CN111551747A - 基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法 - Google Patents

基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，属于兽用生物制品领域。本发明包括使用猪塞内卡病毒病灭活疫苗对若干健康易感家兔进行免疫接种；免疫接种28d后，检测所有家兔血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价；当至少4/5的家兔个体血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价≥1:64时，判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。该方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验的替代方法，有效缩减成本，并且操作简单易行、安全便捷。

Description

基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法。
背景技术
塞内卡病毒(Seneca virus A，SVA)，是一种能引起猪水泡样症状的病毒，近年来国内外发病情况比较严重。该病毒为单股正链不分节的RNA病毒，隶属小RNA毒科Senecavirus病毒属，临床证据表明，该病毒感染猪后可使感染猪出现水泡性病变和新生仔猪死亡，症状与***极为相似。该病毒最早发现于1998年，2014年在巴西发生大规模暴发后才逐渐被人们所重视。我国于2015年3月在广东某猪场首次发生暴发疫情；随后，从2015年5月至2016年1月，广东省6个不同农场共鉴定出6个新的SVA分离株，基因进化树分析将其分为两个不同的分支；2016年3月，中国湖北省再次爆发SVA感染。到目前为止，我国广东、福建、黑龙江、湖北、河南等省均出现SVA感染的病例报道，造成养猪业严重的经济损失。
对该病的防治主要以预防为主，然而，目前我国尚无塞内卡病毒病商品化疫苗，试验苗正处于研发检验阶段。其中塞内卡病毒试验苗的效力检验主要依靠猪体进行，由于非洲猪瘟影响，猪买卖和运输受限，价格升高，而且实验猪的采购十分困难且不再安全可靠，直接导致塞内卡病毒病灭活疫苗的研发工作受阻。因此，建立一种塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验的替代方法对塞内卡病毒灭活疫苗的开发至关重要，同时可以大大节省研发费用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明提供一种基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：
1)使用猪塞内卡病毒病灭活疫苗对若干健康易感家兔进行免疫接种；
2)免疫接种28d后，检测所有家兔血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价；
3)当至少4/5的家兔个体血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价≥1:64时，判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
上述方法中，步骤1)中所述健康易感家兔的血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价＜1:2。
上述方法中，步骤1)中所述免疫接种的剂量为至少1ml/只，接种途径采用腿部肌肉注射。
上述方法中，步骤2)中检测血清中和抗体效价的方法包括但不限于中和试验法中的固定病毒稀释血清法。
上述方法中，步骤3)中当全部家兔个体血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价≥1:64时，判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
基于以上技术方案提供的基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒灭活疫苗效力检验的替代方法，消除非洲猪瘟等猪传染病带来的影响；同时本发明提供的方法中采用家兔作为实验动物，相对于实验猪，其在饲养成本上相对较低，购买成本也相对较低，可以有效缩减成本，并且操作简单易行、安全便捷。数据表明，在提供的方法中使用家兔代替实验猪，两者的疫苗效力检测结果一致，因此，可以用本发明提供的家兔免疫后检测血清中和抗体的方法，代替猪免疫攻毒法评价塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力，同时本发明不涉及攻毒保护试验，生物安全性高、检验周期短。另外，本发明提供的方法使用家兔代替实验猪，在灭活疫苗免疫后进行攻毒验证时，由于感染SVA发病的家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，可以避免猪感染SVA后的水泡样症状与***等疾病症状的混淆，将猪SVA感染与猪***等疾病区别开来。
具体实施方式
本发明旨在建立一种用家兔代替猪的猪塞内卡病毒病灭活疫苗的效力检验方法，为新型塞内卡病毒疫苗的效力检验提供新的载体和替代方法。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1、猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备
该实施例选择使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886(CN110551694A)作为毒株制备塞内卡病毒液，经灭活、乳化后获得以下实施例中的疫苗，具体包括以下步骤：
将塞内卡病毒毒株接种于细胞密度为3.0×106，细胞活率在95％以上的PK15-JY悬浮细胞(猪肾悬浮细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的5％CO2培养箱中培养3日后，反复冻融3次收获病毒培养液，加入BEI(二乙烯亚胺，Sigma)使其终浓度为0.003mol/L，于26℃作用48小时灭活，灭活结束后按4％(V/V)的含量加入浓度为50％的硫代硫酸钠溶液阻断灭活作用，获得灭活后抗原。将灭活后抗原与206佐剂(SEPPIC)按质量比为1:1混合，于30℃环境下乳化30分钟，分装后2℃～8℃保存备用。依此方法制备4批疫苗，分别编号为2019002、2019005、2019006和2019007，用于下述实施例中评价疫苗的效力。
实施例2、塞内卡病毒液的制备
该实施例选择使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886(CN110551694A)作为毒株制备塞内卡病毒液，用于以下实施例中的中和毒和检验用毒，具体包括以下步骤：
将塞内卡病毒毒株接种于长满单层的PK-15细胞(猪肾细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的含量接种已长满单层的PK-15细胞，置于37℃的CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变(CPE)，接种后48小时收获病毒培养液液，记为F2代。继续按上述方法传代，传至出现典型病变(表现为细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落)为止，该实施例中培养至F3代即出现典型病变。继续传代至F7代，为病变最典型的最低代次，收获病毒液，测定毒价为107.5TCID50/0.1ml。该过程由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室完成。
实施例3、猪塞内卡病毒病灭活疫苗免疫效力检验
该实施例对上述实施例1获得的猪塞内卡病毒灭活疫苗(批号2019002)进行效力检验，采用的实验动物为：1.0～2.0kg健康易感家兔25只，塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；采用的中和毒为上述实施例2获得的塞内卡病毒液。具体操作方法包括以下步骤：
3.1、猪塞内卡病毒病灭活疫苗免疫家兔
1)分组：将健康易感家兔随机分为5组，每组5只，其中4个组为免疫组，1个组留作对照组；
2)免疫：免疫组分别注射0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml猪塞内卡病毒病灭活疫苗，注射途径采用腿部肌肉注射，对照组以相同方法注射同等剂量的生理盐水，免疫后所有家兔在相同环境下以相同方式进行饲养；
3)抗体检测：分别于免疫后第7、14、21和28天，对所有家兔进行采血，3500rpm，20min分离血清，以中和试验法中的固定病毒稀释血清法检测各组家兔塞内卡病毒血清中和抗体滴度(即血清中和抗体效价，使用的中和毒为上述实施例2制备的塞内卡病毒液)；检测结果如下表1所示。
表1：家兔塞内卡病毒血清中和抗体检测结果(log2)
Figure BDA0002493087640000031
Figure BDA0002493087640000041
如上表1所示，可见家兔接种塞内卡病毒病灭活疫苗后可产生特异性血清中和抗体，并随着时间的推移，抗体滴度(即血清中和抗体值)不断升高；其中2.0ml疫苗免疫组家兔血清中抗体滴度最高，1.0ml疫苗免疫组家兔血清中抗体滴度略高于0.5ml疫苗免疫组家兔血清中抗体滴度，以上三组免疫后第28天抗体滴度均高于1:128，0.25ml免疫组家兔血清中抗体滴度低于其他免疫组；对照组家兔血清中和抗体效价＜1:2。
3.2、血清中和抗体水平与攻毒保护率相关性检验
1)操作方法：上述3.1中各组家兔经采血后，用毒价为107.5TCID50/0.1ml的塞内卡病毒液(实施例2制备)对所有家兔进行攻击，攻毒剂量为2.0ml/只，攻毒方式采用滴鼻途径，攻毒后每天上下午各观察一次，连续观察15天；
2)判定标准：家兔攻毒后鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，症状持续2～3天者判为发病；无症状者判为保护。家兔免疫攻毒试验结果如下表2所示。
表2：家兔免疫攻毒试验结果
Figure BDA0002493087640000042
Figure BDA0002493087640000051
由上表2可见，当血清中和抗体滴度≥1:64时，免疫家兔攻毒不发病；2.0ml、1.0ml和0.5ml疫苗免疫组家兔攻毒后保护率均为100％，0.25ml免疫组保护率为40％，其中两只血清中和抗体滴度≥1:64的家兔攻毒后保护，对照组攻毒后家兔全部发病(保护率0％)。
由以上结果可知，由实施例1制备的塞内卡病毒灭活疫苗对家兔的最小免疫剂量为0.5ml/只，可以实现对家兔的100％免疫保护。在进行疫苗效力检验时，使用剂量可以为最小免疫剂量0.5ml/只，但是实际操作中往往选择使用最小免疫剂量的2倍剂量，即免疫剂量定为1.0ml/只，用以更加客观判断疫苗的免疫效力；当家兔血清中塞内卡病毒中和抗体滴度≥1:64时，攻毒家兔不会发病，可达到有效保护作用，抗体检测结果与攻毒保护率之间相关性良好。
实施例4、利用家兔的疫苗效力检验方法与利用实验猪的疫苗效力检验方法对比
该实施例对上述实施例1获得的猪塞内卡病毒灭活疫苗(批号2019005、2019006、2019007)进行效力检验，采用的实验动物为：60日龄以上健康易感猪，塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自呼和浩特市正大养猪场；1.0～2.0kg健康易感家兔20只，塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；采用的检验用毒和中和毒为上述实施例2获得的塞内卡病毒液。具体操作方法包括以下步骤：
4.1、利用家兔的疫苗效力检验方法
选取20只1.0～2.0kg健康易感家兔，随机分为4组，每组5只，其中3个组免疫猪塞内卡病毒病灭活疫苗(分别对应批号2019005、2019006、2019007)；1个组作为阴性对照，按照下表3的方法进行免疫接种，于免疫后第28天，对所有家兔进行采血，3500rpm，20min分离血清，以中和试验法中的固定病毒稀释血清法检测各组家兔塞内卡病毒血清中和抗体滴度；家兔塞内卡病毒血清中和抗体检测结果如下表4所示。
表3：疫苗免疫接种方法
Figure BDA0002493087640000061
表4：家兔塞内卡病毒血清中和抗体检测结果(log2)
Figure BDA0002493087640000062
由上表4数据可知，3批塞内卡病毒病灭活疫苗分别免疫各组免疫组家兔后，家兔均可产生塞内卡病毒特异性中和抗体，且免疫后28天抗体效价均高于1:64，未免疫组家兔血清中和抗体效价为0。
4.2、利用实验猪的疫苗效力检验方法
选取20只60日龄以上健康易感猪，随机分为4组，每组5只，其中3个组免疫猪塞内卡病毒病灭活疫苗(分别对应批号2019005、2019006、2019007)；另1组为未免疫接种组作为阴性对照，按照下表5的方法进行免疫接种，按照表5的方法进行免疫接种免疫后第21天以相同剂量、相同接种方法加强免疫1次；二免后第14天，用毒价为107.5TCID50/0.1ml的塞内卡病毒液对免疫猪进行攻击，攻毒剂量为5.0ml/头，攻毒方式采用滴鼻途径，每鼻孔2.5ml，攻毒后每天上下午各观察一次，连续观察15天。猪免疫攻毒试验结果如下表6所示。
表5：疫苗免疫接种方法
Figure BDA0002493087640000071
表6：猪免疫攻毒试验结果
Figure BDA0002493087640000072
由上表6数据可知，3批猪塞内卡病毒灭活疫苗免疫各免疫组的实验猪后，攻毒保护率均为100％；未免疫组(4-1组)攻毒后实验猪全部发病(保护率0％)。
由上表4和表6可知，用家兔检验塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力时，免后28天进行血清中和抗体检测，接种3批猪塞内卡病毒灭活疫苗的免疫组家兔100％个体血清中抗体滴度高于1:64；用实验猪进行免疫攻毒试验结果显示，3批猪塞内卡病毒灭活疫苗对猪保护率均为100％。因此，可断定两种方法检测结果一致，可以用家兔免疫后检测血清中和抗体的方法，代替猪免疫攻毒法评价塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力，生物安全性高，且检验周期短。另外，本发明提供的方法使用家兔代替实验猪，在灭活疫苗免疫后进行攻毒验证时，在临床症状上，由于感染SVA发病的家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，可以避免猪感染SVA后的水泡样症状与***等疾病症状的混淆，将猪SVA感染与猪***等疾病区别开来，避免疫苗效力检验过程中***病毒的干扰。
实施例5、***病毒对家兔的致病性
该实施例用A型和O型***病毒液(毒价均为107.5TCID50/0.1ml，由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供)对家兔进行攻毒试验，研究***病毒对家兔的致病性，具体包括以下步骤：
5.1、选取试验动物：选取1.0～2.0kg健康易感家兔12只，检测***病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；
5.2、攻毒用毒制备：毒价为107.5TCID50/0.1ml的A型和O型***病毒液，用于对家兔进行攻毒；
5.3、攻毒：将12只健康易感家兔随机分为3组，每组4只，分别以A型和O型***病毒液，采用2.0ml/只滴鼻途径攻毒，剩余1组作为空白对照，攻毒后连续观察15天，出现与家兔感染塞内卡病毒相似症状者判为发病；攻毒结果如下表7所示。
表7：攻毒剂量试验结果
Figure BDA0002493087640000081
由上表7数据可见，使用毒价为107.5TCID50/0.1ml的A型和O型***病毒液攻击家兔，攻毒后在观察期内，2组家兔均未出现与塞内卡病毒攻击家兔相似的临床症状，即均没有表现出家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起的临床症状，因此使用家兔作为塞内卡病毒疫苗效力检验动物可以避免同样可以引起猪水泡样病变的***病毒的干扰。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：
1)使用猪塞内卡病毒病灭活疫苗对若干健康易感家兔进行免疫接种；
2)免疫接种28d后，检测所有家兔血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价；
3)当至少4/5的家兔个体血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价≥1:64时，判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述健康易感家兔的血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价＜1:2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述免疫接种的剂量为至少1ml/只，接种途径采用腿部肌肉注射。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中检测血清中和抗体效价的方法包括但不限于中和试验法中的固定病毒稀释血清法。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中当全部家兔个体血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价≥1:64时，判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
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