CN101955966B - 高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pBSPPc及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种启动强度高启动速度快宿主范围宽的组成型表达质粒pBSPPc及其在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。本发明的质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外的诱导操作，而且启动强度高，诱导的速度快，表明该质粒在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用潜力。

Description

高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pBSPPc及其应用

技术领域

本发明涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pBSPPc及其在生物降解和生物修复领域的应用。

背景技术

基因表达***在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的重要工具。现在常用的基因表达***，比如tac启动子表达***、Tn7启动子表达***以及一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达***等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达***实施的难度，并可能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al.，2008；Choi et al.，2005)。因而，有必要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。

芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境污染具有重要的意义。

参考文献

Di Gennaro P，Ferrara S，Bestetti G，et al.Novel auto-inducing expression systems for thedevelopment of whole-cell biocatalysts.Appl Microbiol Biotechnol，2008，79：617-625.

Choi K H，Gaynor J B，White K G，et al.(2005)A Tn7-based broad-range bacterial cloningand expression system.Nat Methods，2005，2：443-448.

发明内容

针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本发明的目的是提供一种高启动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶。

本发明所述高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒，命名为pBSPPc，由复制子ori₁₆₀₀、筛选标记基因bla(氨苄抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pBSPPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的质粒pBSPPc的构建方法是：

合成启动子Pc，共225bp。

以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下：

Pc.f(划线部分为KpnI酶切位点)GATCGGTACCTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(划线部分为XhoI酶切位点)GTCACTCGAGACGGGTTCGCTACCTGC

然后配制反应体系：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(合成的启动子Pc片段)0.5μl，Easy Taq 1μl。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：

94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29个循环；最后72℃10min。

分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围表达质粒pBSPIISK(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名为pBSPPc；所述质粒pBSPPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述质粒pBSPPc在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。其中，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒pBSPPc启动子Pc后***儿茶酚双加氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示)实现。

儿茶酚双加氧酶基因bphC表达的酶为儿茶酚双加氧酶BphC，该酶的特性在于，它可以迅速的催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘糠酸半醛是一种有黄颜色的化合物，而儿茶酚是无色的。实验中通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等分子操作，将儿茶酚双加氧酶基因bphC***到启动子Pc后边，然后将质粒转化不同的菌株。通过向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，观察转化子的颜色变化来方便的检测转化子是否具有催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛的能力，从而检测本发明质粒是否可以组成型表达以及质粒的宿主适用范围，并通过儿茶酚双加氧酶活性的测定检测质粒的其它特性。

上述质粒pBSPPc的应用步骤为：从假单胞菌P.putida B6-2(CGMCCNo.3758)中提取基因组，以此为模板，PCR扩增得到基因bphC。然后设计带有核酸内切酶酶切位点的引物，以bphC基因为模板，再次扩增。之后用核酸内切酶对扩增产物和质粒pBSPPc进行酶切，DNA连接酶连接。经过鉴定，得到阳性重组质粒pBSPPcbphC。以此为基础，将重组质粒以自然转化法和电穿孔转化法转化不同的宿主，如革兰氏阴性菌。通过喷涂儿茶酚水溶液以及菌落PCR检测，研究结果表明pBSPPc可以优选适用于大肠杆菌Mach T1((Escherichia coliMach T1)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech，Co.))、荧光假单胞菌CICC23254((Pseudomonas fluorescens CICC 23254)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)、施氏假单胞菌SDM(Pseudomonas stutzeri SDM，发明人保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC No.M206010)和恶臭假单胞菌KT2440((Pseudomonas putida KT2440，ATCC 47054)购自美国标准生物品保藏中心)等。

本发明进一步对质粒pBSPPcbphC表达儿茶酚双加氧酶的酶活进行了检测。首先，将经过验证正确的含有构建质粒的转化子P.putida KT2440/pBSPPcbphC过夜培养。然后，按1％接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，摇床震荡培养。每两个小时取样，测定菌体浓度(OD₆₀₀)以及儿茶酚双加氧酶BphC的酶活。

所述酶活测定方法为：超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用APbuffer(含10％丙酮的pH 7.5的PB缓冲液)稀释至3ml，加入50μl的0.2M的儿茶酚溶液，振荡混匀。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据(见图3)。

本发明利用细菌III型整合子中的启动子Pc与宽宿主范围表达质粒pBSPIISK(Schweizer，2001)构建了新的表达质粒pBSPPc，由于启动子Pc具有不需要诱导(即组成型表达)、启动强度高、启动速度快和适用范围广的特点(Xu et al.，2007)，将该启动子***到质粒上，使得构建的质粒具有该启动子的优点，即不需要诱导、启动强度高、启动速度快和适用范围广，正是目前基因表达***的很好的替代***。为了检测本发明的质粒在生物降解和生物修复领域的应用潜力，本发明以假单胞菌(P.putida)B6-2基因组为模板，聚合酶链式反应(PCR)克隆儿茶酚双加氧酶的基因bphC，通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等系列分子操作将其***到表达质粒pBSPPc中启动子Pc的后面，并检测了儿茶酚双加氧酶的酶活。通过自然转化法和电穿孔转化法将构建质粒转化不同的革兰氏阴性细菌，发现本发明的质粒优选应用于大肠杆菌、施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌或荧光假单胞菌。以上特点表明本发明的质粒pBSPPc具有宿主范围宽、组成型表达、启动效率高的特点，不需要外加任何诱导物或者进行任何额外的诱导操作。本发明所提供的质粒的特点使其成为目前使用的基因诱导表达***的很好的替代***，在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用前景。

所述的宿主，是指质粒转化的细菌细胞。

所述的转化子，是指质粒转化到细菌中，接受质粒的细菌细胞叫做转化子。

所述的活性检测，是指在启动子Pc后面连接外源基因，然后转化宿主细胞，通过检测外源基因表达的酶的活性，来表征获得的启动子Pc片段是否具有功能活性。

所述的组成型表达，是与诱导型表达相对应的一个概念，是指基因无需诱导即可实现表达的一种基因表达方式。

所述的诱导型表达，是指基因在通常情况下不表达或表达程度很低，但在诱导物的作用下，该基因的转录和表达被启动或增强的一种基因表达方式。

参考文献

Schweizer H P.Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression inPseudomonas.Curr Opin Biotechnol，2001，12：439-445.

Xu H，Davies J，Miao V.(2007)Molecular characterization of class 3integrons from Delftiaspp.J Bacteriol，2007，189：6276-6283.

附图说明

图1质粒pBSPPc图谱，图中Pc为高启动强度组成型表达启动子基因，P_lac为诱导性启动子基因，bla为氨苄青霉素抗性基因，rep为复制区域，ori₁₆₀₀为复制子基因。

图2质粒pBSPPcbphC图谱，图中Pc为高启动强度组成型表达启动子基因，P_lac为诱导性启动子基因，bla为氨苄青霉素抗性基因，rep为复制区域，ori₁₆₀₀为复制子基因，bphC为儿茶酚双加氧酶基因。

质粒pBSPPcbphC的构建是为了通过基因bphC来检测质粒pMMPc的特性。

图3为转化子P.putida KT2440/pBSPPcbphC菌体浓度和酶活数据曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法，如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

pBSPIISK(Schweizer，2001)质粒提取

质粒的少量提取使用TIANGEN TIANperp Mini Plasmid Kit质粒小体试剂盒(离心柱型)完成。

①柱平衡步骤：向吸附柱CB3(吸附柱放入收集管中)，加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(-13400*g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

②取1-5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12,000rpm(-13400*g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

③向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

④向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转4-6次使菌体充***解。

注意：温和的混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不超过5min，以免质粒受到损坏。

⑤向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(-13400*g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

⑥小心将上清倒入或移入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。室温放置1-2min，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑧向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(-13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

⑨将吸附柱CB3重新放回收集管中，12,000rpm(-13400*g)离心2min，目的是将吸附柱上残存的漂洗液除去。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑩将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置1min，12,000rpm(-13400*g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了质粒pBSPIISK。

实施例2

假单胞菌(Pseudomonas putida)B6-2(发明人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No：3758)基因组提取。

基因组的少量提取使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega Corporation，Madison，WI，USA)完成。

①取1.5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12,000rpm(-13400*g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

②加入600μl核酸裂解液，轻轻混匀。

③80℃，温育5min，然后冷却至室温。

④加入3μl RNA酶，混匀，37℃，温育15-60min，然后冷却至室温。

⑤加入200μl蛋白抽提液，旋涡混匀。冰浴5min。然后13,000rpm，离心3min。

⑥将上清转移至新的eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀。13,000rpm，离心3min，弃掉上清液。

⑦向eppendorf管中加入600μl室温的70％乙醇，轻轻震荡混匀。然后13,000rpm，离心3min。

⑧弃上清，室温放置10-15min，使eppendorf管晾干。

⑨加入100μl溶解液65℃放置1h，或者4℃过夜溶解基因组DNA。

DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了假单胞菌B6-2的基因组。

实施例3

1.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因bphC

引物设计如下：

bphC.f(划线部分为SmaI酶切位点)

CGTACCCGGGTCGACGAAGGAGACAGTAATGAGCATCA

bphC.r(划线部分为XbaI酶切位点)

GATCAAGCTTCTAGATCATGCTTTGTTGCGCGCAG

①反应体系的配制：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(P.putida B6-2基因组)0.5μl，EasyTaq 1μl。

②聚合酶链式反应(PCR)循环

具体步骤为：94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃10min。

DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因bphC。

2.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因Pc(Pc基因片段由北京六合华大基因科技股份有限公司合成)。

引物设计如下：

Pc.f(划线部分为KpnI酶切位点)GATCGGTACCTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(划线部分为XhoI酶切位点)GTCACTCGAGACGGGTTCGCTACCTGC

①反应体系的配制：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(人工合成的启动子Pc片段)0.5μl，EasyTaq 1μl。

②聚合酶链式反应(PCR)循环

具体步骤为：94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29个循环；最后72℃10min。

DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因Pc。

实施例4

pBSPPc，pBSPPcbphC质粒的构建

1.pBSPPc质粒的构建

PCR扩增Pc启动子(Pc.f(KpnI)Pc.r(XhoI))；然后用KpnI和XhoI酶切处理pBSPIISK(-)和PCR扩增的Pc启动子(核酸内切酶KpnI 0.5μl，核酸内切酶XhoI 0.5μl，10×Buffer 1μl，DNA 8μl，37℃，2小时)，连接(10×T4DNALigase Buffer 1μl，T4DNALigase 1μl，质粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16℃，过夜连接)。转化大肠杆菌。通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒pBSPPc，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.pBSPPcbphC质粒的构建

扩增基因bphC(以P.putida B6-2基因组为模板)(bphC.f(SmaI)bphC.r(XbaI))；然后用SmaI和XbaI酶切PCR产物和pBSPPc质粒(核酸内切酶SmaI 0.5μl，核酸内切酶XbaI 0.5μl，10×Buffer 1μl，DNA 8μl，37℃，2小时)，连接(10×T4DNALigase Buffer 1μl，T4DNALigase 1μl，质粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16℃，过夜连接)，转化大肠杆菌。通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒pBSPPcbphC，其核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

实施例5

构建质粒宿主适用范围检测

1.质粒pBSPPc，pBSPPcbphC通过自然转化法转化大肠杆菌(大肠杆菌Mach T1((E.coliMach T1)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech，Co.)))。

①制备大肠杆菌感受态细胞。

②将10μl质粒加入100μl感受态大肠杆菌细胞，混合均匀，冰浴30min。

③37℃水浴保温5min。

④冰浴2min，加入400μl LB液体培养基，37℃培养1h。

⑤取100μl培养物，涂布抗性平板，培养过夜。

经过常规方法验证，得到了E.coli Mach T1/pBSPPc，E.coli Mach T1/pBSPPcbphC转化子。

2.质粒pBSPPcbphC通过电穿孔转化法转化假单胞菌(恶臭假单胞菌KT2440((P.putidaKT2440，ATCC 47054)购自美国标准生物品保藏中心)、荧光假单胞菌CICC 23254((P.fluorescens CICC 23254)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)、施氏假单胞菌SDM(P.stutzeri SDM，发明人保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC No.M206010)。

①制备假单胞菌感受态。

②向150μl感受态细胞中加入10μl(50ng/μl)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯中，冰上放置1～1.5min。

③电击：25μF，200Ω，时间常数为4.5～5.0ms，低于4.2ms，则效率明显下降。

④电击完毕后取出杯子并立即加入1ml恢复培养基，30℃孵育1h。

⑤涂布抗性平板，30℃过夜培养。

经过常规方法验证，得到了P.putida KT2440/pBSPPcbphC，P.florescens CICC23254/pBSPPcbphC，P.stutzeri SDM/pBSPPcbphC转化子。

3.向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，通过转化子菌落颜色变化检测质粒是否可以组成型表达以及它的适用范围。

结果发现质粒pBSPPc可以优选适用于菌株大肠杆菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌。

4.菌落PCR检测转化子

挑取转化子菌落至LB摇管，过夜震荡培养，取1ml菌液，离心，弃上清，菌泥用100μl无菌水悬浮，沸水浴10min，然后离心，以上清作为模板，进行实施例3所述的聚合酶链式反应，扩增出了800bp左右的条带，证明转化子中含有正确的构建质粒。

实施例6

构建质粒诱导强度检测

将经过验证正确的含有构建质粒的转化子P.putida KT2440/pBSPPcbphC过夜培养。

按1％接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，30℃摇床震荡培养。转化子P.putidaKT2440/pBSPPcbphC不加任何诱导物也不进行任何其他的诱导操作。每两个小时取样，测定菌体浓度(OD₆₀₀)以及儿茶酚双加氧酶(BphC)的酶活。

酶活测定方法：超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用AP buffer(含10％丙酮的pH 7.5PB缓冲液)稀释至3ml，加入50μl的0.2M的儿茶酚溶液，振荡混匀。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据(具体数据见图3)。

Claims (3)

1.一种高启动强度宽宿主组成型表达质粒，命名为pBSPPc，由复制子ori₁₆₀₀、筛选标记基因氨苄抗性基因、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pBSPPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1中所述质粒pBSPPc在大肠杆菌、施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌或荧光假单胞菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒pBSPPc启动子Pc后***儿茶酚双加氧酶的基因bphC实现，其中所述的儿茶酚双加氧酶的基因bphC核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 

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