CN101934072A

CN101934072A - 一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

Info

Publication number: CN101934072A
Application number: CN 201010130901
Authority: CN
Inventors: 金天明; 孙颖; 刘田生; 高静
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2030-03-24
Also published as: CN101934072B

Abstract

本发明公开了一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法，采用可控双裂解技术制备重组猪胸膜肺炎放线杆菌APP菌影，将巴氏杆菌保护基因导入APP菌影载体，制成猪胸膜肺炎和巴氏杆菌二联基因疫苗。用以预防猪巴氏杆菌病和胸膜肺炎。实现菌影载体的制备及其在重要动物传染病预防中的应用，同时为多联基因疫苗的研究提供方法。动物实验显示该二联疫苗对猪传染性胸膜肺炎和巴氏杆菌病保护率达分别为99％和99.2％。

Description

一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，是一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法及利用App菌影装载巴氏杆菌抗原OmpH外膜蛋白制备亚单位疫苗的方法。

背景技术

胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌是猪呼吸道常见的重要致病菌，引起的临床症状很难区分，常呈混合感染。大量流行病学调查资料显示，由于抗菌药物的大量使用，导致胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌细菌耐药性普遍存在，特别是高耐药菌株的出现，致使多数药物对耐药菌的临床疗效降低或无效。目前常用的猪传染性胸膜肺炎疫苗有灭活苗、弱毒苗和亚单位疫苗；猪肺疫疫苗有灭活苗及弱毒苗。各类疫苗均存在优缺点：灭活苗成本低、安全、方便，但交叉保护能力差；弱毒苗交叉保护及免疫效果好，但有返毒危险；亚单位疫苗安全，制备方便，却需与适当佐剂配合，才能发挥最佳效果，且交叉保护能力不如弱毒苗，加之灭活过程造成抗原表位的缺失或抗原性减弱，免疫效果不确定且副作用较大等缺点。因此，开展新型疫苗的研究变得尤为必要和紧迫。

目前，利用菌影技术制备疫苗已在多国进行，但尚处于研发阶段，还未有产品推向市场。菌影技术被用于多种革兰氏阴性菌疫苗制备试验，效果良好，但存在裂解不完全的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过引入金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)，使其与裂解蛋白E串联表达，提高裂解效率，制备APP菌影。将多杀性巴氏杆菌保护性抗原OmpH外膜蛋白导入APP菌影，以菌影为载体，发挥靶向作用，从而实现并达到二联疫苗的免疫效果。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Expres s和双基因裂解制备App菌影的方法，包括以下步骤：

1)通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列，通过柔性氨基酸linker串联上述双基因得到E-15aalinker-SN，将E-15aa linker-SN与含有λpL/pR-cI857温控启动子的表达载体pBV220构建温控重组表达载体pBV-E-15aa linker-SN；

2)利用引物扩增温控双基因裂解盒***到E.coli-App穿梭载体pMC-Express中，构建重组穿梭表达载体；

3)采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，菌影冻干保存。

具体包括步骤如下：

1)E、SN和E-15aa linker-SN基因的扩增

根据噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列设计引物：

E1：5’-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)

E2：5’-GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)

SN1：5’-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)

SN2：5’-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)

再设计含15个柔性氨基酸linker的引物，用于将裂解基因E和核酸酶A基因SN串联：

E2’：5’-TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’

SN1’：5’-GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’

以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，分别采用E1、E2和E1、E2’为上、下引物，扩增裂解基因E，得到两组产物，后者在E基因后带有linker；以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923基因组DNA为模板，分别以SN1、SN2和SN1’、SN2为上、下游引物，扩增基因SN，得到两组产物，后者于SN基因前带有linker；以带有linker的E和SN基因为模板，以E1和SN2为引物，通过降落PCR法，得到双基因串联产物E-15aa linker-SN；

2)重组表达质粒及双基因裂解体系的构建

将获得的E、SN和E-15aa linker-SN与pMD-18T载体连接，转化感受态E.coli DH5α，抗性平板筛选阳性菌落后，提质粒酶切鉴定，获得重组克隆质粒pMD-E、pMD-SN和pMD-E-15aa linker-SN；双酶切pMD-E、pMD-E-15aalinker-SN和温控表达载体pBV220，经连接、转化、筛选重组子、提质粒酶切鉴定后，分别获得重组表达载体pBV-E和pBV-E-15aa linker-SN，通过菌体裂解试验，对温控裂解体系功能进行评价；

3)E.coli-App重组穿梭表达载体的构建

根据Genbank中λpL/pR-cI857温控启动子序列及pBV220质粒序列设计温控裂解盒上游引物λpL/pR-cI857FP，与SN基因下游引物SN2’结合，以pBV-E-15aa linker-SN为模板，对该融合基因进行扩增，引物序列如下：

λpL/pR-cI857 FP：5’-ATAGGGCCCTCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(ApaI)

SN2’：5’-CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3’(BamHI)

扩增产物与pMD-18T载体连接，转化、筛选重组子，提质粒酶切鉴定后得到重组克隆载体携带的温控裂解盒；用ApaI和BamHI分别酶切穿梭载体pMC-Expres s和温控裂解盒克隆载体，胶回收试剂盒回收目的片段，以T₄DNA连接酶将线性化载体与目的片段进行连接，转化感受态细胞，筛选重组子，提质粒酶切鉴定后获得重组穿梭表达载体；

4)App重组菌的构建及菌影的制备

采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影。以pMC-Express转化App菌为对照，测定温控双基因裂解***对App菌的裂解特性，并镜检升温前后菌体的形态变化。

用上述制备的App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法，通过 PCR扩增巴氏杆菌保护性抗原OmpH外膜蛋白基因，构建克隆载体和以pET-21a(+)为基础的重组表达载体，经酶切、测序鉴定后，诱导蛋白表达，蛋白鉴定纯化后，以浸泡法载入权利要求1得到的App菌影，制成App菌影装载巴氏杆菌抗原亚单位疫苗。

具体包括步骤如下：

1)巴氏杆菌OmpH基因的扩增

设计一对引物，序列如下：

BS1：5’-CAC GGATCC GCAACAGTTTACAATC-3’(BamHI)

BS2：5’-CTAGCGT AAGCTTAGAAGTTACGCG-3’(HindIII)

以巴氏杆菌基因组DNA为模板，进行扩增；

2)OmpH基因重组表达载体的构建

PCR扩增产物电泳鉴定回收后，与pMD-18T载体连接，转化感受态E.coliDH5α，抗性平板筛选阳性菌落后，提质粒酶切鉴定，获得重组克隆质粒pMD-OmpH，双酶切pMD-OmpH和pET-21a(+)，回收线性化载体和目的片段，用T₄DNA连接酶连接，转化感受态细胞，筛选重组子，提质粒酶切鉴定后获得重组表达载体pET-OmpH；

3)重组表达菌的构建及OmpH外膜蛋白的表达

以pET-OmpH质粒转化感受态E.coli BL21(DE3)，筛选重组子，提质粒鉴定后，菌体加甘油-80℃保存，挑单菌落摇菌，待OD600值为0.3-0.4时，添加IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞，进行SDS-PAGE电泳检测，并纯化目的蛋白；

4)App菌影装载巴氏杆菌抗原OmpH外膜蛋白亚单位疫苗的制备

OmpH外膜蛋白纯化后，通过亲和素-生物素***装入APP菌影载体，制成App菌影装载巴氏杆菌抗原亚单位疫苗。

本发明的有益效果是：菌影是基因组学和蛋白组时代最有效的疫苗研究技术。本发明采用可控双裂解技术制备重组猪胸膜肺炎放线杆菌App菌影，将巴氏杆菌保护性抗原导入App菌影载体，制成猪胸膜肺炎和巴氏杆菌二联疫苗。用以预防猪胸膜肺炎和巴氏杆菌病。实现菌影载体的制备及其在重要动物传染病预防中的应用，同时为多联疫苗的研究提供方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

1材料和方法

1.1材料

限制性内切酶EcoRI，SalI，Apa I和BamHI，PhiX174噬菌体RF I质粒、pMC-Expres s和pBV220质粒购自美国Fermentas MBI公司。克隆载体pMD18-T和E.coli DH5α购自大连TaKaRa公司。金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923和App 1型Shope 4074株购自中国兽药监察所。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因E(序列号：9626372)和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN(序列号：21281729)编码序列设计两对引物：

E1：5’-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)

E2：5’-GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)

SN1：5’-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)

SN2：5’-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)

再设计含15个柔性氨基酸linker的引物，用于将裂解基因E和核酸酶A基因SN串联。

E2’：5’-TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’

SN1’：5’-G AG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’

斜体部分为linker，编码GGGGS柔性氨基酸组，引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2E基因的PCR扩增

以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因E。反应条件为96℃5min；94℃45s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。取PCR产物5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3SN基因的PCR扩增

酚仿抽提法提取金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923细菌基因组DNA。以其DNA为模板进行PCR扩增SN。反应体系同E基因扩增体系。PCR产物同样电泳测定。

1.2.4双基因串联

以E1和E2’扩增E基因，SN1’和SN2扩增SN基因。再以此法扩增的E基因和SN基因为模板，以E1和SN2为引物，扩增带15个柔性氨基酸linker的双基因串联产物E-15aa linker-SN。采用降落PCR法扩增，反应体系为：96℃5min；94℃45s，65℃30s，每两循环降1℃，72℃1min，26个循环；接着94℃45s，52℃30s，72℃1min，15个循环；72℃10min。PCR产物电泳鉴定。

1.2.5克隆载体的制备与鉴定

PCR产物用胶回收试剂盒(上海生工生物工程公司)回收。回收产物依据pMD-18T载体试剂盒说明，按比例和步骤与pMD-18T载体连接。16℃过夜后，热激转化DH5α感受态细胞。转化菌用Amp抗性平板筛选阳性菌落，37℃过夜培养后，挑取阳性单菌落摇菌，提质粒，进行酶切鉴定，重组质粒分别命名为pMD-E，pMD-SN，pMD-E-15aa linker-SN。重组菌加甘油-80℃保存，质粒送上海生工生物工程公司对克隆基因进行测序。

1.2.6重组表达载体的制备与鉴定

以限制性内切酶EcoRI和SalI分别酶切温控表达载体pBV220和重组克隆载体pMD-E及pMD-E-15aa linker-SN，回收相应目的片段，以T₄DNA连接酶分别将E和E-15aa linker-SN基因与载体连接，构建重组表达载体pBV-E和pBV-E-15aa linker-SN。连接产物16℃过夜后，热激转化DH5α感受态细胞，涂布于Amp抗性平板进行筛选，28℃过夜培养后，挑取阳性单菌落摇菌，提质粒，酶切鉴定。

1.2.7重组表达质粒功能检测及双基因裂解体系优越性评价

对重组菌pBV-E DH5α和pBV-E-15aa linker-SN DH5α及对照菌pBV220DH5α28℃过夜增菌后，以0.5％比例分别接种于400ml Amp抗性LB液体培养基中。28℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀值为0.3-0.4时，各取1ml菌液稀释10⁶倍，涂板进行菌落计数，并对单位菌落数进行换算。而后，每种菌液平分为4份，一份继续置于28℃培养，作为水平对照；一份置于42℃培养，作为空白诱导菌；一份于42℃升温诱导时加入终浓度为1mM的Mg²⁺(MgCl₂)和10Mm的Ca²⁺(CaCl₂)；另一份在42℃升温诱导90min后加入上述浓度的二价阳离子，以此来评价二价阳离子及其加入时间对不同裂解体系的影响。升温诱导后，每隔30min对各培养条件下各种菌液OD₆₀₀值进行测定并记录，直至重组菌菌液OD值不再降低为止。裂解过程中，每隔1h收集5ml菌液，离心后取上清，进行酚仿抽提，观察DNA漏出及裂解情况。裂解结束后，各培养液取一定体积进行10⁶倍稀释，涂板计数。42℃诱导pBV-E DH5α和pBV-E-15aalinker-SN DH5α系列菌再取一定体积不进行稀释涂板，计算单位体积菌落数。

以公式：裂解率＝(1-诱导后菌落数/诱导前菌落数)×100％计算各组裂解率。菌体染色后显微镜观测，进行诱导前、后形态学比较。培养液再继续在各条件下培养一段时间，观察结果。

1.2.8E.coli-App重组穿梭表达载体构建及鉴定

1.2.8.1温控裂解盒的克隆及鉴定

根据Genbank中λpL/pR-cI857温控启动子序列及生物公司提供的pBV220质粒序列设计温控裂解盒上游引物，与SN基因下游引物结合，以pBV-E-15aa linker-SN为模板，对该融合基因进行扩增。

λpL/pR-cI857FP：5’-ATA GGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(ApaI)

SN2’：5’-CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3’(BamHI)

引物由上海生工生物工程公司合成。反应体系同E基因扩增体系。PCR产物电泳鉴定、回收，与pMD-18T载体连接，16℃过夜，热激转化DH5α感受态细胞，Amp平板筛选，28℃过夜培养，阳性菌落摇菌，提质粒，酶切鉴定并测序。

1.2.8.2重组穿梭表达载体的构建及鉴定

ApaI和BamHI分别酶切pMC-Expres s和温控裂解盒克隆载体，胶回收试剂盒回收目的片段，以T₄DNA连接酶将线性化载体与目的片段进行连接，氯霉素抗性平板28℃培养，筛选重组子，阳性菌落摇菌，提质粒，酶切鉴定。

1.2.9App 1型重组菌的构建及菌影的制备

采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App1型菌体。通过升温诱导制备App菌影。以pMC-Express转化App菌为对照，测定温控双基因裂解***重组穿梭表达质粒App菌的裂解特性。裂解率达到99.9999％。鉴定为菌影。2动物实验结果

设计4组，每组50只SPF小鼠，分别皮下注射生理盐水，App菌影，菌影装载亚单位疫苗，弗氏完全佐剂亚单位疫苗。于注射后7天，14天，21天，28天、90天，120天，180天，240天分别采血测血清中抗体水平，进行疫苗免疫保护效果评价。并于第7天，14天，21天，28天、90天，120天，180天，240天每组取出5只攻毒，攻毒临床表现均正常。所有小鼠于35天后处死，解剖进行病理观察均正常。动物实验显示菌影疫苗对小鼠的保护率为100％

为扩大试验效果，选择某猪场进行疫苗保护率实验，分组与实验方法同上。动物实验显示该疫苗对猪的保护率分别为99％和99.2％。

利用菌影技术制备疫苗已在多国进行，但尚处于研发阶段，还未有产品推向市场。菌影技术被用于多种革兰氏阴性菌疫苗制备试验，效果良好，但存在裂解不完全的问题。本试验通过引入金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)，使其与裂解蛋白E串联表达，提高裂解效率。APP菌影作为载体，发挥靶向作用，提高疫苗的免疫效果，App菌影在此不但起到优良佐剂的作用，还可发挥其免疫原的功效，使机体产生双重免疫。以APP菌影为装载载体，导入多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白，制备胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌二联疫苗。杜绝猪传染性胸膜肺炎和多杀性巴氏杆菌病的感染。因此在技术上有一定的创新之处。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>天津农学院

<120>利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caggaattca tggtacgctg gactttgtgg 30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggcgtcgact tactccttcc gcacgtaat 29

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caggaattcg caacttcaac taaaaat 27

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggcgtcgact tattgacctg aatcagcg 28

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tgcagaacca ccaccaccag aaccaccacc accagaacca ccaccaccct ccttccgcac 60

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gagggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgc aacttcaact 60

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atagggccct cagccaaacg tctcttcag 29

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgcggatcct tattgacctg aatcagcgt 29

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cacggatccg caacagttta caatc 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctagcgtaag cttagaagtt acgcg 25

Claims

1.一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)利用引物扩增温控双基因裂解盒***到E.coli-App穿梭载体pMC-Express中，构建重组穿梭表达载体EAlysis-vector；

2.根据权利要求1所述的利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法，其特征在于，包括步骤如下：

1)E、SN和E-15aa linker-SN基因的扩增

E1：5’-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)

E2：5’-GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)

SN1：5’-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)

SN2：5’-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)

E2’：5’-TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’

2)重组表达质粒及双基因裂解体系的构建

3)E.coli-App重组穿梭表达载体的构建

λpL/pR-cI857 FP：5’-ATAGGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(ApaI)

SN2’：5’-CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3’(BamHI)

扩增产物与pMD-18T载体连接，转化、筛选重组子，提质粒酶切鉴定后得到重组克隆载体携带的温控裂解盒；用ApaI和BamHI分别酶切穿梭载体pMC-Express和温控裂解盒克隆载体，胶回收试剂盒回收目的片段，以T₄DNA连接酶将线性化载体与目的片段进行连接，转化感受态细胞，筛选重组子，提质粒酶切鉴定后获得重组穿梭表达载体；

4)App重组菌的构建及菌影的制备

采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，以pMC-Express转化App菌为对照，测定温控双基因裂解***对App菌的裂解特性，并镜检升温前后菌体的形态变化，获得App菌影。

3.一种用权利要求1制备的App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法，其特征在于，通过PCR扩增巴氏杆菌保护性抗原OmpH外膜蛋白基因，构建克隆载体和以pET-21a(+)为基础的重组表达载体，经酶切、测序鉴定后，诱导蛋白表达，蛋白鉴定纯化后，以浸泡法载入权利要求1得到的App菌影，制成App菌影装载巴氏杆菌抗原亚单位疫苗。

4.根据权利要求3所述的App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括步骤如下：

1)巴氏杆菌OmpH基因的扩增

设计一对引物，序列如下：

BS1：5’-CAC GGATCC GCAACAGTTTACAATC-3’(BamHI)

BS2：5’-CTAGCGT AAGCTT AGAAGTTACGCG-3’(Hind III)

以巴氏杆菌基因组DNA为模板，进行扩增；

2)OmpH基因重组表达载体的构建

3)重组表达菌的构建及OmpH外膜蛋白的表达

4)App菌影装载巴氏杆菌抗原OmpH外膜蛋白亚单位疫苗的制备