CN101939442A - 产生可发酵糖类和醇的无pH调节*** - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在淀粉液化步骤之前或之后无pH调节，从含淀粉物质(例如谷粒)产生下游产物如可发酵糖类(例如葡萄糖)和醇类(例如乙醇)的方法。

Description

产生可发酵糖类和醇的无pH调节***
交互引用
本申请要求2008年2月6日提交的美国申请系列号61/026,510的优先权，所述申请在此完整引入。
技术领域
本发明涉及在淀粉液化步骤之前或之后无pH调节，从诸如谷粒(grain)的含淀粉物质(material)产生下游产品，如可发酵糖类(例如葡萄糖)和醇类(例如乙醇)的方法。
背景技术
一般而言，淀粉至可发酵糖和/或醇的加工包含许多步骤。在典型方法中，碾磨含颗粒淀粉(granular starch)的谷粒(grain)和谷物(cereal)。一般使用两种碾磨方法，这两种方法在本领域称为湿磨法和干磨法。然后将碾碎的含淀粉物质与水性溶液混合，产生干固体含量在25％-45％范围内的浆液(slurry)。通常，在干磨法中，与碾碎的含淀粉物质混合的水性溶液不仅包含水，还包含不同量的稀釜馏物。向浆液中加入稀釜馏物必须调节浆液的pH。例如，当将全研磨玉米粒用作含淀粉物质并与水混合时，浆液的pH是约pH 5.8-pH 6.2。但是，通过加入稀釜馏物将浆液的pH降至约pH 4.8-pH 5.2。工业上在可发酵糖和/或醇加工中用稀釜馏物来节省用水量。然后通过液化方法将淀粉转化为短链的低粘度糊精，该方法一般涉及在淀粉胶凝的同时或之后加入α淀粉酶。
目前用于大部分商业液化方法的α淀粉酶在pH 4.8-pH 5.2的pH水平不稳定，因此用适合的碱(例如氢氧化钠或氢氧化钙、碳酸钠或氨)将浆液的pH调节至约pH 5.6-6.0。
然后通过糖化步骤将液化的淀粉转化为低分子量糖类，该步骤一般包含使用葡糖淀粉酶的酶作用。低分子量糖类可以进一步纯化(例如至纯化的葡萄糖)、异构化(例如至果糖)或通过如酵母的发酵微生物代谢(例如至乙醇)。糖化和发酵步骤一般可以同时进行。在pH 5.6-6.0开始酵母发酵可导致高风险的微生物污染，因此工业醇生产者一般在液化后用例如稀释酸(例如硫酸)调节pH至pH低于5.0。
液化步骤之前和之后为液化提供适当条件所需的pH调节和酵母发酵可导致发酵培养基中高盐累积和高硫含量，其可产生环境处理问题。
尽管已对从含淀粉物质产生可发酵糖类和醇类的液化、糖化和发酵方法作了许多改进，但仍存在对这些方法步骤的更有效手段的需要。
发明简述
本发明涉及产生可发酵糖类和/或醇的方法，该方法无需pH调节，更具体而言无需a)在液化步骤中加入碱以提高pH和/或b)为发酵步骤加入酸以降低pH。参见图1。
本发明的一个方面涉及无pH调节的液化步骤，其中液化的pH在pH4.5-5.4的范围内，且不向液化方法步骤加入中和酸的化学品。
另一个方面，本发明涉及产生可发酵糖的方法，其包含a)将碾碎的含淀粉物质与水和稀釜馏物混合(其中稀釜馏物在10％-70％v/v的范围内)，获得包含淀粉且具有20％-50％w/w干固体(ds)含量的浆液，b)在液化淀粉之前或与之同时用肌醇六磷酸酶处理浆液，c)液化淀粉，d)在步骤b)中和/或与液化步骤同时向淀粉加入α淀粉酶和e)糖化液化的淀粉以获得可发酵糖类，其中在任意步骤a)、b)、c)、d)或e)中未调节pH。在一些实施方案中，回收和纯化或异构化可发酵糖。在其他实施方案中，在液化步骤前加入肌醇六磷酸酶。在其他实施方案中，α淀粉酶与肌醇六磷酸酶一起加入。在其他实施方案中，在液化步骤中加入第二α淀粉酶剂量。
另一个方面，本发明涉及从含淀粉物质产生醇的方法，其包含如上文所公开的液化和糖化液化的淀粉以获得可发酵糖类，并进一步用发酵微生物在适合的发酵条件下发酵可发酵糖类以获得醇。在一些实施方案中，糖化和发酵步骤是同时的。在一些实施方案中，所述醇是乙醇。在特定方面，本发明涉及从淀粉产生醇的方法，其包括步骤：(a)将淀粉与水和稀釜馏物混合获得浆液，(b)用肌醇六磷酸酶处理浆液，(c)液化淀粉，(d)加入α淀粉酶，(e)糖化液化的淀粉以获得可发酵糖类，和(f)用发酵微生物发酵可发酵糖类以获得醇，其中在任意步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中未进行pH调节。
附图简述
图1表明方法步骤中无pH调节的乙醇产生方法中的实施方案的方法流程图。
图2显示肌醇六磷酸酶处理全研磨玉米对SPEZYME XTRA的耐热性和低pH稳定性增加中的影响。
图3显示在全研磨玉米的初级液化中加入肌醇六磷酸酶对喷射烹饪(cook)后粘度降低的影响。
图4显示DDGS中硫酸和肌醇六磷酸含量的比较：1)来自常规方法，和2)来自无pH调节的方法。灰线为常规方法。黑线为来自无pH调节的方法的DDGS，参见实施例4。
发明详述
定义
除非本文另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的常规理解相同的含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley and Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)向技术人员提供了许多本文所用术语的一般含义。然而，为了清楚和便于参考，下文定义了某些术语。
虽然在实施或测试本发明中可以使用类似或等同于本文所述的方法和物质的任意方法和物质，但描述了优选的方法和物质。
现仅用以下定义和实施例以参考的方式详述本发明。本文提及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有序列明确引用作为参考。
“α淀粉酶”是α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)，其是切割或水解淀粉(如支链淀粉或直链淀粉聚合物)内部α-1，4-糖苷键的酶。
“液化(Liquefaction)”或“液化(liquefy)”指淀粉通过其转化为更短链和更低粘度的糊精的方法。
“糊精”是葡萄糖的短链聚合物(例如2-10个单位)。
术语“淀粉”指包含植物复合多糖糖类(carbohydrates)的任意物质，其包含具有化合式(C6H10O5)x(其中X可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。
短语“其中未调节pH”或“无pH调节”指在从碾碎的含淀粉物质产生可发酵糖类和/或醇的方法的任意步骤中未加入其他的酸性或碱性化合物来调节pH。
术语“颗粒淀粉”指生淀粉，即未遭受胶凝温度的淀粉。
术语“糖化酶”和“葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)”在本文中可互换使用，指可催化D-葡萄糖从淀粉和相关寡糖类和多糖类的非还原端释放的任意酶。
术语“寡糖类”指具有以糖苷键连接的2-10个单糖单位的任意化合物。这些简单糖类的短链聚合物包含糊精。
术语“可发酵糖”指可在酶转化至终产物(例如乙醇)中为微生物所利用的诸如单糖类和二糖类(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖)的简单糖类。
术语“DE”或“葡萄糖当量”是测量总还原糖类浓度的工业标准，以干重为基础计算为D-葡萄糖。未水解的颗粒淀粉具有基本为0的DE，D-葡萄糖具有100的DE。
术语“总糖含量”指存在于淀粉组合物中的总糖含量。
术语“干固体(ds)”指以干重为基础的浆液的总固体百分比。
本文所用术语“碾碎的”指通过例如研磨、挤压、分级分离或颗粒尺寸减小的任意其他手段使尺寸减小的含淀粉物质。碾磨法包括干磨法和湿磨法。“干磨法”指全干谷粒的碾碎法。“湿磨法”指谷粒先在水中浸湿(浸渍)以软化谷粒的方法。
术语“胶凝(作用)”指淀粉分子的溶解作用(solubilization，一般通过烹饪)形成黏性悬液。
术语“胶凝温度”指含淀粉底物开始胶凝作用的最低温度。胶凝的精确温度取决于具体的淀粉，取决于诸如植物物种和环境和生长条件因素。
术语“低于胶凝温度”指低于胶凝温度的温度。
术语“浆液”指包含不溶固体(例如颗粒淀粉)的水性混合物。
术语“发酵”指通过微生物酶促和厌氧降解有机物来产生更简单的有机化合物。虽然发酵发生于厌氧条件下，但此术语并非旨在仅限于严格的厌氧条件，因为在氧气存在下也发生发酵。
短语“同时糖化和发酵(SSF)”指终产物产生中的方法，其中将发酵微生物(如产乙醇微生物)和至少一种酶(如糖化酶)组合于同一容器的同一方法步骤中。
术语“稀釜馏物”指从固体分开的釜馏物的液体部分(例如通过筛分或离心)，其含有悬浮微粒和溶解物质。
术语“逆流(backset)”用来指再循环的稀釜馏物。
术语“酒糟(Distiller’s feeds)”指谷物谷粒的发酵副产物，包含具有可容物的干酒糟(DDGS)和/或干酒糟(Distillers dried grain，DDG)。
术语“终产物”指经酶转化自可发酵底物的任意碳源衍生的产物。在一些优选实施方案中，终产物是醇(例如乙醇)。
术语“衍生自”包含术语“源自”、“获得”或“可获得自”和“分离自”，如本文所用，在一些实施方案中指由核苷酸序列编码的多肽产生自该核苷酸天然存在于其中或该核苷酸已被***其中的细胞。
如本文所用，术语“发酵微生物”指任意微生物或细胞，其适合用于直接或间接产生终产物的发酵。
如本文所用，术语“回收”、“分离”和“分开”指从至少一种其天然结合的成分移出蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，使用常规的氨基酸残基的单字母和三字母密码。所定义的氨基酸的三字母密码与IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature(JCBN)一致。应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一条以上核苷酸序列编码。
如本文所用，术语“肌醇六磷酸酶”指能够催化磷酸(包含肌醇六磷酸)的酯类水解并释放无机磷酸和肌醇的酶。在一些实施方案中，除肌醇六磷酸外，肌醇六磷酸酶还能够水解具有中度磷酸化的肌醇-磷酸类中的至少一种。
术语“耐热性”和“热稳定性”可互换使用，指热稳定性。
术语“pH稳定性”指酶在给定pH处的稳定性。
短语“肌醇六磷酸抑制”指高水平的肌醇六磷酸引起的α淀粉酶活性损失。“IP6”定义为含有六个磷酸基团的肌醇。IP6常与多种量的各具有1-5个磷酸基团的衍生物(IP5-IP1)共存。
虽然在实施或测试本发明中可用与本文所述方法和物质类似或等同的方法和物质，但现在描述示例性的和优选的方法和物质。本文所述所有出版物在此引用作为参考，以公开和描述与所述出版物所被引用相联系的方法和/或物质。
应注意，如本文和所附权利要求中所用，除非文中清楚地另作指定，单数形式“一个”、“所述”和“该”包含复数指示物。因此，例如，提到“一个细胞”包含提到一个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等同物等等。
当给出数值的范围时，应当理解，每个在该范围的上限和下限之间的居间值(除文中清楚地另作说明外，直至下限单位的第十个)也是明确公开的。在规定范围内的任意规定值或居间值之间的每个较小范围和在该规定范围内的任意其他规定值或居间值也包含于本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含或排除于该范围，并且取决于该规定范围内的任意明确排除的极限，其中两个极限之一包含于较小范围内、两个极限都不包含于较小范围内或两个极限都包含于较小范围内的每个范围也包含于本发明中。在规定的范围包含一个或两个极限时，排除那些所包含的极限之一或二者的范围也包含于本发明中。
术语的其他定义可以在整篇说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解本发明不限制于所描述的具体实施方案，当然，此类实施方案也可以变化。
提供本文所讨论的出版物仅是为了其在本申请提交日期之前的公开内容。本文的任何内容不应解释为认可本发明没有资格由于现有发明而先于这类出版物。
含淀粉物质
用于本发明的含淀粉物质包含任意含淀粉物质。优选的含淀粉物质可获得自小麦、玉米、黑麦、高粱(蜀黍)、大米、小米、大麦、小黑麦、木薯(木薯淀粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和如大豆和豌豆的豆类。优选的物质包含玉米、大麦、小麦、大米、蜀黍和其组合。植物物质可包含杂交品种和遗传修饰品种(如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任意部分均可用作含淀粉物质，包含但不限于如叶、茎、豆荚(hull)、外壳(husk)、块茎、玉米穗轴、谷粒等的植物部分。在一些实施方案中，可使用基本整株植物，例如可使用整株玉米秸秆。在一些实施方案中，可使用全谷粒作为含淀粉物质。优选的全谷粒包含玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱和其组合。在其他实施方案中，含淀粉物质可获得自分级分离的包含纤维、胚乳和/或胚原基的谷物谷粒。分级分离植物(如玉米和小麦)物质的方法为本领域已知。在一些实施方案中，可将获得自不同来源的含淀粉物质混合，以获得用于本发明方法的物质(例如玉米和蜀黍，或玉米和大麦)。
碾碎含淀粉物质
在一些实施方案中，可通过如碾磨的手段制备含淀粉物质。两种一般的碾磨法包括湿磨法或干磨法。在干磨法中，例如碾磨全谷粒并用于所述方法。在湿磨法中，将谷粒分开(例如将胚原基从粉中分开)。具体而言，碾碎全谷物谷粒的手段是公知的，且包含锤磨机和扎制机的使用。碾碎的方法为本领域公知并可参见The Alcohol Textbook：A Reference for theBeverage，Fuel and Industrial Alcohol Industries第三版，K.A.Jacques等编辑，(1999)Nottingham University印制，见第2和第4章。在一些实施方案中，方法中使用的碾碎的谷粒具有这样的颗粒尺寸，使得超过50％的物质可穿过0.5mm筛目的筛子，在一些实施方案中超过70％的物质可穿过0.5mm筛目的筛子(见如WO2004/081193)。
制备含淀粉物质的浆液
碾碎的含淀粉物质与水和再循环稀釜馏物组合，产生水性浆液。浆液将包含15％-55％ds w/w(例如20％-50％、25％-50％、25％-45、25％-40％和20％-35％ds)。在一些实施方案中，再循环稀釜馏物(逆流)在10％-70％v/v的范围内(例如10％-60％、10％-50％、10％-40％、10％-30％、10％-20％、20％-60％、20％-50％、20％-40％以及20％-30％)。
一旦碾碎的含淀粉物质与水和逆流组合，不调节浆液中的pH。此外，向浆液加入肌醇六磷酸酶和可选地α淀粉酶后不调节pH。在优选实施方案中，浆液的pH在pH 4.5至低于6.0的范围内(例如pH 4.5-5.8、pH4.5-5.6、pH 4.8-5.8、pH 5.0-5.8、pH 5.0-5.4和pH 5.2-5.5)。依据加入浆液的稀釜馏物的量和包含所述稀釜馏物的物质类型，浆液的pH可以在pH4.5-5.2之间。例如，稀釜馏物的pH可以在pH 3.8和pH 4.5之间。作为另一个实例，以下的表1表明随着向全研磨玉米浆液(32％ds)加入递增量的稀釜馏物，在68.3℃搅拌两小时后pH发生的变化。
表1：
  稀釜馏物w/w％   最终pH
  0   5.52
  20   5.29
  40   5.16
  50   5.09
  60   5.05
  80   4.98
  100   4.94
应提到，在乙醇产生中，可加入酸来降低发酵池中的pH，以降低蒸馏前微生物污染的风险。
在一些实施方案中，向浆液加入肌醇六磷酸酶。在其他实施方案中，除肌醇六磷酸酶外，还将向浆液加入α淀粉酶。在一些实施方案中，顺次向浆液加入肌醇六磷酸酶和α淀粉酶，而在其他实施方案中同时加入肌醇六磷酸酶和α淀粉酶。在一些实施方案中，将包含肌醇六磷酸酶和可选地α淀粉酶的浆液孵育(预处理)5分钟-8小时(例如5分钟-6小时、5分钟-4小时、5分钟-2小时和15分钟-4小时)。在其他实施方案中，在40-115℃范围内的温度孵育浆液(例如45-80℃，、50-70℃、50-75℃、60-110℃、60-95℃、70-110℃和70-85℃)。
在其他实施方案中，在低于含淀粉物质的淀粉胶凝温度0-30℃(例如0-25℃、0-20℃、0-15℃、0-10℃和0-5℃)的温度孵育浆液。在一些实施方案中，该温度低于68℃、低于65℃、低于62℃、低于60℃和低于55℃。在一些实施方案中，温度高于45℃、高于50℃、高于55℃和高于60℃。在一些实施方案中，包含肌醇六磷酸酶和α淀粉酶的浆液在低于淀粉胶凝温度的温度孵育称为初级(1°)液化。
在一个实施方案中，碾碎的含淀粉物质是玉米或蜀黍。浆液含25-40％ds，pH在4.8-5.2范围内，且浆液在60-75℃温度范围与肌醇六磷酸酶和可选地α淀粉酶孵育5分钟-2小时。
目前，认为液化方法中使用的商品化可获得的微生物α淀粉酶并不足够稳定至在高于80℃的温度、在低于pH 5.6的pH水平，从使用全研磨谷粒的干磨方法产生液化的淀粉底物。许多商品化可获得的α淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降低。
在进一步的液化步骤中，经孵育或预处理的含淀粉物质在约4.0-5.5的pH下，暴露于如高于含淀粉物质的淀粉胶凝温度诸如0-45℃的提高的温度(例如70℃-120℃、70℃-110℃和70℃-90℃)2分钟-6小时的时间，更优选1小时-2小时之间。可通过常规高温喷射烹饪***短暂作用例如1-15分钟提高温度。然后可在75℃-95℃的温度(例如80℃-90℃和80℃-85C)孵育15-150分钟(例如30-120分钟)进一步水解淀粉。在优选实施方案中，在这些方法步骤中不调节pH，液化醪液(mash)的pH在pH 4.0-pH 5.8范围内(例如pH 4.5-5.8、pH 4.8-5.4和pH 5.0-5.2)。在一些实施方案中，向二级液化步骤加入第二剂量的耐热α淀粉酶，但在其他实施方案中，不会有其他的α淀粉酶剂量。
本发明的孵育和液化步骤之后可以接着本领域公知的糖化和发酵步骤。
糖化和发酵
液化的含淀粉物质在如葡糖淀粉酶的糖化酶存在下糖化。糖化方法可持续12小时-120小时(例如12-90小时、12-60小时和12-48小时)。但是，常在30-65℃温度范围内且通常约60℃下进行预糖化步骤约30分钟-2小时(例如30-90分钟)，随后在称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵中完全糖化。
可发酵糖类(例如糊精、单糖，尤其是葡萄糖)产生自酶促糖化。可发酵糖类可以进一步纯化和/或转化为有用的糖产物。此外，糖类可以用作产生如醇(例如乙醇和丁醇)、有机酸类(例如琥珀酸和乳酸)、糖醇类(例如甘油)、抗坏血酸中间产品类(例如葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2，5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)、氨基酸类(例如赖氨酸)、蛋白质(例如抗体及其片段)的终产物的微生物发酵方法中的发酵原料。
在优选实施方案中，用液化方法步骤中获得的可发酵糖类产生醇，尤其是乙醇。在乙醇产生中，常使用SSF方法，其中糖化酶和发酵生物(例如酵母)一起加入，然后在30℃-40℃的温度进行。
发酵中使用的生物取决于想得到的终产物。通常，若想得到的终产物是乙醇，则用酵母作为发酵生物。在一些优选实施方案中，产乙醇的微生物是酵母，具体而言是酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(USP 4,316,956)。多种酿酒酵母是商品化可获得的，这些酿酒酵母包含但不限于FALI(Fleischmann’s Yeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSM Specialties)、RED STAR(Lesaffre)和Angel alcohol yeast(Angel Yeast Company，中国)。该方法中使用的起始酵母量是在适当时间内有效产生商业上可观量的乙醇的量(例如在不到72小时内从具有25-40％DS的底物产生至少10％乙醇)。一般按每毫升发酵液104-1012个、优选107-1010个活酵母计数的量供给酵母细胞。除发酵微生物(例如酵母)外，发酵还包含养分，可选地包含其他的酶，包含但不限于肌醇六磷酸酶。酵母在发酵中的用途众所周知，参见The Alcohol Textbook，K.Jacques等编辑，1999，Nottingham University Press，UK。
在进一步的实施方案中，通过按本领域已知使用适合的发酵微生物，发酵终产物可非限制性地包含甘油、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2，5--二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地，当想得到的终产物是乳酸时，可以使用乳杆菌属(Lactobacillussp.)(干酪乳杆菌(L.casei))作为发酵微生物；当想得到的终产物是甘油或1，3-丙二醇时，可以使用大肠杆菌(E.coli)作为发酵微生物；当想得到的终产物是2-酮-D-葡糖酸、2，5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸时，可以用柠檬泛菌(Pantoea citrea)作为发酵微生物。以上所列只是实例，本领域技术人员会意识到许多适合用来获得想得到的终产物的发酵微生物。
回收
可选地，可以通过例如蒸馏后可选地接着一个或多个方法步骤来提取醇(例如乙醇)。
在一些实施方案中，通过本发明所包含的方法产生乙醇的产率为至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％和至少18％(v/v)和至少23％(v/v)。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇。
在进一步的实施方案中，终产物可包含发酵副产物，如干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)，其例如可以用作动物饲料。
方法步骤中使用的酶类肌醇六磷酸酶类-
对本发明有用的肌醇六磷酸酶包含能够在所定义的孵育和液化步骤的条件下水解肌醇六磷酸的酶。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate)(肌醇六磷酸(phytic acid))释放至少一个无机磷酸。可根据其对肌醇六磷酸分子上起始水解作用的磷酸酯基团的具***置的偏好来分组肌醇六磷酸酶(例如分为3-肌醇六磷酸酶类(EC3.1.3.8)或分为6-肌醇六磷酸酶类(EC 3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的典型实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。
肌醇六磷酸酶可以获得自如真菌生物和细菌生物的微生物。这些微生物的一些包含例如曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(Talaromyces)(嗜热踝节菌(T.thermophilus))、木霉属(Trichoderma)(里氏木霉(T.reesei))和嗜热真菌属(Thermomyces)(WO 99/49740)。肌醇六磷酸酶还可获自青霉属(Penicillium)物种，例如P.hordei(ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)。见例如USP 6,475,762。此外，肌醇六磷酸酶可获得自芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、枹蕈属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、Enterbacter和Buttiauxiella(见WO2006/043178)。
可获得商品化肌醇六磷酸酶，如NATUPHOS(BASF)、RONOZYMEP(Novozymes A/S)、PHZYME(Danisco A/S，Diversa)和FINASE(ABEnzymes)。Engelen等(1994)J.of AOAC International，77：760-764发表了测定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义。肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶、其变体或片段。
在一个实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶是衍生自细菌Buttiauxiella spp.的肌醇六磷酸酶。Buttiauxiella spp.包含B.agrestis、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。Buttiauxiella物种的菌株获得自DSMZ，德国生物材料保藏中心(the German National Resource Center for Biological Material，Inhoffenstrabe 7B，38124 Braunschweig，德国)。以保藏号NCIMB 41248保藏的Buttiauxiella sp.菌株P1-29是尤其有用的菌株实例，可从其获得肌醇六磷酸酶并根据本发明使用。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶是BP-野生型、其是公开于WO 06/043178中的变体(如BP-11)或如2007年3月6日提交的美国专利申请11/714,487(公开为US 2008-0220498)中所公开的变体。例如，BP-野生型和其变体公开于WO 06/043178的表1中，其中编号参考已公开的PCT申请的SEQ ID NO：3。
在一个优选实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶是与表2所示的SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的肌醇六磷酸酶。更优选地，该肌醇六磷酸酶与SEQ ID NO：1给出的氨基酸序列或其变体具有至少95％-99％的序列同一性。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶包含或由SEQID NO：1的氨基酸序列组成。
表2：Buttiauxiella BP-17肌醇六磷酸酶的成熟蛋白质序列(SEQ IDNO：1)
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL
KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ
在一些实施方案中，用于孵育和/或液化方法的肌醇六磷酸酶的量(剂量)在约0.001-50FTU/g ds的范围内(例如在约0.01-25FTU/g ds、约0.01-15FTU/g ds、约0.01-10FTU/g ds、约0.05-15FTU/g ds和约0.05-5.0FTU/g的范围内)。
α淀粉酶类-
在一些优选实施方案中，α淀粉酶是酸稳定的α淀粉酶，当以有效量加入时，其在3.0-7.0，优选3.5-6.5的pH范围内具有活性。用于本发明的α淀粉酶可以是真菌α淀粉酶或细菌α淀粉酶。此外，α淀粉酶可以是野生型α淀粉酶、其变体或片段或杂交α淀粉酶，杂交α淀粉酶衍生自例如来自一种微生物来源的催化结构域，来自另一种微生物来源的淀粉结合结构域。
在一些实施方案中，本发明的方法尤其用于使用在高温(例如高于85℃或高于80℃)下，pH低于5.6时不稳定的α淀粉酶。
真菌α淀粉酶的实例包含获得自丝状真菌菌株的α淀粉酶，丝状真菌菌株包含但不限于曲霉属物种(例如黑曲霉、A.kawachi和米曲霉(A.oryzae))、木霉属物种、根霉属物种(Rhizopus sp.)、毛霉属物种(Mucorsp.)和青霉属物种的菌株。
细菌α淀粉酶的实例包含获得自包含但不限于以下菌株的细菌菌株的α淀粉酶：芽孢杆菌属，如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)。具体地，是衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。本发明的方法中优选使用的细菌α淀粉酶之一包含描述于USP 5,093,257、USP5,763,385、USP 5,824,532、USP 5,958,739、USP 6,008,026、USP 6,093,563、USP 6,187,576、USP 6,361,809、USP 6,867,031、US 2006/0014265、WO96/23874、WO 96/39528、WO 97/141213、WO 99/19467和WO 05/001064中的α淀粉酶之一。
考虑用于本发明所包含的方法的商品化可获得的α淀粉酶组合物包含：SPEZYMETM AA、SPEZYMETM FRED、SPZYMETM XTRA、GZYMETM 997和CLARASETM L(Danisco US Inc，Genencor Division)；TERMAMYLTM 120-L、LC和SC和SUPRA(Novozymes Biotech)；LIQUOZYMETM X、LIQUE ZYME SC和SAN TMSUPER(NovozymesA/S)和Fuelzyme TM LF(Diversa)。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的α淀粉酶的量是本领域技术人员公知的α淀粉酶的有效量，例如0.1-50AAU/gds(例如0.1-25AAU/gds、0.5-15AAU/gds，且优选1.0-10AAU/gds)。
用于本发明所包含的方法中的酶组合物可以是包含任意肌醇六磷酸酶和α淀粉酶，尤其是耐热α淀粉酶的混合的或配制的酶组合物。
在一些实施方案中，α淀粉酶包含衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶，如SPEZYME TMAA、SPEZYMETM FRED或SPEZYMETM XTRA。
在一些实施方案中，有用的酶组合物包含BP-WT或BP-17、SPEZYMETM XTRA和可选地SPEZYMETM FRED。在某些实施方案中，肌醇六磷酸酶可以与如ERMAMYLTM SC或SUPRA和Liquozyme SC的α淀粉酶组合。
在一些实施方案中，当在本发明的方法步骤中使用肌醇六磷酸酶组合物和α淀粉酶组合物时，肌醇六磷酸酶(FTU/g ds)与α淀粉酶(AAU/g ds)的比例是约15∶1-1∶15。在其他实施方案中，肌醇六磷酸酶与α淀粉酶的比例是约10∶1-1∶10，以及5∶1-1∶5、3∶1-1∶3、2∶1-1∶2和3∶1-1∶2。
在混合制剂中包含肌醇六磷酸酶和α淀粉酶，或包含这两种酶之一的酶组合物包含淀粉转化组合物，例如MAXALI TM One(Danisco US Inc，Genencor Division)。
在一些非限制性实施方案中，酶混合物或组合物包含：a)与SEQ IDNO：1具有至少95％、或至少97％或至少99％序列同一性的BP-17肌醇六磷酸酶，以及耐热的细菌α淀粉酶；b)大肠杆菌肌醇六磷酸酶(例如PHYZYME XP)和酸稳定的α淀粉酶；和c)黑曲霉肌醇六磷酸酶和耐热的细菌α淀粉酶。
因为在孵育步骤中与加入α淀粉酶同时或顺次加入肌醇六磷酸酶导致α淀粉酶在更低pH下的耐热性和/或pH稳定性提高，所以就动物饲料而言，本发明的方法步骤赋予了附加值。众所周知，其他的肌醇六磷酸、肌醇六-磷酸(myo-inositol hexakis-phosphate)(谷物/谷粒和含油种子中磷酸的主要贮存形式)仅为单胃动物(例如家禽和猪)部分利用，因此其是饲料制剂中不希望的谷粒或谷物成分。还已知肌醇六磷酸结合必需矿物质(如锌、铁、钙、镁)和蛋白质，导致生物利用率降低，另外已显示肌醇六磷酸和其他肌醇磷酸酯类对淀粉的水解作用表现α淀粉酶抑制效应。结果，微生物肌醇六磷酸酶在许多饲料制剂中的用途建立已久(例如来自Danisco US Inc，Genencor Division的PhyzymeTM XP 5000、来自ABEnzymes的FinaseTM、来自Godo Shusei日本的GODO PHYTM、来自Altech的AllzymeTM Phytase、来自BASF的NatuphosTM和来自DSM/Novozyme的RonozymeTM P)。然而，通过在本发明的方法步骤中纳入肌醇六磷酸酶，诸如DDGS的副产物具有提高的价值。
糖化酶类
用葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3.)作为糖化酶，这些酶可以衍生自细菌、植物和真菌来源的异源性或内源性蛋白质表达。用于本发明的组合物和方法中的优选葡糖淀粉酶由丝状真菌和酵母的几种菌株产生。具体而言，从曲霉属和木霉属菌株分泌的葡糖淀粉酶是商业上重要的。
适合的葡糖淀粉酶包含天然存在的野生型葡糖淀粉酶，以及变体和遗传改造突变体葡糖淀粉酶(例如杂交葡糖淀粉酶)。
葡糖淀粉酶还获得自曲霉属菌株(黑曲霉，见Boel等，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381和USP 6,352,851；米曲霉，见Hata等，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949；和A.shirousami)见Chen等，(1996)Prot.Eng.9：499-505)；踝节菌属菌株，如产生自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜热踝节菌(T.thermophilus)的葡糖淀粉酶(WO 99/28488；USP No.RE：32，153；USP No.4,587,215)；木霉属菌株，如里氏木霉，尤其是与美国专利号7,413,887中公开的SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属菌株，如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属菌株；和腐质霉属(Humicola)菌株，如灰色腐质霉(H.grisea)(见Boel等，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO92/00381；WO 00/04136；Chen等，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等，(1978)Carbohydrate Res.61：301-308；USP.4,514,496；USP 4,092,434；USP 4,618,579；Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223和WO2005/052148的SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶与WO05/052148的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性。用于本发明的其他葡糖淀粉酶包含获得自Athelia rolfsii的葡糖淀粉酶及其变体(WO 04/111218)。
商业上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶产生自例如黑曲霉(商品名DISTILLASE，OPTIDEX L-400和G ZYME G9904X，来自Danisco US，Inc，Genencor Division)或根霉属物种(商品名CU.CONC，来自Shin NihonChemicals，日本)。还有商品化的消化酶，商品名GLUCZYME，来自Amano Pharmaceuticals，日本(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98：663-671)。其他酶包含根霉属物种的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的三种形式，即“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW61,400)。酶制剂GC480(Danisco US，Inc，Genencor Division)也用于本发明。上述葡糖淀粉酶和商品化的酶并非旨在限制本发明，而仅是作为实例提供。
二级酶类-
尽管本发明的一些实施方案包含α淀粉酶和肌醇六磷酸酶以及葡糖淀粉酶的酶组合物或混合物的用途，但可以可选地在方法步骤中使用其他酶类。例如，在液化中有用的其他酶非限制性地包含：纤维素酶类、半纤维素酶类、木聚糖酶类、蛋白酶类、肌醇六磷酸酶类、支链淀粉酶类、β淀粉酶类、脂肪酶类、角质酶类、果胶酶类、β-葡聚糖酶类、半乳糖苷酶类、酯酶类、环糊精转糖基酶类(CGTase)、β-淀粉酶类及其组合。
在一些实施方案中，其他的酶是第二种α淀粉酶，如细菌或真菌的α淀粉酶，在其他实施方案中，α淀粉酶是真菌或细菌α淀粉酶的衍生物、突变体或变体。用于方法中的其他的α淀粉酶的非限制性实例包含上文列举的α淀粉酶，其包含衍生自芽孢杆菌属、曲霉属、木霉属、根霉属、镰孢菌属(Fusarium)、青霉属、脉孢霉属(Neurospora)和腐质霉属的α淀粉酶。
一些优选的其他的α淀粉酶衍生自芽孢杆菌属，包含地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及其杂种、突变体和变体(USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP5,958,739；USP 6,008,026和USP 6,361,809)。这些淀粉酶中的一些是商品化可获得的，例如可从Novo Nordisk A/S获得TERMAMYL和SUPRA；从Diversa获得ULTRATHIN；从Novo Nordisk A/S获得LIQUEZYMESC；和从Danisco US，Inc，Genencor Division获得SPEZYME FRED、SPEZYME XTRA和GZYME G997。
在其他实施方案中，本发明可包含加入第二种肌醇六磷酸酶，其可以与孵育步骤中所用的肌醇六磷酸酶相同或不同。可以使用本文关于肌醇六磷酸酶的部分中讨论的任意肌醇六磷酸酶。
纤维素酶类也可以与α淀粉酶和葡糖淀粉酶混合。纤维素酶类是水解纤维素(β-1，4-D-葡聚糖键)和/或其衍生物(如磷酸膨胀纤维素)的酶组合物。纤维素酶类包含外切纤维二糖水解酶类(CBH)、内切葡聚糖酶类(EG)和β-葡糖苷酶类(BG)(EC3.2.191、EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)的分类。纤维素酶类的实例包含来自青霉属、木霉属、腐质霉属、镰孢霉属、热温单孢菌属(Thermomonospora)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)和曲霉属的纤维素酶。市售用于饲料应用的商品化可获得的纤维素酶是β-葡糖苷酶类，如ROVABIO(Adisseo)、NATUGRAIN(BASF)、MULTIFECT BGL(Danisco US，Inc，Genencor Division)和ECONASE(AB Enzymes)。
木聚糖酶类也可以包含于方法步骤中。水解木聚糖主链的木聚糖酶类(例如内切-β-木聚糖酶类(E.C.3.2.1.8))可以来自细菌来源，如芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属、热酸菌属(Acidothermus)、小四孢菌属(Microtetrapsora)或嗜热温单孢菌属(Thermonospora)。此外，木聚糖酶类可以来自真菌来源，如曲霉属、木霉属、脉孢霉属、腐质霉属、青霉属和镰霉属。(见例如EP473 545；USP 5,612,055；WO 92/06209；和WO 97/20920)。商品化制剂包含MULTIFECT和FEEDTREAT Y5(Danisco US，Inc，Genencor Division)、RONOZYME WX(NovozymesA/S)和NATUGRAIN WHEAT(BASF)。
蛋白酶类也可包含于方法步骤中。蛋白酶类可以衍生自芽孢杆菌属，如解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。这些来源包含枯草杆菌蛋白酶，如获得自解淀粉芽孢杆菌及其突变体的枯草杆菌蛋白酶(USP 4,760,025)。适合的商品化蛋白酶包含ULTIFECT P 3000(Danisco US，Inc.，Genencor Division)和SUMIZYME FP(Shin Nihon)。蛋白酶类还衍生自真菌来源，如木霉属、曲霉属、腐质霉属和青霉属。在一些优选实施方案中，酸性真菌蛋白酶也可包含于方法步骤中，例如获得自曲霉属、木霉属、毛霉属和根霉属的酸性真菌蛋白酶。在一个实施方案中，酸性真菌蛋白酶是如公开于WO 06/073839中的酸性真菌蛋白酶。
实验
在以下实施例中进一步详述本发明，这些实施例不以任何方式旨在限制本发明的范围。所附图意在被认为是本发明说明和描述的整体部分。引用的所有参考文献在此明确引用作为本文所述所有内容的参考。提供以下实施例来说明而不是限制本发明。
在下面的公开内容和实验部分，使用以下缩写：wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量对体积)；W/W(重量对重量)；V/V(体积对体积)；IKA(IKA Works Inc.2635 North Chase Parkway SE，Wilmington，NC)；Genencor(Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA)；Ncm(牛顿厘米(Newton centimeter))和ETOH(乙醇)；eq(等同物)；N(正常)；ds或DS(干固体含量)；SAPU(分光光度计测量的酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在测定条件下每分钟从酪蛋白底物释放1微摩尔酪氨酸的酶活性蛋白酶量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，其定义为在pH 4.2和60℃下，每小时从可溶淀粉底物产生1g按葡萄糖计算的还原糖的酶量)。
方法
粘度测量：用玻璃蒸煮器(cooker)-粘度计LR-2.ST***IKA测定粘度。简要地，粘度计由具有锚定混合器的2000ml双壁玻璃容器组成，混合器由Eurostar Labortechnik功率控制-粘度计搅拌(Viscoklick粘度计的粘度范围是0-600Ncm)。一般，对本文所述实施例，将包含含淀粉物质和适量酶的浆液倒入粘度计容器。在加热至85℃的过程中记录温度和粘度，并继续孵育其他的60-120分钟。相隔一段时间记录测量为Ncm的粘度。
在本文的一些实施例中使用的肌醇六磷酸酶是本文显示为SEQ IDNO：1的Buttiauxiella肌醇六磷酸酶BP-17(也见2007年3月6日提交的美国专利申请11/714,487，其引用作为参考)。
通过高压液相层析(HPLC)进行糖类分析：用装配HPLC柱(Rezex8u8％H，单糖类)、维持于50℃、安装折射率(RI)检测器(ERC-7515A，RI Detector(Anspec Company Inc.))的Beckman System Gold 32 Karat(Fullerton，CA)，通过HPLC测量寡糖类反应产物的组成。根据分子量分开糖类。标记DP1为单糖，如葡萄糖；标记DP2为双糖，如麦芽糖；标记DP3为三糖，如麦芽三塘；以及标记“DP4+”为具有4或更高聚合度(DP)的寡糖。
通过无机磷酸的释放来测量肌醇六磷酸酶活性(FTU)。无机磷酸与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色复合物，在分光光度计中于415nm波长处测量黄色复合物，用磷酸标准曲线定量释放的无机磷酸。1单位肌醇六磷酸酶(FTU)是在欧洲标准(CEN/TC327，2005-TC327WI 003270XX)中给定的反应条件下，每分钟从肌醇六磷酸释放1微摩尔无机磷酸的酶量。
肌醇六磷酸含量：通过调节5％浆液(若为干样品)的pH至pH 10从样品中提取，然后用离子交换柱通过HPLC法测定肌醇六磷酸。用NaOH梯度***(用于HPLC来源的Mike Pepsin)从柱上洗脱肌醇六磷酸。然后通过与肌醇六磷酸标准品比较来计算液体中的肌醇六磷酸含量。
按分光光度计测量的碘染色能力降低的速率所反映，通过淀粉水解速率测定α淀粉酶活性(AAU)。1AAU细菌α-淀粉酶活性是在标准化条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶量。
也可通过酶样品的整份试样在pH 4.5、50℃下，根据可溶马铃薯淀粉底物(4％DS)的水解程度，将α-淀粉酶活性测量为可溶淀粉单位(SSU)。用Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所述的DNS法测量还原糖含量。
用PNPG测定法测定葡糖淀粉酶活性单位(GAU)。PNPG测定法基于葡糖淀粉酶催化p-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG)水解为葡萄糖和对-硝基苯酚的能力。在碱性pH下，硝基苯酚形成黄色，用分光光度计在400nm处测量用于GAU的计算。1葡糖淀粉酶单位是在该测定法的特定条件下，每小时从可溶淀粉底物释放1g按葡萄糖计算的还原糖的酶量。
实施例1：去除肌醇六磷酸抑制对α淀粉酶耐热性的影响
在本实施例中研究了去除肌醇六磷酸抑制对提高用于液化耐热α淀粉酶的耐热性的影响。
将全研磨玉米浆液(获得自Badger State Ethanol，Monroe，WI)与含50％v/v稀釜馏物的水混合至终浓度为约32％ds。在套锅中制备玉米固体。充分混合浆液，并用碳酸钠或氢氧化钠调节浆液pH至pH 5.8，该pH是商品化乙醇方法的液化的典型pH。在套锅中混合浆液，并升温至65-70℃的预处理温度。即将达到70℃前，加入液化酶SPEZYMETM Xtra(每克干固体玉米10AAU)或来自嗜热脂肪芽孢杆菌的经遗传修饰的α淀粉酶(SPEZYMETM Ethyl，来自Danisco US Inc，Genencor Division)，并启动计时器，开始孵育或初级液化步骤。使浆液在这些酶的存在下，加入或不加入肌醇六磷酸酶(每克干固体玉米12FTU)孵育40分钟。然后使经孵育的浆液穿过用蒸汽和水预热至所需温度的喷射蒸煮器(82-107℃)。以约4升/分钟的最大速度(1.5设置)将浆液送过喷嘴。使用保持线圈(holdcoil)的前三个回路产生刚刚超过3分钟的停留时间。全部水被置换且所需温度保持稳定后，收集溶解的玉米醪液(corn mash)的整份试样并在85℃置于第二浴(塔顶搅拌(overhead stirring))，开始二级液化步骤(2°液化)。在0、30、60和90分钟时取样，以测试粘度(通过Brookfield)、白利糖度和DE(通过Schoorls)。结果总结于表3中。
表3：
Figure BPA00001190415900221
在孵育过程(初级液化)中加入BP-17肌醇六磷酸酶将全研磨玉米的肌醇六磷酸含量从0.60％ds玉米降低至0.09％ds玉米(＞85％的降低)。从表3中的数据还非常清楚的是，根据DE产生(development)或粘度降低，在107℃的喷射蒸煮温度下α淀粉酶失活。但是，如二级液化步骤过程中在85℃处DE增进(progression)和粘度降低所示，在喷射蒸煮前纳入肌醇六磷酸酶(据信其去除肌醇六磷酸抑制)导致α淀粉酶耐热性的显著提高。
实施例2：去除肌醇六磷酸抑制对α淀粉酶pH稳定性的影响
进一步研究了由于去除α淀粉酶的肌醇六磷酸抑制使α淀粉酶的耐热性提高。用肌醇六磷酸酶在全研磨玉米的二级液化之前水解肌醇六磷酸，并检测在低pH下pH稳定性的改进。
在典型实验中，通过使用50∶50比例的水和稀釜馏物使全研磨玉米成浆液至32％(ds玉米)。测量浆液pH，发现其为pH 5.15。在套锅中用水和蒸汽将浆液加热至70℃。加入液化酶SPEZYME Xtra和BP-17，并通过在70℃保温40分钟预处理浆液。40分钟的预处理后，用大型中试装置喷嘴(装配M103hydro-heater)使浆液穿过维持于107℃、具有3分钟停留时间的喷射蒸煮器。从喷嘴收集液化物并置于85℃水浴。加入第二剂量的α淀粉酶完成水解作用。
不断搅拌液化物并在85℃保持90分钟。在0、30、60和90分钟时收集样品。针对白利糖度、DE(使用Schoorls法)和粘度(Brookfield粘度计，2号轴于20转/分钟)测试所有样品。还用SPEZYMETM Ethyl和BP-17进行了液化研究。DE增进和粘度数据总结于表4中。
表4显示无任何pH调节的全研磨玉米液化过程中的DE增进和粘度降低。
表4：
Figure BPA00001190415900241
表3和表4中的结果显示，如85℃时伴随液化物粘度的同时降低，DE进展的稳定提高所证明，在全研磨玉米于107℃高温喷射蒸煮前SPEZYMETM Xtra和SPEZYMETM Ethyl的肌醇六磷酸抑制的降低导致活性的低pH稳定性显著提高。数据清楚地显示，如果消除肌醇六磷酸的抑制，SPEZYMETM Xtra或SPEZYMETM Ethyl可以在pH 5.2成功用于全研磨玉米的液化方法。
实施例3：其他肌醇六磷酸酶类的使用对α淀粉酶pH稳定性的影响
还针对去除肌醇六磷酸抑制，在初级液化步骤中测试了商品化可获得的微生物肌醇六磷酸酶类，如来自Danisco的PhyzymeTM XP 5000(大肠杆菌)和来自DSM，The Netherlands的DSM Phytase L(黑曲霉)。用10AAU/gds的SPEZYMETM Xtra和12FTU/gds的肌醇六磷酸酶，按实施例1中所述进行液化试验。取液化物样品测量残留的肌醇六磷酸含量。表5显示了pH 5.2的DE增进、粘度降低和肌醇六磷酸降低。
表5显示使用全研磨玉米的无pH调节的液化过程中不同商品化可获得的肌醇六磷酸酶的比较。
表5：
Figure BPA00001190415900251
表5中的数据显示，当在全研磨玉米浆液的初级液化条件下加入时，来自大肠杆菌(PhyzymeTM XP 5000)或黑曲霉(DSM PhytaseTM L)的肌醇六磷酸酶确实与BP-17Phytase(Buttiauxiella)类似地稳定ZYMETMEthyl。
实施例4：对乙醇产生的影响
将液化物用作乙醇产生的乙醇发酵中的发酵原料。使用了初级液化步骤在pH 5.8、无肌醇六磷酸酶的来自SPEZYMETM Xtra的液化物-1(含50％稀釜馏物的32％ds玉米)。还使用了在初级液化步骤中使用SPEZYMETM Xtra、有肌醇六磷酸酶处理的来自实施例2的液化物。按常规乙醇方法，用稀释硫酸调节液化物-1的pH至4.2，而来自实施例2的液化物不进行任何进一步的pH调节即使用。将来自实施例2的液化物用作本发明方法的无pH调节测试。在每个实验中，在制备培养基前获得容器的自重。将32％DS玉米ds液化物(2升)取入2L烧瓶中。将10克酵母和1克葡萄糖加至40克水，轻轻搅拌1小时制备Red Star Ethanol Redyeast(RED STAR(Lesaffre))接种物。将5毫升每种接种物加至经平衡的发酵罐，然后按4GAU/gds玉米加入G ZymeTM 480Ethanol(Danisco USInc，Genencor Division)，以开始同时糖化和发酵。记录起始毛重，并将烧瓶置于维持于32℃的水浴中。在不同的时间间隔取样，并用HPLC分析糖类和乙醇含量。还用1千克每种液化物进行发酵，并在不同时间间隔测量发酵过程中的重量损失。根据二氧化碳损失引起的重量损失测量醇(表6)。在发酵结束时，获得最终毛重。将发酵液定量地转入5L圆底容器内。真空下进行蒸馏至在含200ml水的贮器中收集到大约800ml乙醇。将乙醇稀释至2L，并通过HPLC分析。在干燥前获得蒸馏釜底的重量和DS。对DDGS进行残留淀粉分析。根据重量损失、蒸馏和残留淀粉分析进行化学计算。
使用CO2重量损失的乙醇计算：
乙醇产量(mmol)＝CO2损失(g)/88
乙醇产量(g)＝(CO2损失(g)/88)＊92＝＞CO2损失(g)＊1.045
乙醇产量(ml)＝(CO2损失(g)/88)＊92)/0.789
              ＝＞CO2损失(g)＊1.325
表6：来自常规液化方法、来自本发明的无pH调节的方法的DDGS比较。
表6中的数据显示了常规方法和本发明的无pH调节的方法间游离硫酸和肌醇六磷酸含量方面的主要差异。孵育中耐热α淀粉酶的肌醇六磷酸抑制的去除导致DDGS具有降低的肌醇六磷酸含量、更高的游离可获得的磷酸和降低的硫酸。因此，无pH调节的方法在淀粉液化中赋予用于液化耐热α淀粉酶在低pH下的pH稳定性。
以上说明书中提到的所有出版物和专利在此引入作为参考。本领域技术人员将可理解本发明所述方法和***的多种修改和变化而不背离本发明的范围和精神。虽然已通过与具体的优选实施方案相联系描述了本发明，但是应理解，本发明不应被不适当地限制于这类具体的实施方案。事实上，对本领域技术人员显而易见的是，用于进行本发明的理想模式的多种修改也旨在包含于以下权利要求的范围内。

Claims (18)

1.加工淀粉的方法，其包括无pH调节的液化步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述液化步骤在约4.5-5.4的pH范围进行。
3.权利要求1的方法，其进一步包括无pH调节地糖化淀粉至可发酵糖类，和从可发酵糖类产生醇。
4.从淀粉产生可发酵糖的方法，其包括步骤：
(a)将淀粉与水和稀釜馏物混合以获得浆液，
(b)用肌醇六磷酸酶处理所述浆液，
(c)液化所述淀粉，
(d)加入α淀粉酶，和
(e)糖化所述液化的淀粉以获得可发酵糖类，其中在任意步骤(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中不进行pH调节。
5.权利要求4的方法，其中所述稀釜馏物在约10-70％v/v的范围内。
6.权利要求4的方法，其中所述浆液具有约20-50％w/v的干固体含量。
7.权利要求4的方法，其中在液化所述淀粉之前或同时加入肌醇六磷酸酶。
8.权利要求4的方法，其中所述肌醇六磷酸酶与Buttiauxiella BP-17肌醇六磷酸酶具有至少75％的氨基酸序列同一性。
9.权利要求4的方法，其中所述淀粉在约4.5-5.4的pH范围液化。
10.权利要求4的方法，其中在步骤(b)中和/或与淀粉液化同时加入α-淀粉酶。
11.权利要求4的方法，其进一步包括在淀粉液化过程中加入第二α-淀粉酶剂量。
12.权利要求4的方法，其进一步包括纯化和/或异构化可发酵糖类。
13.权利要求4的方法，其进一步包括在淀粉液化过程中混合纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基酶或其任意组合。
14.权利要求4的方法，其中所述淀粉来自玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱和其任意组合。
15.权利要求4的方法，其中所述淀粉来自玉米或玉米醪液。
16.从淀粉产生醇的方法，其包括步骤：
(a)将淀粉与水和稀釜馏物混合以获得浆液，
(b)用肌醇六磷酸酶处理所述浆液，
(c)液化所述淀粉，
(d)加入α-淀粉酶，
(e)糖化所述液化的淀粉以获得可发酵糖类，和
(f)用发酵微生物发酵可发酵糖类以获得醇，其中在任意步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中不进行pH调节。
17.权利要求16的方法，其中所述糖化和发酵步骤同时进行。
18.权利要求16的方法，其中所述醇是乙醇。
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