CN101955965A

CN101955965A - 高启动强度宽宿主范围组成型转座表达质粒pUCTn7Pc及其应用

Info

Publication number: CN101955965A
Application number: CN 201010277553
Authority: CN
Inventors: 许平; 徐友强; 陶飞; 马翠卿
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: CN101955965B

Abstract

本发明公开了一种启动强度高启动速度快宿主范围宽的组成型转座表达质粒pUCTn7Pc及其在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。本发明的质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外的诱导操作，而且启动强度高，诱导的速度快，并具有转座的特性，表明该质粒在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用潜力。

Description

高启动强度宽宿主范围组成型转座表达质粒pUCTn7Pc及其应用

技术领域

本发明涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于组成型表达的转座质粒pUCTn7Pc及其在生物降解和生物修复领域的应用。

背景技术

基因表达***在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的重要工具。现在常用的基因表达***，比如tac启动子表达***、Tn7启动子表达***以及一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达***等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达***实施的难度，并可能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al.，2008；Choi et al.，2005)。因而，有必要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。

芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境污染具有重要的意义。

参考文献

Di Gennaro P，Ferrara S，Bestetti G，et al.(2008)Novel auto-inducing expression systems for the development of whole-cell biocatalysts.Appl Microbiol Biotechnol 79：617-625.

Choi K H，Gaynor J B，White K G，et al.(2005)A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.Nat Methods 2：443-448.

发明内容

针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本发明的目的是提供一种高启动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶。

本发明所述高启动强度宽宿主范围组成型转座表达质粒，命名为pUCTn7Pc，由oriT、筛选标记基因bla(氨苄青霉素抗性基因)、筛选标记基因Gm(庆大霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pUCTn7Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的质粒pUCTn7Pc的构建方法是：

合成启动子Pc，共225bp。

以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下：

Pc.f(划线部分为KpnI酶切位点)GATCGGTACCTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(划线部分为XhoI酶切位点)GTCACTCGAGACGGGTTCGCTACCTGC

然后配制反应体系：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(合成的启动子Pc片段)0.5μl，Easy Taq 1μl。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：

94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29个循环；最后72℃10min。

分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围转座型表达质粒pUC18miniTn7T Gm(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名为pUCTn7Pc；所述质粒pUCTn7Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述质粒pUCTn7Pc在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。其中，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒pUCTn7Pc启动子Pc后***儿茶酚双加氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)实现。

儿茶酚双加氧酶基因bphC表达的酶为儿茶酚双加氧酶BphC，该酶的特性在于，它可以迅速的催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘糠酸半醛是一种有黄颜色的化合物，而儿茶酚是无色的。实验中通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等分子操作，将儿茶酚双加氧酶基因bphC***到启动子Pc后边，然后将质粒转化不同的菌株。通过向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，观察转化子的颜色变化来方便的检测转化子是否具有催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛的能力，从而检测本发明质粒是否可以组成型表达以及质粒的宿主适用范围。

上述质粒pUCTn7Pc的应用步骤为：从假单胞菌P.putida B6-2(CGMCC No.3758)中提取基因组，以此为模板，PCR扩增得到基因bphC，然后分别设计带有不同核酸内切酶酶切位点的引物，以扩增产物为模板重新进行扩增，然后分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和质粒pUCTn7Pc进行酶切，DNA连接酶连接。经过鉴定，得到阳性重组质粒pUCTn7PcbphC。以此为基础，将重组质粒通过自然转化法转化不同的宿主，如革兰氏阴性菌。通过喷涂儿茶酚水溶液(见图4和图6)以及菌落PCR(见图3和图5)检测。研究结果表明pUCTn7Pc优选适用于革兰氏阴性菌荧光假单胞菌CICC 23254((Pseudomonas fluorescens CICC 23254)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，CCTCC M208097)等。

本发明利用细菌III型整合子中的启动子Pc与宽宿主范围转座型表达质粒pUC18miniTn7T Gm构建了新的表达质粒pUCTn7Pc，由于启动子Pc具有不需要诱导(即组成型表达)、启动强度高、启动速度快和适用范围广的特点(Xu et al.，2007)，将该启动子***到质粒上，使得构建的质粒具有该启动子的优点，即不需要诱导、启动强度高、启动速度快和适用范围广，正是目前基因表达***的很好的替代***。为了检测本发明的质粒在生物降解和生物修复领域的应用潜力，本发明以假单胞菌(P.putida)B6-2基因组为模板，聚合酶链式反应(PCR)克隆儿茶酚双加氧酶的基因bphC，通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等系列分子操作将其***到表达质粒pUCTn7Pc中启动子Pc的后面，并通过喷涂儿茶酚水溶液，检测了儿茶酚双加氧酶的酶活。通过自然转化法和电穿孔转化法将构建质粒转化不同的革兰氏阴性细菌，发现本发明的质粒可以优选应用于大肠杆菌、荧光假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌。以上特点表明本发明的质粒pUCTn7Pc具有宿主范围宽、组成型表达、启动效率高的特点，不需要外加任何诱导物或者进行任何额外的诱导操作。由于质粒pUC18miniTn7TGm是转座型质粒，可以整合到宿主的染色体上从而使构建的质粒pUCTn7Pc具有转座的特性，质粒转座的基因不容易丢失，而且避免了人为选择压力的加入，从环境污染处理角度来讲，更加经济合理。本发明所构建得到的质粒的特点使其成为目前使用的基因诱导表达***的很好的替代***，在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用前景。

所述的宿主，是指质粒转化的细菌细胞。

所述的转化子，是指质粒转化到细菌中，接受质粒的细菌细胞叫做转化子。

所述的活性检测，是指在启动子Pc后面连接外源基因，然后转化宿主细胞，通过检测外源基因表达的酶的活性，来表征获得的启动子Pc片段是否具有功能活性。所述的组成型表达，是与诱导型表达相对应的一个概念，是指基因无需诱导即可实现表达的一种基因表达方式。

所述的诱导型表达，是指基因在通常情况下不表达或表达程度很低，但在诱导物的作用下，该基因的转录和表达被启动或增强的一种基因表达方式。

参考文献

Choi KH，Gaynor JB，White KG，et al.A Tn7-based broad-host-range bacterial cloning and expression system.Nature Mathods，2005，2(6)：443-448.

Xu H，Davies J，Miao V.(2007)Molecular characterization of class 3integrons from Delftia spp.J Bacteriol，2007，189：6276-6283.

附图说明

图1质粒pUCTn7Pc图谱，图中oriT为复制子，bla为氨苄青霉素抗性基因，Gm为庆大霉素抗性基因，Tn7L和Tn7R为转座子基因，Terminator 1和2为两个基因终止区域，Pc为高启动强度组成型表达的启动子基因。

图2质粒pUCTn7PcbphC图谱，图中oriT为复制子，bla为氨苄青霉素抗性基因，Gm为庆大霉素抗性基因，Tn7L和Tn7R为转座子基因，Terminator 1和2为两个基因终止区域，Pc为高启动强度组成型表达的启动子基因，bphC为儿茶酚双加氧酶的基因。

质粒pUCTn7PcbphC的构建是为了通过基因bphC来检测质粒pMMPc的特性。

图3K.pneumoniae/pUCTn7PcbphC菌落PCR鉴定结果

图3为pUCTn7PcbphC质粒转化肺炎克雷伯氏菌转化子菌落PCR结果。1-9为九个转化子，+，-分别为正、负对照，从图中可以看出，7，8，9扩增出了800bp左右的条带(bphC基因的条带)可能为正确转化子，1-6没有扩增出800bp的条带，应为假阳性转化子。在此基础上，通过转化子化线，喷涂儿茶酚溶液(0.2M)，看菌落是否产生颜色反应来进一步对转化子进行判断。

图4K.pneumoniae/pUCTn7PcbphC转化子喷涂儿茶酚水溶液结果

图中左侧平板为空白对照，右侧平板为K.pneumoniae/pUCTn7PcbphC转化子。从图中的结果可以看出，含有转化质粒的转化子显亮黄色，而菌株的空白对照不显色，说明该质粒可以应用于宿主肺炎克雷伯氏菌。

图5P.fluorescens/pUCTn7PcbphC菌落PCR鉴定结果

图中为P.fluorescens/pUCTn7PcbphC菌落PCR的结果，三个转化子均扩增出了800bp左右的条带(bphC基因的条带)可能为正确转化子。在此基础上，通过转化子化线，喷涂儿茶酚溶液(0.2M)，看菌落是否产生颜色反应来进一步对转化子进行判断。

图6P.fluorescens/pUCTn7PcbphC转化子喷涂儿茶酚水溶液结果

图中左侧平板为空白对照，右侧平板为P.fluorescens/pUCTn7PcbphC转化子。从图中的结果可以看出，含有转化质粒的转化子显亮黄色，而菌株的空白对照不显色，说明该质粒可以应用于宿主荧光假单胞菌。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法，如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

pUC18miniTn7T Gm(来自于GenBank，编号：AY737004)质粒提取

质粒的少量提取使用TIANGEN TIANperp Mini Plasmid Kit质粒小体试剂盒(离心柱型)完成。

①柱平衡步骤：向吸附柱CB3(吸附柱放入收集管中)，加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(-13400*g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

②取1-5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12,000rpm(-13400*g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

③向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

④向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转4-6次使菌体充***解。

注意：温和的混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不超过5min，以免质粒受到损坏。

⑤向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(-13400*g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

⑥小心将上清倒入或移入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。室温放置1-2min，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑧向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

⑨将吸附柱CB3重新放回收集管中，12,000rpm(-13400*g)离心2min，目的是将吸附柱上残存的漂洗液除去。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑩将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置1min，12,000rpm(-13400*g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了质粒pUC18miniTn7T Gm。

实施例2

假单胞菌(Pseudomonas putida)B6-2(发明人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No：3758)基因组提取。

基因组的少量提取使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega Corporation，Madison，WI，USA)完成。

①取1.5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12,000rpm(-13400*g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

②加入600μl核酸裂解液，轻轻混匀。

③80℃，温育5min，然后冷却至室温。

④加入3μl RNA酶，混匀，37℃，温育15-60min，然后冷却至室温。

⑤加入200μl蛋白抽提液，旋涡混匀。冰浴5min。然后13,000rpm，离心3min。

⑥将上清转移至新的eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀。13,000rpm，离心3min，弃掉上清液。

⑦向eppendorf管中加入600μl室温的70％乙醇，轻轻震荡混匀。然后13,000rpm，离心3min。

⑧弃上清，室温放置10-15min，使eppendorf管晾干。

⑨加入100μl溶解液65℃放置1h，或者4℃过夜溶解基因组DNA。

DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了假单胞菌(P.putida)B6-2基因组。

实施例3

1.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因bphC

引物设计如下：

bphC.f(划线部分为SmaI酶切位点)

CGTACCCGGGTCGACGAAGGAGACAGTAATGAGCATCA

bphC.r(划线部分为XbaI酶切位点)

GATCAAGCTTCTAGATCATGCTTTGTTGCGCGCAG

①反应体系的配制：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(P.putida B6-2基因组)0.5μl，EasyTaq 1μl。

②聚合酶链式反应(PCR)循环

具体步骤为：94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃10min。

DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因bphC。

2.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因Pc

引物设计如下：

Pc.f(划线部分为KpnI酶切位点)GATCGGTACCTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(划线部分为XhoI酶切位点)GTCACTCGAGACGGGTTCGCTACCTGC

①反应体系的配制：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(合成的启动子Pc片段)0.5μl，Easy Taq 1μl。

②聚合酶链式反应(PCR)循环

具体步骤为：94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29个循环；最后72℃10min。

DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因Pc。

实施例4

pUCTn7Pc，pUCTn7PcbphC质粒的构建

1.pUCTn7Pc质粒的构建

PCR扩增Pc启动子(Pc.f(KpnI)Pc.r(XhoI))，用KpnI和XhoI酶切处理pUC18minTn7T Gm和PCR扩增的Pc启动子(核酸内切酶KpnI 0.5μl，核酸内切酶XhoI 0.5μl，10×Buffer 1μl，DNA 8μl，37℃，2小时)，连接10×T4DNALigase Buffer 1μl，T4DNALigase 1μl，质粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16℃，过夜连接)，转化大肠杆菌，用菌落PCR方法筛选转化子。通过筛选得到了质粒pUCTn7Pc，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.pUCTn7PcbphC质粒的构建

扩增基因bphC(P.putida B6-2基因组为模板)(bphC.f(SmaI)bphC.r(XbaI))；SmaI和XbaI酶切PCR产物和pUCTn7Pc质粒(核酸内切酶SmaI 0.5μl，核酸内切酶XbaI 0.5μl，10×Buffer 1μl，DNA 8μl，37℃，2小时)，然后T4DNA连接酶连接10×T4DNA Ligase Buffer1μl，T4DNALigase 1μl，质粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16℃，过夜连接)，转化大肠杆菌筛选具有基因活性的转化子。通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒pUCTn7PcbphC，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

实施例5

构建质粒宿主适用范围检测

1.质粒pUCTn7Pc，pUCTn7PcbphC通过自然转化法转化大肠杆菌(大肠杆菌Mach T1((E.coli Mach T1)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech，Co.))。

①制备大肠杆菌感受态细胞。

②将10μl质粒加入100μl感受态大肠杆菌细胞，混合均匀，冰浴30min。

③37℃水浴保温5min。

④冰浴2min，加入400μl LB液体培养基，37℃培养1h。

⑤取100μl培养物，涂布抗性平板，培养过夜。

经过常规方法验证，得到了E.coli Mach T1/pUCTn7Pc，E.coli Mach T1/pUCTn7PcbphC转化子。

2.质粒pUCTn7PcbphC通过电转化法转化假单胞菌(荧光假单胞菌CICC 23254((P.fluorescens CICC 23254)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心))。

①假单胞菌感受态的制备。

②向150μl感受态细胞中加入10μl(50ng/μl)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯中，冰上放置1～1.5min。

③电击：25μF，200Ω，时间常数为4.5～5.0ms，低于4.2ms，则效率明显下降。

④电击完毕后取出杯子并立即加入1ml恢复培养基，30℃孵育1h。

⑤涂布抗性平板，30℃过夜培养。

经过常规方法验证，得到了P.fluorescens CICC 23254/pUCTn7PcbphC转化子。

3.质粒pUCTn7PcbphC通过电转化法转化肺炎克雷伯氏菌(发明人保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC M 208097)。

①肺炎克雷伯氏菌感受态的制备。

②向50μl感受态细胞中加入1-2μl(50ng/μl)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯中。

③电击：25μF，200Ω，1.8kV。

④电击完毕后取出杯子并立即加入1ml LB培养基，37℃孵育2h。

⑤涂布抗性平板，37℃过夜培养。

经过常规方法验证，得到了K.pneumonia CCTCC M 208097/pUCTn7PcbphC转化子。

4.向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，通过转化子菌落颜色变化检测质粒是否可以组成型表达以及它的适用范围。

结果发现质粒pUCTn7Pc可以优选适用于菌株荧光假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌(见图4和6)。

5.菌落PCR检测转化子

挑取转化子菌落至LB摇管，过夜震荡培养，取1ml菌液，离心，弃上清，菌泥用100μl无菌水悬浮，沸水浴10min，然后离心，以上清作为模板，进行实施例3所述的聚合酶链式反应，扩增出了800bp左右的条带，证明转化子中含有正确的构建质粒(见图3和5)。

Claims

1.一种高启动强度宽宿主组成型转座表达质粒，命名为pUCTn7Pc，由复制子oriT、筛选标记基因bla(氨苄青霉素抗性基因)、筛选标记基因Gm(庆大霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pUCTn7Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.权利要求1中所述质粒pUCTn7Pc在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒pUCTn7Pc启动子Pc后***儿茶酚双加氧酶的基因bphC实现。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是荧光假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌。