子杂质，得到超滤产物；
(7)将超滤后的产物进行冷冻真空干燥，得木瓜蛋白酶。
一种从宣木瓜果实中提取SOD复合酶的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)将新鲜宣木瓜果实洗净，去皮、去籽；
(2)向步骤(1)处理过的果实里加入提取缓冲液进行研磨匀浆；
(3)将步骤(2)的研磨匀浆采用离心机冷冻离心分离，得到的上层清液为粗酶液，离心机的转速为12000-20000r/min，温度为4-12℃，分离时间为30-50min；
(4)将离心所得的粗酶液置于冰浴中，加入预冷的丙酮，搅拌15-30min，于3-4℃，4500-10000r/min冷冻离心15-20min，弃上清液，用缓冲液溶解沉淀，再透析缓冲液，收集透析液，于3-4℃下静置一夜；
(5)将静置一夜的透析液在3-4℃下、5000-20000r/min冷冻离心10-12min，收集上清液，3-4℃低温保存。
(6)将步骤(5)收集的上层清液采用截留分子量为17000-18000道尔顿的中空纤维膜进行浓缩；
(7)将浓缩后的产物进行冷冻真空干燥，得SOD复合酶。
所述的从宣木瓜果实中提取SOD复合酶的方法，其特征在于：所述的缓冲液为在100ml 0.1mol/L的PH 7.8的磷酸缓冲液中，添加77.00mg DTT，5.000gPVP，充分混匀所制得的溶液。
本发明和已有技术相比具有如下优点：
(1)提取过程完全可控，不受自然环境的影响
(2)提取工艺简单；
(3)提取率高；
(4)在提取过程中，最后采用冷冻真空干燥，最大限度保留了木瓜蛋白酶和SOD酶的活性。
宣木瓜资源丰富，宣木瓜果实营养丰富，具有极高的食用价值和营养保健作用，但由于其酸涩味极少鲜食，目前主要有宣木瓜酒、果醋、果脯、蜜饯等传统食品，利用率不高。本发明以宣木瓜果实为原料，为综合利用宣木瓜资源提供理论和实际应用依据，本发明在工业化实施后，将对促进宣木瓜产业发展、增加果农收入等方面具有积极意义。
具体实施方式
现以实验室实施为例，非限定实施例叙述如下：
(一)宣木瓜果实中木瓜蛋白酶的提取
取新鲜的宣木瓜果实，清洗去皮、籽后，切块，取果肉，加入4℃蒸馏水进行研磨，研磨均匀后，在4-12℃，250-400W条件下超声提取20-40min(超声过程中采用冰浴冷却)，提取液6000-10000r/min，4℃冷冻离心20-40min，上清液即为粗酶液。粗酶液采用200-600目的筛网及孔径为5μm的袋式滤器过滤，去除宣木瓜果浆中的杂质及不溶性成分。过滤后用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤分离小分子杂质，最后将超滤后的产物进行冷冻真空干燥，得木瓜蛋白酶。
(二)宣木瓜果实中SOD的提取
1、取新鲜的宣木瓜果实，清洗去皮、籽后，切块，取果肉置于研钵中，加入提取缓冲液，研磨成匀浆，将匀浆液全部转入离心管，于4-12℃，12000-20000r/min离心30-50min，上清液即为SOD酶粗提液，收集上清液，1-4℃低温保存。【注：提取缓冲液的制备：称取77.00mgDTT，5.000gPVP，加入到100ml0.1mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液中充分摇匀(含5mmol/LDTT和5％PVP)，低温(4℃)贮藏备用】。
2、将粗酶液置于冰浴中，加入预冷的丙酮，搅拌15-30min，于4℃，4500-10000r/min冷冻离心15min，弃上清液，用50mmol/L磷酸缓冲液溶解其沉淀后，透析磷酸缓冲液，放置于4℃冰箱内过夜，5000-20000r/min冷冻离心10min，收集上清液，4℃低温保存。
3、上述上清液用截留分子量18000道尔顿的中空纤维膜进行浓缩，浓缩后的产物进行冷冻真空干燥，得SOD复合酶。
Claims (3)
1.一种从宣木瓜果实中提取木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将新鲜宣木瓜果实洗净，去皮、去籽；
(2)向步骤(1)处理过的果实里加蒸馏水进行研磨匀浆；
(3)将步骤(2)的研磨匀浆采用超声提取，通过冰浴的方法控制超声温度为4-12℃；
(4)将经过超声提取过的浆料用离心机冷冻离心分离，温度为3-5℃，离心机的转速为6000-10000r/min；
(5)将离心所得的上层清液采用200-600目的筛网及孔径为5μm的袋式过滤器进行粗过滤，去除宣木瓜果浆中的杂质及不溶性成分，得到粗酶液；
(6)将粗酶液采用截留分子量为9000-10000道尔顿的超滤膜超滤，分离小分子杂质，得到超滤产物；
(7)将超滤后的产物进行冷冻真空干燥，得木瓜蛋白酶。
2.一种从宣木瓜果实中提取SOD复合酶的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)将新鲜宣木瓜果实洗净，去皮、去籽；
(2)向步骤(1)处理过的果实里加入提取缓冲液进行研磨匀浆；
(3)将步骤(2)的研磨匀浆采用离心机冷冻离心分离，得到的上层清液为粗酶液，离心机的转速为12000-20000r/min，温度为4-12℃，分离时间为30-50min；
(4)将离心所得的粗酶液置于冰浴中，加入预冷的丙酮，搅拌15-30min，于3-4℃，4500-10000r/min冷冻离心15-20min，弃上清液，用缓冲液溶解沉淀，再透析缓冲液，收集透析液，于3-4℃下静置一夜；
(5)将静置一夜的透析液在3-4℃下、5000-20000r/min冷冻离心10-12min，收集上清液，3-4℃低温保存。
(6)将步骤(5)收集的上层清液采用截留分子量为17000-18000道尔顿的中空纤维膜进行浓缩；
(7)将浓缩后的产物进行冷冻真空干燥，得SOD复合酶。
3.根据权利要求2所述的从宣木瓜果实中提取SOD复合酶的方法，其特征在于：所述的缓冲液在100ml0.1mol/L的PH 7.8的磷酸缓冲液中，添加77.00mg DTT，5.000gPVP，充分混匀所制得的溶液。
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