CN101932691B - 生产具有低酒精含量葡萄酒的方法 - Google Patents

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Abstract

生产具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶处理未发酵的未发酵的葡萄汁。

Description

生产具有低酒精含量葡萄酒的方法
技术领域
本发明涉及生产具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶处理未发酵的葡萄汁。 
背景技术
由于全球变暖，全世界的葡萄包含更多糖。该糖在酒精性发酵中被转化成酒精，导致产生具有提高水平酒精的葡萄酒。 
因为此，当今葡萄酒工业的主要问题之一是高乙醇水平。15-16％(V/V)水平的乙醇破坏了葡萄酒的感官质量，并且有时将葡萄酒置于比所预期更高的纳税分类中。在过去十几年观察到的提高的乙醇水平是所收获葡萄中糖水平增加的结果。当今，具有超过16％(V/V)乙醇含量的葡萄酒不再稀有，并且预测糖水平会随着全球变暖甚至增加更多。 
当前认为因全球变暖而受负向影响的重要的葡萄酒区是例如Rioja(西班牙)、Chianti(意大利)、Hunter Valley(澳大利亚)和南加利福尼亚的重要区域。 
当前的减少乙醇的方法，像反向渗透、旋转锥或稀释不能令人满意。这些方法会对葡萄酒的感官质量具有不利影响。此外，对于葡萄酒反向渗透的价格高达1美元/加仑，这对于该方法的广泛使用而言是主要的限制。 
US4675191(Novo Industri，在丹麦公布，1987)描述了减少葡萄酒中酒精含量的方法，其包括使用葡萄糖氧化酶。对于所描述的方法，第2栏第25-29行写到： 
“本发明方法包括在氧存在下以葡萄糖氧化酶处理未发酵的葡萄糖，由此将葡萄汁中的葡萄糖转化成葡糖酸并且之后将如此处理的葡萄汁发酵。”该现有技术方法的在此处的主要相关技术原理示意性地图解于图1。 
发明内容
本发明待解决的问题是提供减少葡萄酒中酒精含量的方法，其中方法会使葡萄酒中的酒精明显更少。此外，方法明显降低了不期望的酒精发酵停滞。 
解决方案基于这样一个事实，即本发明人已经鉴定出，基于本领域的葡萄糖氧化酶的方法还可以通过包括使用葡萄糖异构酶得以显著改善。 
US4675191的方法与本发明方法的示意性比较图解于图1。 
在本文的工作实施例中可以看出，仅使用葡萄糖氧化酶的过程使得总糖减少12％左右，而额外加入葡萄糖异构酶使该数值明显增加至19％左右的糖减少。葡萄汁中糖更少意味着葡萄酒中酒精含量更少。 
此外，发明人发现额外加入葡萄糖异构酶帮助维持葡萄汁中葡萄糖/果糖比率在1∶1左右，这显著降低了不期望的酒精发酵停滞的危险。对于进一步的细节见本文的工作实施例。 
技术人员已知，如果葡萄汁中葡萄糖/果糖比率明显不同于1.1则会停滞酒精发酵，即酵母没有将所有的糖发酵，并且将因此得到太甜的葡萄酒。 
如技术人员所已知，葡萄糖异构酶的重要的商业化相关应用是将葡萄糖转化成果糖，例如为了制造高果糖糖浆(果糖比葡萄糖更甜)。 
因为此，本发明人真正感到惊讶地是，加入葡萄糖异构酶给出了如此积极的结果(糖显著较少＝＞葡萄酒中酒精较少)。对于此结果的一个原因是葡萄糖异构酶乍看起来作为可以“去除/转化”太多的葡萄糖的酶，并且葡萄糖氧化酶将因此具有更少可利用的底物(葡萄糖氧化酶对果糖无效)。 
然而，如在本文的工作实施例中所示，加入葡萄糖异构酶给出十分积极的结果。 
不被理论所限制，据信下面将是关于为何加入葡萄糖异构酶得出十分积极结果的理论解释。 
葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)在葡萄汁中催化下列反应： 
β-D-葡萄糖+O2<＝>D-葡萄糖酸-1，5-内脂+H2O2
在葡萄汁内产生的“D-葡萄糖酸-1，5-内脂”自发转化成葡糖酸。因此，D-葡萄糖酸-1，5-内脂被去除，并且因此平衡向右进行＝＞葡萄糖从葡萄汁中去除。 
如果酶制剂还具有过氧化氢酶活性，则产生的H2O2也被去除＝＞则平衡更加向右侧进行＝＞更多葡萄糖被去除。包含过氧化氢酶活性是本文的优选实施方案-见下面讨论。 
过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)催化反应： 
2H2O2<＝>O2+2 H2O 
与本文所述方法有关的是葡萄糖异构酶EC 5.3.1.5(法定名称木糖异构酶)。对于该EC 5.3.1.5类的法定名称是木糖异构酶。然而，如技术人员所已 知，其还有一个称作葡萄糖异构酶的别名。葡萄糖异构酶是在例如该酶类别相关商业产品，例如在本文工作实施例中使用的商业产品中使用的名称。 
在葡萄汁中，本文相关并且众所周知的在葡萄汁中由葡萄糖异构酶催化的反应是下列反应： 
D-葡萄糖<＝>D-果糖。 
如技术人员所已知，该酶类还催化反应： 
D-木糖<＝>D-木酮糖。 
该木糖相关反应与本文相关性小。 
一个理论是，由葡萄糖氧化酶去除葡萄糖导致在葡萄汁中产生一种情况，即葡萄糖/果糖比率变成低于1∶1(得到“太多的果糖”-“太少的葡萄糖”)。因此，葡萄糖异构酶平衡“强制”向左侧进行＝＞果糖被转化成葡萄糖以“恢复”1∶1的葡萄糖/果糖比率＝＞葡萄糖氧化酶得到“新”产生的葡萄糖以继续工作并且因此总体上从葡萄汁中去除更多的糖(葡萄糖和果糖两者)。 
如上所述，维持1∶1的葡萄糖/果糖比率还具有明显减少酒精发酵停滞的危险的优点。 
在酵母的酒精发酵之前，O2存在于未发酵葡萄汁中。如技术人员所已知，正常的酵母发酵一般由两部分组成： 
部分1 
需氧生长(存在氧) 
这是最初的快速生长过程，在其中酵母细胞数量大约每4小时翻倍。(通常24-72小时) 
部分2 
厌氧发酵(不存在氧) 
较慢的活性和酵母使糖(葡萄糖和果糖两者)发酵，将其转化成酒精(糖＝＞2乙醇+2CO2)，而不是增加酵母细胞的数量。(取决于酵母和方法该过程可发生数天至数周)。 
因此，在酵母发酵过程中，O2将迟早消失。葡萄糖氧化酶的活性需要O2。然而，葡萄糖异构酶在有或者无O2存在下是有活性的。因此，在实际的酵母酒精发酵过程中，葡萄糖异构酶还可以帮助维持1∶1的葡萄糖/果糖比率。 
因此，本发明的一个方面涉及生产具有低酒精含量葡萄酒的方法，其包括 下列步骤： 
(1)：以有效量的下列两种酶处理未发酵的葡萄汁： 
(a)葡萄糖氧化酶，在氧存在下处理一段足以将葡萄汁中至少部分葡萄糖转化成葡糖酸的时间；和 
(b)葡萄糖异构酶处理一段足以将葡萄汁中至少部分果糖转化成葡萄糖的时间； 
和随后， 
(2)：将具有减少量葡萄糖和果糖的如此处理的葡萄汁发酵，以生产具有低酒精含量的葡萄酒。 
定义 
本文相关术语的所有定义与本文相关技术背景相关技术人员的理解一致。 
与根据第一个方面的方法生产的葡萄酒有关的术语“低酒精含量”在本文中指，与在相同条件下但没有用第一个方面的步骤(1)的两种酶处理所生产的葡萄酒相比，葡萄酒中的酒精含量较低。事实上，该术语可以看作是与使用有效量的两种酶直接相关。 
如果使用有效量的葡萄糖氧化酶，则至少部分葡萄糖将从葡萄汁中去除，并且因此葡萄酒中的酒精更少。类似地，对于有效量的葡萄糖异构酶，其将葡萄汁中的至少部分果糖转化成葡萄糖＝＞这样产生的葡萄糖然后被葡萄糖氧化酶去除＝＞因此葡萄酒中的酒精更少。 
本发明的实施方案仅通过实施例的方式在下描述。 
附图说明
图1：US4675191方法与本发明方法的示意性图解/比较。 
具体实施方式
降低/减少酒精量：
实际上，本文所述的方法可以用于制造具有实际上任何预期低酒精含量的葡萄酒。 
例如，起可以是具有6-7％左右酒精含量的所谓的轻度酒。 
如上所述，由于全球变暖的缘故，全球的葡萄包含更多的糖，导致葡萄酒具有增加水平的酒精。由于不同的原因，如差的口感或不同的纳税类别，这将是不期望的。 
因此，在优选的实施方案中，如本文所述生产的具有低酒精含量葡萄酒实际上具有据认为对于当今的红/白葡萄酒而言为正常的酒精含量-例如12-14％。 
换句话说，如果相同的葡萄酒没有经过本文所述的处理而制造的话，则其将具有高的多的酒精百分数(例如15-17％)。 
葡萄酒可以是任何相关类型的葡萄酒，例如白葡萄酒、红葡萄酒、无气葡萄酒或含气葡萄酒。 
葡糖酸：
以葡萄糖氧化酶处理未发酵的葡萄汁产生葡糖酸，其不可被酵母发酵并且因此葡糖酸出现在葡萄酒中。如技术人员所已知，葡糖酸会使葡萄酒具有令人不愉快的感官特性。 
因此，第一个方面方法的实施方案包括去除至少部分葡糖酸的任选步骤(3)以得到具有满意感官特性的葡萄酒。 
在一个实施方案中，葡糖酸通过加入形成葡糖酸微溶盐的物质，优选碳酸钙的中和手段被去除。碳酸钙是廉价的，并且已经用作葡萄酒的化学脱酸剂，并且沉淀的葡糖酸盐，主要是葡糖酸钙，可以通过过滤容易地去除。由于葡萄酒无论如何也要过滤，所以该中和作用没有向葡萄酒制造过程中引入任何额外的过滤步骤。 
如技术人员所已知，具有高酒精含量的葡萄酒常常缺乏酸度。这意味着，对于此类葡萄酒实际上可以优选不去除葡糖酸。 
葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶
如在本文所述方法中待使用的葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶可以从多种不同适宜来源，如相关的商业可得的酶产品中得到。 
如技术人员所已知，在酶市场上存在在正常葡萄酒制造条件下工作(例如相关pH值、温度等)的众多不同商业可得的葡萄糖氧化酶/异构酶产品。 
在下面的工作实施例中，使用了下列商业可得到的酶产品： 
葡萄糖氧化酶： 
Figure DEST_PATH_GSB00000981624300011
(来自Amano) 
葡萄糖异构酶：来自Sigma的产品(目录号G4166-50g)-见本文的工作实施例。 
产品的一个优点是其还包括过氧化氢酶活性。 
过氧化氢酶活性
如上所述，在本文所述方法中使用具有过氧化氢酶活性的酶制剂还导致去除由葡萄糖氧化酶所产生的H2O2。 
过氧化氢(H2O2)会产生令人讨厌的葡萄酒颜色，并且因此不是葡萄酒中的合意成份。 
此外，如上所述，通过去除H2O2，可以使葡萄糖氧化酶平衡甚至进一步地移向左边＝＞更多的葡萄糖被去除。 
因此，在第一个方面的步骤(1)的优选实施方案中，葡萄汁还以具有过氧化氢酶活性的有效量制剂处理一段足以将葡萄汁中的至少部分H2O2转化成O2+H2O的时间。 
优选的生产参数-第一个方面的步骤1
如技术人员所已知，葡萄酒制造过程中的变化改变了葡萄酒产品的感官特性。因此，在通常的葡萄酒制造过程与本文所述方法的实践之间的紧密配合是优选的。在尽可能的范围内，通过实施本发明而无须做什么来改变葡萄酒的口味和香味。 
酶催化的过程通常在酶的最适pH内开展。本发明的优选实施是处理没有调节其pH的未发酵葡萄汁。幸运地是，如本文所使用的、商业可得到的适宜相关酶产品在未发酵葡萄汁的通常pH3-4的范围内表现出足够的活性和稳定性。 
应当理解的是，本文所述的任何酶可以用于本发明方法中，只要其在葡萄酒生产方法过程中普遍使用的pH和温度下表现出适当的相关活性和稳定性即可。因此，纵使可溶性的酶制剂通常是优选的，但是可以使用可溶性和固定化的酶制剂。 
本领域技术人员容易地确定对于给定的葡萄汁和预期糖转化需要多少给定类型的酶。 
例如，依赖于治疗时间和温度的细节： 
(i)：大致在约1,000和50,000,000国际单位每h1葡萄汁之间的葡萄糖氧化酶活性将是适当的；和 
(ii)：大致在约100和5,000,000国际单位每h1葡萄汁之间的葡萄糖异构酶活性将是适当的。 
如技术人员所已知，国际单位定义为每分钟催化1μM底物转化的酶的量。条件也必须详细说明。如技术人员所已知，人们通常采用30℃的温度和得到最 大底物转化率的pH值和底物浓度。 
在此，国际单位如上面所述并且根据本领域定义，即在30℃的温度下和得到最大底物转化率的pH值和底物浓度下确定。 
如技术人员所已知，对技术人员而言如本文所述确定酶的国际单位是常规工作，并且可以在本文的相对小的不确定性之内确定。 
例如，如技术人员所已知，最适pH值和最适底物浓度会随着特定的目的酶(例如特定的葡萄糖氧化酶)改变。然而，可以容易鉴定这种最适pH和底物浓度，因为例如其通常在相关的商业可得酶产品的产品文件中给出。此外，对于特定的目的酶，鉴定参数如最适pH和底物浓度通常是常规工作。 
在优选实施方案中，使用下列： 
(i)：大致在约15,000和5,000,000国际单位每h1葡萄汁之间的葡萄糖氧化酶活性；和 
(ii)：大致在约5,000和500,000国际单位每h1葡萄汁之间的葡萄糖异构酶活性。 
在优选的实施方案中，在第一个方面的步骤(1)过程中的温度在1和35℃之间，优选在3和30℃之间。通常，在酶反应中，如果温度从例如25℃左右提高至40℃，总反应速率将随着温度的提高而增加。然而，在该情况下，如果温度从25℃提高至40℃，更多的氧将从液体中释放，并且因此在此种情况下总反应速率将降低。在40℃下的延长的更长处理也有害于葡萄汁的质量。 
总的来说，优选地，在葡萄酒制作机制中所做的唯一变化意味着未发酵的葡萄汁的短期储存，与此同时(充气的)葡萄汁以葡萄糖氧化酶、异构酶和任选的本文所述其他酶处理。在这一点上，应该注意的是，控制参数是处理时间，而不是酶活性。例如，应采用足够的葡萄糖氧化酶以便在适当处理时间内转化预期比例的葡萄糖，其中时间通常不超过72小时，并且多数时间不超过48小时。即使在未发酵的葡萄汁中存在一些酵母，发现在最初48小时过程中发酵不会启动达到任何可感知的程度，并且因此去除相关量的糖是可能的。 
至于第一个方面的步骤1，应该注意的是，转化程度非常容易控制，因为通过切断氧供应从葡萄糖至葡糖酸的反应几乎立即停止。 
该发明的实施还考虑了这样的情况，即自步骤1的糖减少的葡萄汁持续作为酸供应(酸储存)并且与缺乏酸的葡萄汁混合以改善所得到的葡萄酒的感官特 性。 
应当理解，葡糖酸的去除可以在任何时间开展，例如在发酵步骤之后。 
备选地，可以在加入如本文所述的葡萄糖氧化酶之前，通过加入例如碳酸钙进行葡糖酸的去除。这样做的优点是葡萄汁中的pH增加，并且这通常改善葡萄糖氧化酶的活性，由于葡萄糖氧化酶通常在pH中性左右具有最适pH。 
在优选实施方案中，相关酶制剂是固体的水溶性制剂，优选非粉化制剂。固体制剂的储存稳定性优于液体制剂的储存稳定性，并且也没有必要加入任何保存试剂。推荐使用者在即将使用之前将固体形式试剂溶解在少量水中。 
在本文所述的方法的优选实施方案中，在第一个方面的步骤1过程中持续向葡萄汁供应氧。氧供应尤其对葡萄糖氧化酶的酶促反应的反应速率具有非常大的影响。因此，持续引入氧保证了高的反应速率。希望氧通过空气泵供应，空气泵是向葡萄汁中引入氧最有效的手段。 
在根据本发明方法的优选实施方案中，在步骤1中加入的葡萄糖氧化酶/异构酶制剂的量足以在不超过72小时左右的时间段内产生所希望的糖浓度降低。如已经指出的那样，即使葡萄汁中存在一些酵母，在最初的48小时期间发酵也不会进展至任何可感知的程度，并且因此在葡萄糖向葡糖酸的酶促转化期间也没有可感知量的葡萄糖/果糖被同时发酵成酒精。 
在优选实施方案中，在步骤(1)过程中对于葡萄糖氧化酶/异构酶两种酶的有效量和一段时间是这样的，以致于： 
(A)：葡萄汁中的糖含量减少至少10％，更优选至少14％并且甚至更优选至少17％。 
如上所述，在本文的工作实施例中，糖含量(葡萄糖和果糖两者)减少19％。 
在根据本发明方法的优选实施方案中，不控制步骤1中的pH值。该实施方案在更长处理时间，例如一直到72小时左右是可行的并且被采用的情况下，是特别优选的。 
由于葡萄酒的香气、口味和香味是极端敏感的特性这一事实，将不能预测根据本发明生产的较低酒精的葡萄酒是否会拥有希望的特性，由于根据本发明以可溶性葡萄糖氧化酶/异构酶制剂生产的较低酒精的葡萄酒会包含痕量无活性葡萄糖氧化酶/异构酶并且在其他组份的浓度方面也可能不同于常规葡萄酒。然而，已经发现，根据本发明生产的较低酒精的葡萄酒拥有葡萄酒的全部正常 特性，包括口味和香味，当然与酒精浓度直接相关的特性排除在外。 
优选的生产参数-第一个方面的步骤2
开展第一个方面的步骤2，即所处理葡萄汁的发酵是本发明方法的必须步骤。然而，在此无需提供对发酵步骤的详细讨论，因为明确考虑了开展常规葡萄酒制造实践并且这些实践对葡萄酒酿造学(酿酒学)领域技术人员而言是众所周知的。在本文中已经强调了，在本发明的优选实践中避免对葡萄酒制造过程机制的强加任何不必要的改变。 
如上所述，在酵母发酵过程中，O2迟早会消失。葡萄糖氧化酶需要O2才能工作。然而，葡萄糖异构酶可以在存在或不存在O2情况下工作。因此，葡萄糖异构酶还可以帮助维持实际的酵母酒精发酵过程中葡萄糖/果糖比率为1∶1。 
实际上，这通常将在如本文所述的方法中发生。在步骤(1)过程中加入至未发酵葡萄汁中的葡萄糖异构酶正常情况下在步骤(2)的酵母酒精发酵过程中仍然是有活性的。 
然而，任选地，可以在步骤(2)的酵母酒精发酵过程中加入额外的葡萄糖异构酶。 
因此，在第一个方面的本发明实施方案中，在酵母酒精发酵步骤(2)过程中加入额外的葡萄糖异构酶。 
实施例 
实施例1：葡萄汁中的酶催化糖减少-第一个方面的步骤(1)实例 
减少葡萄酒中最终酒精含量的一个可能的方法是在酒精发酵之前减少葡萄汁中的糖浓度。因此，开展葡萄汁的酶性处理以减少总糖含量。 
开展三个独立的实验，在每一情况中使用两个重复。在每一样品中，200ml葡萄汁(Pinot Blanc 2007，德国，经巴氏灭菌的)加入至玻璃烧瓶中并且使用磁力搅拌器连续混合。在整个实验过程中均将样品充气。 
100mg葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano，＞15,000u/g)或者100mg葡萄糖氧化酶和1g葡萄糖异构酶(Sigma，G4166-50g，＞350u/g)加入至烧瓶中。在室温下保温3天。 
在即将加入酶之前和加入后的3天取出样品。使用由BoehringerMannheim/R-biopharm(目录号10 139 106 035)供应的商业化的基于UV的测定法并按照制造商提供的实验方案分析样品中葡萄糖和果糖的存在。该实验的结 果总结于下表I。 
表I：葡萄汁中的酶促糖(葡萄糖和果糖)减少，GOX＝葡萄糖氧化酶 
天数    处理          总糖(g/l)    总糖减少(％) 
0       GOX           230          0 
        GOX+异构酶    235          0 
3       GOX           202          12 
        GOX+异构酶    190          19 
结论 
该实施例1的这些结果显示，仅使用葡萄糖氧化酶的过程得到12％左右的总糖减少，额外加入葡萄糖异构酶使该数值明显提高至19％左右的糖减少。葡萄汁中糖更少意味着葡萄酒中酒精含量更低。 
实施例2：所处理葡萄汁的酵母发酵-第一个方面的步骤(1) 
和步骤(2)的实施例 
在实验室规模开展了对普通葡萄酒制造过程的完全模拟。在该实验中显示酶处理的确对最终酒***平具有影响，而没有负面影响主要的葡萄酒的生产参数，如酒精发酵或苹果酸乳酸发酵。 
在近似22℃的室温下开展完整的实验。开展6个实验，每一实验在发酵瓶中使用4升葡萄汁(Pinot Blanc 2007，德国，经巴氏灭菌的)。不调节葡萄汁的pH并且不加入除该实施例中所述酶之外的物质。 
如下所述将葡萄汁与酶预孵育三天，然后开展11天的酒精发酵和10天的苹果酸乳酸发酵。 
酶处理
6个烧瓶分成三个组，每组两个烧瓶。 
在组1中的葡萄汁与0.5g/l葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano，＞15,000u/g)预孵育三天，在组2中葡萄汁与0.5g/l葡萄糖氧化酶和2g/l葡萄糖异构酶(Sigma，G4166-50g，＞350u/g)预孵育三天，并且在对照组中葡萄汁不用酶处理。在加入酶之后，将烧瓶在酶存在下强力充气三天，之后开始酒精发酵。充气是重要的，因为氧是葡萄糖氧化酶介导的酶转化所需要的。 
酒精发酵
通过接种再水化的冷冻干燥葡萄酒酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Merit.Ferm，Chr.Hansen，0.1g/l)至9E+05CFU/ml的终浓度开始酒精发酵。再水化是在室温在胨水(15g/l胰蛋白胨、OxoidL42，9g/l NaCl、1.14g/l  2％消泡剂1510、BHD 63215)中开展10分钟。 
在此时停止充气并且在随后的几天内由于酵母代谢导致氧消耗光。将酒精发酵在室温运行11天，导致将所有糖几乎完全转化成酒精。 
苹果酸乳酸发酵
在酒精发酵之后，开始苹果酸乳酸发酵。该部分过程的目标是将苹果酸转化成产生更愉悦感官感觉的乳酸，并且因此是葡萄酒生产过程的重要部分。苹果酸乳酸发酵主要通过细菌酒酒球菌(Oenococcus oeni)实现。如果酒酒球菌的生长被葡萄汁的酶处理损害，则将是非常不期望的。 
在开始酒精发酵11天后，通过向发酵过的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr.Hansen.批号：2711097)开始苹果酸乳酸发酵。冷冻干燥的酒酒球菌(0.7g的8.2E+11CFU/g)在100ml胨水(15g/l胰蛋白胨、Oxoid L 42.9g/l NaCl、1.14g/l  2％消泡剂1510、BHD 63215)中再水化10分钟。向4000ml发酵过的葡萄汁中加入3ml，导致最终浓度为4.3×106CFU/ml。在室温下再放置10天。 
结果 
酶处理对酒***平的影响
使用由Boehringer Mannheim/R-biopharm(目录号10 139 106 035)供应的商业化的基于UV的测定***并按照制造商提供的实验方案分析样品中葡萄糖和果糖水平。 
表II，在酒精发酵开始和结束时的糖水平 
Figure BPA00001187297800111
在酒精发酵过程中的不同天数时，使用如文献(Bestimmung desalkoholgehalts nach Dr.Rebelein.由C Schliesmann Kellerie-Chemie GmbH& Co.KG，Auwiesenstrasse 5，74523 
Figure BPA00001187297800121
Ha11出版(2001))中所述的Dr.Rebelein滴定方法测量酒精。在未处理的葡萄汁中，发酵几乎完全，在发酵过程结束时达到12.7％的最终酒***平。当葡萄汁用葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶预处理时，糖发酵完全，但是酒精的最终水平显著更低(11.8％)。 
当葡萄汁仅用葡萄糖氧化酶预处理时发现酒精为低水平，这是不完全发酵的结果。在该实验中，葡萄糖氧化酶处理的葡萄汁在正常葡萄酒制造中不可使用，因为在发酵结束时剩余的糖，特别是果糖水平高(表II)。 
因此，额外加入葡萄糖异构酶帮助维持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1∶1左右，这明显降低了如仅使用GOX时所示的不期望的酒精发酵停滞的危险。 
此外，使用异构酶的实验去除了所有糖，而在对照(未处理的葡萄汁)中仍存在一些果糖(8g/l)。这证明异构酶实质防止了发酵停滞。 
表III，在发酵过程中的酒***平。在第11天开始苹果酸乳酸发酵。在葡萄糖氧化酶(GOX)预处理样品中的酒***平用斜体字表示以表明这些数值是酒精发酵严重延缓的结果。Nd：不能确定 
  天数   处理   酒精(vol％)
  0   对照   0
    GOX   0
    GOX+异构酶   0
  7   对照   10.9±0.3
    GOX   Nd
    GOX+异构酶   10.7±0.5
  11   对照   12.3±0.1
    GOX   7.5±1.3
    GOX+异构酶   11.7±0.1
  16   对照   12.7±0.1
    GOX   9.3±0.6
    GOX+异构酶   11.8±0.01
[0150] 结论 
该实施例2的结果显示，与对照的12.7％相比，GOX+异构酶明显降低酒精百分数至11.8％。 
此外，额外加入葡萄糖异构酶帮助维持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1∶1左右，这明显降低了与仅使用GOX相比时的不期望的酒精发酵停滞的危险。 
当葡萄汁仅用葡萄糖氧化酶预处理时发现酒***平低(9.3％)，这是不完全发酵，换句话说是不期望的酒精发酵停滞的结果。在该实验中葡萄糖氧化酶处理的葡萄汁不能用于正常的葡萄酒制造，因为在发酵结束时剩余糖，特别是果糖水平高(表II)。 
此外，使用异构酶的实验去除了所有糖，而在对照(未处理的葡萄汁)中仍存在一些果糖(8g/l)。这证明异构酶本身防止了发酵停滞。 
实施例3：酒精发酵过程中的酵母生长-异构酶的加入 
明显降低了酒精发酵停滞。 
技术人员已知，当果糖浓度比葡萄糖浓度高相当多时，有代表性的出现发酵停滞。在酒精发酵开始时为1/1的葡萄糖/果糖比率，在酒精发酵过程中会变成负值，导致发酵延迟。 
在该实施例3中，通过仅以葡萄糖氧化酶处理未发酵的葡萄汁诱导延缓的(停滞的)发酵。 
为了研究葡萄糖异构酶对在酒精发酵过程中酵母生长和存活能力的影响，如本文实施例2中所述开展模拟葡萄酒生产。如下所述，葡萄汁与酶预孵育三天，然后进行11天的酒精发酵和10天的苹果酸乳酸发酵。 
开展三个独立的实验，在每一实验中使用两个重复。在每一样品中，200ml葡萄汁(Pinot Blanc 2007，德国，经巴氏灭菌的)加入至玻璃烧瓶中并且使用磁力搅拌器连续混合。在整个实验过程中均将样品充气。 
100mg葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano，＞15,000u/g)或者100mg葡萄糖氧化酶和1g葡萄糖异构酶(Sigma，G4166-50g，＞350u/g)加入至烧瓶中。在室温下保温3天。在该时间点之后，通过接种再水化的冷冻干燥的葡萄酒酵母(酿酒酵母Merit.Ferm，Chr.Hansen，0.1g/l)至9E+05CFU/ml的终浓度开始酒精发酵。再水化是于室温下在胨水(15g/l胰蛋白胨、Oxoid L42.9g/l NaCl、 1.14g/l  2％消泡剂1510、BHD 63215)中开展10分钟。在开始酒精发酵11天后，通过向发酵过的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr.Hansen.批号：2711097)开始苹果酸乳酸发酵。冷冻干燥的酒酒球菌(0.7g的8.2E+11CFU/g)在100ml胨水(15g/l胰蛋白胨、Oxoid L 42.9g/l NaCl、1.14g/l  2％消泡剂1510、BHD 63215)中再水化10分钟。向4000ml发酵过的葡萄汁中加入3ml，获得终浓度为4.3×106CFU/ml。在室温下再放置10天。 
酿酒酵母菌落形成单位数如下确定，即在不同时间点从发酵的葡萄汁取出样品并将系列稀释液涂布于YGC固体培养基琼脂平板上，然后在30℃孵育过夜。 
使用由Boehringer Mannheim/R-biopha rm(目录号10 139 106 035)供应的商业化的基于UV的测定***并按照制造商提供的实验方案确定糖水平。 
结果 
异构酶对酒精发酵停滞的影响
在酒精发酵过程中，葡萄汁中的糖被酿酒酵母转化成乙醇。 
仅以葡萄糖氧化酶处理显示，由于酿酒酵母生长的延缓导致酒精发酵延缓(停滞发酵)(如表IV中所示)。在以葡萄糖氧化酶预处理的未发酵葡萄汁中，酵母的生长在酒精发酵的前几天非常差。CFU数在酒精发酵第一天时低于检测限，并且在第二天时低于近似3log单位。这清楚地表明发酵停滞。 
糖分析支持该结果。在未处理的未发酵葡萄汁中，在酵母发酵3天后，近似60％的糖被发酵，而在GOX预处理的未发酵葡萄汁中少于10％的糖被发酵。 
然而，当在预处理和酒精发酵过程中存在葡萄糖异构酶时，发酵过程的行为几乎与未处理的葡萄汁的发酵相同。剩余的糖水平和酿酒酵母CFU数(表IV)可与未处理的葡萄汁相当。换句话说，葡萄糖异构酶能够克服由GOX处理所造成的发酵停滞。 
表IV，在酒精发酵过程中的活酿酒酵母细胞计数。葡萄汁已经如上所述预处理3天。酵母在t＝0天时加入。Nd＝低于检测限。 
  天数   处理   CFU/ml(平均)  总糖(g/l)
  0   对照   7.0±1.4E+05   229±4
    GOX   9.0±4.2E+05   225±9
    GOX+异构酶   9.0±1.4E+05   225±25
  1   对照   6.5±2.1E+05  
    GOX   Nd  
    GOX+异构酶   1.0±0.9E+06  
[0172] 
  2   对照   2.2±0.2E+07   212±6
    GOX   5.0±7.1E+04   220±6
    GOX+异构酶   1.1±0.9E+07   209±11
  3   对照   6.9±0.9E+07   86±64
    GOX   2.7±3.3E+06   207±5
    GOX+异构酶   5.1±1.7E+07   96±80
  7   对照   3.1±0.9E+07   22±10
    GOX   3.2±1.1E+07   141±55
    GOX+异构酶   4.3±0.3E+07   11±8
  9   对照   2.7±0.2E+07  
    GOX   2.0E±0.8+07  
    GOX+异构酶   1.1±1.6E+07  
  16   对照   6.9±6.6E+06   2±1
    GOX   2.9±1.0E+06   53±12
    GOX+异构酶   9.5±9.2E+05   0±0
  18   对照   2.5±0E+05  
    GOX   4.0±2.1E+06  
    GOX+异构酶   2.0E+05  
结论 
如该实施例3中所示，仅使用GOX将引起明显的不期望的发酵停滞。 
该实施例3的结果显示，异构酶的加入可帮助克服GOX的加入对通常用于葡萄酒生产的酿酒酵母生长的负面影响。 
参考文献 
1.US4675191(Novo Industri，在丹麦公布的，1987) 

Claims (16)

1.生产具有低酒精含量的葡萄酒的方法，其包括下列步骤：
(1)：以有效量的下列两种酶处理未发酵的葡萄汁：
(a)在氧存在下以葡萄糖氧化酶处理一段足以将葡萄汁中的至少部分葡萄糖转化成葡糖酸的时间；和
(b)以葡萄糖异构酶处理一段足以将葡萄汁中的至少部分果糖转化成葡萄糖的时间；
和此后，
(2)：具有减少量的葡萄糖和果糖的如此处理的葡萄汁被发酵以生产具有低酒精含量的葡萄酒，
其中术语“低酒精含量”指与在相同条件下但没有用步骤(1)的两种酶处理所生产的葡萄酒相比，葡萄酒中的酒精含量较低。
2.权利要求1的方法，其中权利要求1步骤(2)所生产的具有低酒精含量的葡萄酒具有被认为对于红葡萄酒/白葡萄酒而言是正常的，即12-14％的酒精含量，并且其中如果葡萄酒在没有用权利要求1的步骤(1)的酶处理情况下制造的话将具有过高的酒精百分数，即15-17％。
3.权利要求1的方法，其中权利要求1的方法包括去除至少部分葡糖酸以得到具有令人满意的感官特性的葡萄酒的额外步骤(3)；并且其中葡糖酸通过加入形成葡糖酸微溶盐的物质进行中和的方法去除。
4.权利要求2的方法，其中权利要求1的方法包括去除至少部分葡糖酸以得到具有令人满意的感官特性的葡萄酒的额外步骤(3)；并且其中葡糖酸通过加入形成葡糖酸微溶盐的物质进行中和的方法去除。
5.权利要求3的方法，其中形成葡糖酸微溶盐的物质是碳酸钙。
6.权利要求4的方法，其中形成葡糖酸微溶盐的物质是碳酸钙。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中在步骤(1)过程中对于葡萄糖氧化酶/异构酶两种酶的所述有效量和所述的一段时间是这样的，以致于：
(A)：葡萄汁中的糖含量减少至少10％。
8.权利要求7的方法，其中葡萄汁中的糖含量减少至少17％。
9.权利要求7的方法，其中
-所述的一段时间不超过72小时；并且
-对于葡萄糖氧化酶/异构酶两种酶的有效量为：
(i)：在1,000和50,000,000国际单位每hl葡萄汁之间的葡萄糖氧化酶活性；和
(ii)：在100和5,000,000国际单位每hl葡萄汁之间的葡萄糖异构酶活性；和
-在权利要求1步骤(1)过程中的温度在1和35℃之间。
10.权利要求8的方法，其中
-所述的一段时间不超过72小时；并且
-对于葡萄糖氧化酶/异构酶两种酶的有效量为：
(i)：在1,000和50,000,000国际单位每hl葡萄汁之间的葡萄糖氧化酶活性；和
(ii)：在100和5,000,000国际单位每hl葡萄汁之间的葡萄糖异构酶活性；和
-在权利要求1步骤(1)过程中的温度在1和35℃之间。
11.权利要求9或10的方法，其中在权利要求1步骤(1)过程中的温度在3和30℃之间。
12.权利要求1-6任一项的方法，其中在权利要求1步骤(1)过程中向葡萄汁持续供应氧。
13.权利要求12的方法，其中用空气泵供应氧。
14.权利要求1-6任一项的方法，其中在权利要求1的步骤(1)中葡萄汁还以有效量的具有过氧化氢酶活性的制剂处理一段足以将葡萄汁中的至少部分H2O2转化成O2+H2O的时间。
15.权利要求1-6任一项的方法，其中在权利要求1的步骤(2)的酵母酒精发酵过程中加入额外的葡萄糖异构酶。
16.权利要求1-6任一项的方法，其中葡萄酒是白葡萄酒、红葡萄酒、无气葡萄酒或含气葡萄酒。
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