CN101942493A

CN101942493A - 普鲁兰糖无色素生产方法

Info

Publication number: CN101942493A
Application number: CN2009101487663A
Authority: CN
Inventors: 朱希强; 相茂功; 郭学平; 苏移山; 刘飞; 颜震; 陈勉; 张晓元; 候重文; 李海军; 李霞; 凌沛学
Original assignee: SHANDONG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL ACADEMY
Current assignee: SHANDONG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL ACADEMY
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-01-12

Abstract

本发明涉及到普鲁兰糖无色素发酵生产方法，本发明以出芽短梗霉为出发菌株，经微波诱变，得到高产普鲁兰糖且色素分泌少的突变菌株；普鲁兰糖的发酵生产包括以下几个步骤：(1)种子及发酵培养基的制备；(2)将活化后菌种按2％～10％接种量将菌种接到种子培养基，28±1℃培养24～36h，种子浓度0.8～2.5×10⁸个/mL；(3)按2％～10％接种量将种子液接到发酵培养基，罐压0.01～0.05Mpa，温度28±1℃，在发酵的不同阶段调节搅拌速度及通气量，发酵60～72h；(4)发酵液后处理工艺：发酵液脱色、板框过滤、糖液用陶瓷膜超滤等方法进行超滤浓缩，喷雾干燥，最后得到普鲁兰糖产品。

Description

普鲁兰糖无色素生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵生产普鲁兰糖的方法。

背景技术

普鲁兰糖(Pullulan)由出芽短梗霉分泌的一种易溶于水的微生物多糖，1939年R.Baner首先在出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的发酵液中发现一种黏性物质，即普鲁兰糖。1959年Bender等首先表征了出芽短梗霉发酵产生的普鲁兰糖是由中性葡萄糖组成，它是葡萄糖按α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6-糖苷键反复连接而成高分子多糖，是一种易溶于水、安全无毒害、可食用、低热值的天然多糖，因其可塑性、成膜性好、簿膜隔气性佳，故常用其作为保色、保香、保鲜、抗氧化等的包装材料。普鲁兰糖可以广泛的用做涂料或包装材料；作为淀粉的替代者，它可以用作制作低热量及保健食品；同时可以广泛用于化妆品行业；在医药行业，它可以作为黏合剂，增稠剂及胶囊囊材；也可以作为生物絮凝剂用于污水处理；此外，普鲁兰糖在石油化工、农业、造纸等方面也有较广应用。普鲁兰糖的生产及应用已经有30多年的研究历史，日本林原公司在70年代进行中试规模工业化生产，至今一直垄断国际市场。国内经过20年研究也有较大进展，但仍存在较多问题，其中出芽短梗霉发酵过程中产生黑色素及底物糖的转化率问题为制约工业化生产的关键问题，而且发酵目前发酵生产普鲁兰糖的时间一般为120h左右，导致发酵效率下降，目前国内外很多科研机构很难同时解决以上几个问题，因此使得工业化过程相当缓慢。

本发明使用微波诱变法得到高产低色素突变菌株，利用该菌株生产普鲁兰糖，同时在发酵过程中按发酵时间对搅拌速度及通气量进行调控，增加普鲁兰糖的产量，减少色素分泌，大大缩短了发酵时间，提高了普鲁兰糖的生产效率。

发明内容

微波诱变操作步骤：a.菌悬液的制备：将培养24h的出芽短梗霉用无菌生理盐水稀释至10⁶个/mL，b.吸取制得的菌悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调微波炉功率为700W，脉冲频率为2450MHz，按不同的处理时间(一般小于1min)，对孢子悬液进行辐照处理，然后分别从每个平皿中取出0.1mL的菌悬液，进行适当稀释，得到不同稀释度的菌悬液，c.吸取上述稀释后的菌悬液0.3mL，涂布分离培养基平板，然后置于30℃恒温箱培养3d，活菌计数，计算致死率。以分离平板上菌落直径的比值及菌落颜色作为初筛标志，挑取比值大且颜色白的菌落在斜面上传代3次，然后进行摇瓶发酵复筛。

种子培养基及种子液制备：a.种子培养基组成为：蔗糖5％；酵母膏0.2％；NaCl 0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；K₂HPO₄·3H₂O 0.63％；(NH4)₂SO₄0.06％，初始pH 6.5。115℃灭菌20min；b.种子液制备：将步骤(1)中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24～36h，种子浓度0.8～2.5×10⁸个/mL，作为一级种子，将一级种子按2％～10％接入种子培养基，逐级扩大至适合相应接种量，作为发酵种子液。

发酵培养基制备及发酵控制：发酵生产所用培养基为：蔗糖10％；酵母膏0.2％；NaCl0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；K₂HPO₄·3H₂O 0.63％；(NH4)₂SO₄0.06％，初始pH 6.5。按2％～10％接种量将种子液接入发酵培养基，培养温度28±1℃，罐压0.01～0.05Mpa。发酵前24h，搅拌速度150～240r/min，通气量1～2L/min。24h以后菌体浓度达到1.5～2.5×10⁸个/mL，调搅拌速度到400～650r/min，通气量3～5L/min。48h以后，搅拌速度调为200～300r/min，通气量5～8L/min，直至发酵结束。

发酵液下游处理工艺：(1)发酵液脱色：发酵液加入0.1～0.8％活性炭，调pH至3.0～4.0，加热至65～85℃，搅拌15～30min；搅拌结束后静置10～20min；(2)过滤除菌：使用150～500目的过滤板进行过滤，其中加入的助滤剂可以为珍珠岩、硅藻土或活性漂土等；(3)超滤浓缩：使用管式、螺旋卷式、中空纤维式等类型的超滤设备进行超滤浓缩，得到浓缩后糖液；(4)喷雾干燥：使用旋转式、压力式、气流式等喷雾干燥设备对浓缩后糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰多糖产品。

具体实施方法

实施例一：30L发酵罐发酵及下游处理

种子培养基：蔗糖5％；酵母膏0.2％；NaCl 0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；K₂HPO₄·3H₂O0.63％；(NH4)₂SO₄0.06％，初始pH 6.5。115℃灭菌20min。

发酵生产所用培养基为：蔗糖10％；酵母膏0.2％；NaCl 0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；K₂HPO₄·3H₂O 0.63％；(NH4)₂SO₄0.06％，初始pH 6.5。

种子液培养：将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24h，种子浓度2.0×10⁸个/mL，作为一级种子，将一级种子按2％接种量将菌种接入装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24h作为二级种子液。

30L发酵罐发酵：按2％接种量将种子液接入含有20L发酵培养基的30L发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa。发酵前24h，搅拌速度180r/min，通气量1L/min。24h以后菌体浓度达到1.8×10⁸个/mL，调搅拌速度到500r/min，通气量4L/min。48h以后，搅拌速度调为230r/min，通气量6.5L/min，继续发酵12h，发酵结束，糖转化率为68％。

发酵液下游处理：a.若发酵液颜色较深则进行发酵液脱色：发酵液加入0.2％活性炭，调pH至3.5，加热至70℃，搅拌20分钟；搅拌结束后静置20min；b.过滤除菌：使用200目的过滤板进行过滤，其中加入质量分数为3％的珍珠岩作为助滤剂进行过滤除菌；c.超滤浓缩：使用陶瓷膜超滤***进行超滤浓缩，得到浓缩后糖液；d.喷雾干燥：离心喷雾干燥设备对浓缩后糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰多糖产品。普鲁兰多糖得率为89％。

实施例二：1m³发酵罐发酵及下游处理

发酵生产所用培养基为：葡萄糖10％；酵母膏0.2％；NaCl 0.1％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；K₂HPO₄·3H₂O 0.63％；(NH4)₂SO₄0.06％，初始pH 6.5。

种子液培养：将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24min，种子浓度2.0×10⁸个/mL，作为一级种子，将一级种子按2％接种量将菌种接入装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24h作为二级种子液。按2％接种量将二级种子液接入含有20L种子培养基的30L发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa，搅拌速度180r/min，通气量1L/min，培养24h，作为三级种子。

1m³发酵罐发酵：按2％接种量将种子液接入含有700L发酵培养基的1m³发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa。发酵前24h，搅拌速度180r/min，通气量1L/min。24h以后菌体浓度达到1.8×10⁸个/mL，调搅拌速度到450r/min，通气量4L/min。48h以后，搅拌速度调为250r/min，通气量6.0L/min，继续发酵12h，发酵结束，糖转化率为67％。

发酵液下游处理：a.若发酵液颜色较深则进行发酵液脱色：发酵液加入0.2％活性炭，调pH至3.5，加热至70℃，搅拌20min；搅拌结束后静置20分钟；b.过滤除菌：使用200目的过滤板进行过滤，其中加入质量分数为3％的珍珠岩作为助滤剂进行过滤除菌；c.超滤浓缩：使用陶瓷膜超滤***进行超滤浓缩，得到浓缩后糖液；d.喷雾干燥：离心喷雾干燥设备对浓缩后糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰多糖产品。普鲁兰多糖得率为88％。

实施例三：10m³发酵罐发酵及下游处理

种子液培养：将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度28±1℃，摇床转速250r/min，培养24h，种子浓度2.0×10⁸个/mL，作为一级种子，将一级种子按2％接种量将菌种接入装有5L种子培养基的8L发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa，搅拌速度180r/min，通气量1L/min，培养24h作为二级种子液。按2％接种量将二级种子液接入含有200L种子培养基的300L发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa，搅拌速度180r/min，通气量1L/min，培养24h，作为三级种子。

10m³发酵罐发酵：按2％接种量将种子液接入含有7000L发酵培养基的10m³发酵罐中，培养温度28±1℃，罐压0.03Mpa。发酵前24h，搅拌速度150r/min，通气量1L/min。24h以后菌体浓度达到2.0×10⁸个/mL，调搅拌速度到380r/min，通气量4L/min。48h以后，搅拌速度调为200r/min，通气量6.0L/min，继续发酵12h，发酵结束，糖转化率为69％。

发酵液下游处理：a.若发酵液颜色较深则进行发酵液脱色：发酵液加入0.2％活性炭，调pH至3.5，加热至70℃，搅拌20min；搅拌结束后静置20min；b.过滤除菌：使用200目的过滤板进行过滤，其中加入质量分数为3％的珍珠岩作为助滤剂进行过滤除菌；c.超滤浓缩：使用陶瓷膜超滤***进行超滤浓缩，得到浓缩后糖液；d.喷雾干燥：离心喷雾干燥设备对浓缩后糖液进行喷雾干燥，得到粉末状普鲁兰糖产品。普鲁兰糖得率为90％。

Claims

1.普鲁兰糖无色素生产方法，其特征在于：由以下步骤组成：

(1)按2％～10％接种量将活化后菌种接到种子培养基中培养，得到种子液体；

(2)按2％～10％接种量将种子液接到发酵培养基，在发酵的不同阶段调节搅拌速度及通气量，发酵60～72h，得到发酵液；

(3)发酵液经过下游处理工艺得到普鲁兰糖。

2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中的活化后菌种为出芽短梗霉经过微波诱变所得。

3.权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中发酵培养基的组成为碳源10％、酵母膏0.2％、NaCl 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄·3H₂O 0.63％、(NH4)₂SO₄0.06％，其余为水，初始pH 6.5。

4.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)的培养温度为28±1℃，培养时间为24～36h，种子浓度0.8～2.5×10⁸个/mL；步骤(2)的培养温度为28±1℃，罐压0.01～0.05Mpa。

5.权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中的搅拌速度及通气量为：发酵前24h，搅拌速度150～240r/min，通气量1～2L/min；24h以后菌体浓度达到1.5～2.5×10⁸个/mL，调搅拌速度到400～650r/min，通气量3～5L/min；48h以后，搅拌速度调为200～300r/min，通气量5～8L/min，直至发酵结束。

6.权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中下游处理工艺包括发酵液脱色、过滤除菌、超滤浓缩和喷雾干燥。

7.权利要求6所述的方法，其中，发酵液脱色方法为：发酵液加入0.1～0.8％活性炭，调pH至3.0～4.0，加热至65～85℃，搅拌15～30min；搅拌结束后静置10～20min；过滤除菌的方法为：使用150～500目的过滤板进行过滤，其中加入助滤剂珍珠岩、硅藻土和/或活性漂土0～适量；超滤浓缩的方法为：使用管式、螺旋卷式、中空纤维式等类型的超滤设备进行超滤浓缩；喷雾干燥的方法为：使用旋转式、压力式或气流式等喷雾干燥设备进行喷雾干燥。

8.权利要求2所述的方法，其中，微波诱变的方法为：

(1)菌悬液的制备：将培养24h的出芽短梗霉用无菌生理盐水稀释至10⁶个/mL；

(2)吸取制得的菌悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调微波炉功率为700W，脉冲频率为2450MHz，按不同的处理时间(一般小于1min)对孢子悬液进行辐照处理，然后分别从每个平皿中取出0.1mL的菌悬液，进行适当稀释，得到不同稀释度的菌悬液；

(3)吸取上述稀释后的菌悬液0.3mL，涂布分离培养基平板，然后置于30℃恒温箱培养3d，以分离平板上菌落直径的比值及菌落颜色作为初筛标志，挑取比值大且颜色白的菌落在斜面上传代3次，然后进行摇瓶发酵复筛。