CN101921793A - 人载脂蛋白ai的基因工程制备方法及其表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效可溶性人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，及其表达载体和工程菌。其中选用含有重组人载脂蛋白AI基因序列的质粒pCold为融合表达载体，ApoA1编码序列位于pCold载体上Nde I和Hind III酶切位点之间。所用的基因工程菌为大肠杆菌，并经本发明所述的表达载体质粒pCold转化为pCold-ApoA1/Rosetta-gami，在10-20℃下低温培养即可诱导表达可溶性目的蛋白。本发明并使用了镍交联亲和柱一步法，操作简便、得率高、耗时短，得到的目的蛋白纯度大于90％，适用于工业化大规模生产。

Description

人载脂蛋白AI的基因工程制备方法及其表达载体和工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域的生产蛋白质或多肽的DNA重组技术领域，特别是，涉及人载脂蛋白AI(ApolipoproteinI，ApoAl)的基因工程制备方法，及其相关的表达载体和工程菌。

背景技术

随着人民生活水平的提高，冠状动脉粥样疾病的发病率显著增高，目前已成为危害人类健康的三大疾病之一。据***卫生组织2002年研究报告，全球约三分之一的病人死亡与心血管疾病(cardiovasculardisease)有关。其中，动脉粥样硬化性心血管病首当其冲。动脉粥样硬化主要损伤动脉内壁，这是由于膜胆固醇酯在中膜脉管壁的大量堆积形成粥样硬化斑块，使血管壁纤维增厚并导致动脉病变。其主要发生于大动脉和中等动脉，如主动脉、冠状动脉和脑动脉，导致某些脏器的局部供血不足，因而出现心脑血管疾患，如冠心病、心肌梗塞、中风等，极易引起致命性损伤。

不溶性的脂类在血浆中是作为可溶性的脂蛋白颗粒而运输的。脂蛋白颗粒含有一个疏水性的胆固醇脂和甘油三脂核心，外表面包裹着单层的双性磷脂分子，结合着游离胆固醇和载脂蛋白。载脂蛋白(apolipoprotein，Apo)是一类能与血浆脂质(主要是指胆固醇、甘油三脂和磷脂)结合的蛋白质，为构成血浆脂蛋白的主要成份。载脂蛋白在肝脏和小肠粘膜细胞中合成。目前已报道的载脂蛋白有二十余种。载脂蛋白在分子结构上具有一定特点，往往含有较多的双性α一螺旋结构，表现出两面性，螺旋的一侧极性较高可与水溶剂及磷脂或胆固醇极性区结合，构成脂蛋白的亲水面；而另一侧极性较低可与非极性的脂类结合，构成脂蛋白的疏水核心区。载脂蛋白在参与脂类核心代谢反应的酶中充当辅助因子，并且作为识别因子而调控脂蛋白的分泌和摄入。载脂蛋白可分为载脂蛋白A(ApoA)，载脂蛋白B(ApoB)，载脂蛋白C(ApoC)和载脂蛋白E(ApoE).其中载脂蛋白A又可分为载脂蛋白AI(也称为ApoA1)、载脂蛋白AII和载脂蛋白AIV。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要并且复杂的生理功能，不论是质或量的改变，都会引起脂蛋白代谢异常。国内外大量临床资料显示，心血管患者体内的载脂蛋白水平与病情有很大的相关性。目前临床上主要检测载脂蛋白AI，载脂蛋白B两种，其两者分别被认为是动脉粥样硬化的保护因素和危险因素。因此测定其含量和比值为动脉粥样硬化及心血管疾病的判定、预测提供了有价值的指标，具有重要的诊断和预防意义。

载脂蛋白AI在肝脏和小肠粘膜细胞中合成。它是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-CHOL)的主要结构蛋白，占HDL-CHOL总蛋白的60％～70％，载脂蛋白AI的测定可直接反映HDL-CHOL的水平。载脂蛋白B也由肝脏合成，是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-CHOL)的主要结构蛋白，约占LDL-CHOL总蛋白含量的97％，载脂蛋白B的测定可直接反映LDL-CHOL的水平。即对载脂蛋白AI与载脂蛋白B的检测可分别直接反映HDL与LDL的含量与功能。并且它们的比值与动脉粥样硬化有密切关系，可作为判断心血管疾病危险性大小的指标。血浆中HDL和载脂蛋白AI的含量与冠状动脉疾病(Coronary artery disease，CAD)的发生呈负相关性，即HDL和ApoA1含量越高，CAD的发病率越低。

载脂蛋白AI是参与细胞胆固醇逆向转运(RCT)的重要因素。载脂蛋白AI能与磷脂、多种血浆因子及细胞膜受体结合，激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移从而调节HDL的代谢。相较于其他的各种HDL亚类，载脂蛋白AI空间结构有较大差异，有研究表明这与HDL成熟过程及运载胆固醇等生理功能密切相关。

人体内的载脂蛋白AI蛋白分子为243个氨基酸残基组成的肽链，分子质量为28.3KD，无糖基化修饰，具较强的疏水性。它主要含有8个由22个氨基酸构成的重复片段和2个由11个氨基酸组成的重复片段。这些重复片断形成两性α螺旋，相互之间被脯氨酸残基间隔。当有磷脂存在时，带电荷的残基面朝水相，非极性残基则面朝磷脂双层链。在许多重复片段的亲水面存在多个影响螺旋结构稳定性的氨基酸(DERKG)，这可能有利于载脂蛋白AI在和脂质相互作用过程中产生构象变化。载脂蛋白AI相互间容易形成二聚体以利于蛋白的稳定。但是研究发现，当蛋白浓度低于0.1mg/mL时，载脂蛋白AI均以单体形式存在。与其它形式的载脂蛋白AI相比，游离的载脂蛋白AI结构相对松散，其螺旋程度只有40-50％，而当周围有脂质存在时，蛋白暴露的疏水区能迅速与脂类相互作用，螺旋程度可提高到75％。

研究表明载脂蛋白AI蛋白还具有抗氧化、抗凝抗炎作用，并能调节细胞粘附分子的表达、介导细胞内信号传导等功能，对保护人体动脉管壁具有十分重要的意义。目前对冠状动脉粥样疾病发生的确切机制虽然还存在争议，但载脂蛋白AI能治疗并预防冠状动脉粥样疾病的事实却受到学术界的高度重视。大量的动物和临床试验已证明，目前通过基因工程获得的重组人载脂蛋白AI结构与功能和天然载脂蛋白AI相似，其不仅能防止动脉粥样硬化的发生和发展，而且能逆转病变，更可贵的是临床研究也未见明显的毒副反应。因此，重组载脂蛋白AI有可能成为治疗和预防动脉粥样硬化的理想药物，具有广阔的临床应用前景。因而研发一种适合大规模生产重组ApoA1蛋白的方法具有很高的经济和社会价值。

虽然制备人载脂蛋白AI方法已有报道，但这些方法均有不尽人意之处。如从人血浆中制备载脂蛋白AI，面临着产量低、步骤多、成本高等缺点。这些缺点限制了其作为靶向药物的规模化生产。因此，研发一种新的、有效的、产量高、适合大规模生产的制备重组人载脂蛋白AI蛋白的方法具有很高的迫切性和重要性。在各类通过基因工程表达体外重组蛋白的表达***中，最常见的是应用大肠杆菌原核表达***。但是在常用的37℃大肠杆菌表达过程中，载脂蛋白AI的mRNA极不稳定，表达的重组载脂蛋白AI成熟蛋白很容易被降解。有报道在用此常规的大肠杆菌表达***表达载脂蛋白AI蛋白时，由于上述原因导致产量较低，只能达到4mg/L培养菌液，不适合高效地、大规模地生产重组载脂蛋白AI蛋白。而运用其它表达***如酵母，昆虫细胞及哺乳动物细胞表达***均存在表达过程较复杂、表达成本高，并且表达量低、纯化步骤繁琐等缺点，同样不利于大规模生产。

本发明的人载脂蛋白AI的基因I程制备方法克服现有技术的多个技术缺陷，比如，本发明采用pCold表达载体，是一种被用来大量表达外源重组蛋白的载体，带有一个cspA启动子，在该启动子下游为乳糖操纵子。该载体在多种大肠杆菌宿主菌中经诱导后在10-20℃低温下大量表达外源重组蛋白。本发明利用其具有低温诱导表达外源重组蛋白的特性，有效克服了载脂蛋白AI的mRNA在大肠杆菌宿主菌中极不稳定、表达的成熟蛋白很容易被降解的技术难题。在特定的大肠杆菌宿主菌(Rosetta-gami)中实现了高效表达重组人载脂蛋白AI蛋白，在一升培养菌液中人载脂蛋白AI蛋白的表达量高达40mg以上，与现有技术报道的表达量比较，表达量提高了10倍之多。同时，利用本发明的镍交联亲和柱一步法蛋白制备工艺，使得整个过程操作简便、蛋白得率高、耗时短，目的蛋白纯度高，完全适用于工业化大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种可在大肠杆菌中表达，并能通过亲和柱高效制备重组可溶ApoA1的方法，及其相关的表达载体和工程菌。

本发明提供了一种人载脂蛋白AI的基因工程表达载体，该载体构建过程如附图1如示。该载体为含有人载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold，并且载脂蛋白AI编码序列位于pCold载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。载体pCold是一种被用来大量表达外源重组蛋白的载体，其带有一个cspA启动子，在该启动子下游为乳糖操纵子，这样的载体可在低温下启动表达外源基因。同时在其5‘端非转录区还含有翻译争强子(Translate enhancefactor，TEF)、多聚组氨酸靶标融合位点、凝血因子X酶切位点及多克隆位点。因此，该载体可在多种大肠杆菌宿主菌中，在低温条件下，经诱导后大量表达外源重组蛋白。本发明的表达可溶性人载脂蛋白AI重组蛋白的表达载体pCold，以及以cspA启动子低温诱导表达可溶性人载脂蛋白AI重组蛋白，在10-20℃下进行低温诱导表达，正是本发明的创新所在。

本发明还提供了一种基因工程菌，该基因工程菌为pCold-ApoA1/Escherichia coli，该宿主菌被含有人载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold所转化。本发明的宿主菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami，该宿主菌还可选用其他各种可被上述载体所转化的大肠杆菌表达宿主B121、B121(DE3)、L21(DE3)PlysS、Roesetta-gami、或KS1000。

本发明所用的pCold表达载体具有低温诱导表达特性，见于TARKAR公司的pCold载体说明书。至目前，尚未有文献公开报道有关任何低温诱导表达重组人载脂蛋白AI蛋白的资料。本发明首次创新地提出，可以利用低温诱导表达重组人载脂蛋白AI蛋白，利用pCold表达载体具有的低温诱导表达特性，突破性地克服了人载脂蛋白AI的mRNA在大肠杆菌宿主菌中的极不稳定性和表达的成熟蛋白很容易被降解的难题，使得重组人ApoA1蛋白产量大大提高。

通过本发明方法，可以从1L培养菌液中获得的最终得到的重组人载脂蛋白AI蛋白浓度测定经计算为3.7mg/ml，透析后得到的总体积为11ml。故，总蛋白得率约为40mg/升菌液，而美国专利US patent 5643757公开的大肠杆菌生产人重组载脂蛋白AI蛋白的方法，所得到的表达量仅为4mg/升菌液。比较可见，本发明方法的表达量高于其达10倍之多。

本发明还提供了一种克隆、表达、纯化人载脂蛋白AI的基因工程方法，通过基因重组技术体外表达，通过改良的镍亲和柱一步纯化法，纯化获得高纯度的可溶性的目的蛋白载脂蛋白AI，包括步骤如下：

(1)通过RT-PCR技术从人肝组织总RNA中扩增获得人载脂蛋白AI的cDNA；

(2)扩增人载脂蛋白AI基因并克隆到pCold载体中；

(3)培养和表达基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami；

(4)离心收集基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami；

(5)人载脂蛋白AI融合蛋白的亲和柱纯化；

(6)透析除盐，得到可溶性蛋白，经鉴定为目的蛋白。

本发明的人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，是以大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami为宿主菌，所述载体选用含有载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold，且载脂蛋白AI编码序列位于pCold载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。通过基因人工合成的方法，针对载脂蛋白AI的成熟肽进行克隆重组，去除了载脂蛋白AI前体蛋白N-端的信号肽，并在其N端加上6个多聚组氨酸(6x His)亲和多肽标签，构成ApoA1-6His融合蛋白，进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌。

本发明的人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其步骤(2)中，自人载脂蛋白AI基因cDNA的第73个核苷酸位置起开始设计以下引物：

上游引物：5‘AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT，

下游引物为：5’AT AAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA。

本发明的人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其步骤(3)中，基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami的经诱导后在10-20℃低温继续培养15小时。本发明首次揭示采用多聚组氨酸融合低温表达载体(pCold)在低温下(10-20℃)表达无信号肽ApoA1蛋白的技术方案，从而可以在大肠杆菌内稳定高效表达大量可溶的ApoA1蛋白，这一创新内容目前在国内外尚未见有其他报道。

本发明所述的“载脂蛋白AI前体蛋白”，是指由载脂蛋白AI cDNA编码，在细胞内合成的，未切除信号肽的ApoA1全长蛋白。本发明所述的“载脂蛋白AI的成熟肽”，是指在细胞内切除信号肽，及信号肽后7个氨基酸的成熟肽，其分泌到血清中，具有生物功能的载脂蛋白AI蛋白。

本发明的人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其步骤(5)中，所述融合蛋白为无信号肽的人载脂蛋白AI在其N端加上6个多聚组氨酸构成的蛋白。本发明此创新在于，利用融合蛋白N端的6个多聚组氨酸多肽标签，简便高效地纯化获得高纯度重组载脂蛋白AI，以利于后续的大量生产纯化工艺的开展。

本发明的人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其步骤(5)中，所述本发明的自主改良的“镍亲和柱一步纯化法”，是指只通过一根镍亲和柱，运用改良的特定洗脱方式，即，通过对亲和柱多次三种不同浓度咪唑洗涤液的洗涤，及对目的蛋白的两种不同浓度咪唑洗脱液的洗脱。洗脱方式如附图2所示。

本发明方法不需要依赖其他纯化方法及步骤，也不需要用其他试剂再做进一步的纯化，即可直接获得高纯度所需目的蛋白，所获得目的蛋白的纯度90％以上。纯化步骤简单，所得目的蛋白纯度很高，纯化全程时间较短，优选的纯化全程时间为4-6小时。在实验室规模(小于5升菌液的纯化规模)下，纯化优化全程时间与纯化的菌液体积关系为：纯化1升(1L)表达菌液，需4小时左右。

简要地说：本发明首先通过基因扩增及重组的方法，获得了人载脂蛋白AI成熟蛋白的cDNA并克隆至pCold表达载体上；然后在N-端加上多聚组氨酸(6x His)亲和肽标签以便镍亲和柱一步法纯化；进而选用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌，获得可溶的目的蛋白。

本发明的有益效果在于：(1)使用大肠杆菌Rosetta-gami，可以最大限度地防止重组载脂蛋白AI蛋白大量表达对宿主细胞的毒性，从而提高重组蛋白的产量。(2)本发明采用的pCold低温表达载体，避开了载脂蛋白AI的mRNA在大肠杆菌宿主菌中极不稳定、表达的成熟蛋白很容易被降解的问题，克服了载脂蛋白AI在大肠杆菌表达过程中mRNA和其表达产物-蛋白质的不稳定性；并且，低温表达的载脂蛋白AI蛋白为可溶性成熟蛋白，有利于得到载脂蛋白AI的高效表达；(3)以本发明方法修饰后表达的载脂蛋白AI为可溶性成熟蛋白，最大可能性地还原了该蛋白在体内的折叠结构，有利于保持其生物活性；(4)多聚组氨酸的使用可以简化该蛋白的纯化方法；(5)发明人自主改良的镍亲和柱一步纯化法工艺的应用，使得纯化方法进一步简化，且纯化得率很高。采用本发明的载脂蛋白AI制备方法，可以在1升工程菌液中获得高达40mg以上的可溶性重组载脂蛋白AI蛋白。

附图说明

图1：人载脂蛋白AI的基因工程表达载体的构建示意图；

图2：镍亲和柱一步纯化法的洗脱方式的示意图；

图3：人载脂蛋白AI基因的RT-PCR结果图谱；

图4：pCold-ApoA1重组表达质粒的酶切鉴定；

图5A：未经亲和柱纯化的不同表达宿主菌总菌裂解液电泳结果；

图5B：亲和柱纯化以后产物电泳的结果；

图6：蛋白印迹试验；

图7：纯化蛋白分子量的质谱分析。

图8：纯化蛋白多肽的质谱分析。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，来进一步阐述本发明。以下各实施例是为说明本发明而非为限制本发明范围。

实施例1人载脂蛋白AI的编码基因PCR扩增及重组表达质粒pCold-HuApoA1的构建：

1)目的基因的PCR扩增

①抽提总RNA：取病人新鲜肝脏组织，匀浆器粉碎后用RNA抽提试剂盒抽提总RNA

②RT-PCR：以总RNA为模版，运用反转录试剂盒，得到人载脂蛋白AI的eDNA.

③目的基因的PCR扩增：根据基因库中公布的人载脂蛋白AI序列设计一对引物，引物为：

上游引物：5‘AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT(NdeI)

下游引物：5’AT AAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA(HindIII)

参考已报道的人载脂蛋白AI序列，引物设计时从cDNA的第73个核苷酸开始，从而人为地去除了载脂蛋白AI的信号肽及前体肽部分。

采用以下PCR反应***和程序：

在一个200ul微量PCR反应管内加入以下试剂：

10XPCR缓冲液          5μl；

模版cDNA库            1μg；

dNTP                  1mM；

上下游引物各          100pM；

Taq酶                 2U；

加入去离子灭菌水至终体积50ul

反应条件为94℃5分钟，然后进入94℃30秒，48℃30秒，72℃30秒的40个扩增循环，最后72℃延伸10分钟。

琼脂糖电泳结果如图3所示，图3为人载脂蛋白AI基因的RT-PCR结果图谱；其中，Lanel：RT-PCR产物；M：1kb DNA标准DNA分子量maker。如图3所示，琼脂糖电泳结果条带在750-500bp之间，可以判断产物的分子量为720bp左右，与预期实验设计相符。

2)PCR产物克隆：

扩增得到的PCR片段，用PCR产物回收试剂盒回收，然后用双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒纯化后，直接定向连接到pCold载体上，将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切鉴定。琼脂糖电泳结果如图4所示，酶切片段大小与设计一致的，约为700个核苷酸的酶切片段为阳性克隆。图4为pCold-ApoA1重组表达质粒的酶切鉴定；其中，M：DNA ladder；1-14：双酶切鉴定的不同克隆质粒，限制性内切酶为NedI、HindlII；酶切片段大小为700bp，与从核苷酸序列推断的***片段大小吻合。(以上常规实验方法，见Sambrooks等编著的《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社1998年出版。)

3)DNA序列测定

①将阳性克隆进行DNA序列测定，其测序结果如序列1：SEQ NO.1所示，该序列已除去信号肽序列部分。

②将阳性克隆的DNA测序结果，与其基因库已报道人载脂蛋白AI序列的比较(NM_000039)，两者是一致的，如序列2：SEQ NO.2所示。

③根据以上DNA测序结果，重组人载脂蛋白AI的氨基酸序列如序列3：SEQ NO.3所示。

实施例2基因重组菌的大规模表达及纯化方法

1)重组人ApoA1-多聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌宿主中的表达

①将pCold-ApoA1转化到Rosetta-gami大肠杆菌中在带有氨苄霉素抗性(100ng/ml)的LB培养板上，37℃培养过夜

②挑取一个单菌落在50ml含有100微克/毫升氨苄霉素的LB培养中37℃250转/分钟，培养过夜

③2％接种培养到1L 2YT培养基中(包括100ug/ml氨苄霉素)，37℃to A600，0.D.0.5

④将培养温度降至10-20℃，让菌液继续培养30分钟

⑤加入IPTG至终浓度1mM 10℃，300转/分钟诱导培养15hours

⑥高速离心4000rpm 20分钟，收集沉淀并保存在-80℃

2)纯化重组人载脂蛋白AI-多聚组氨酸融合蛋白的试剂

A、试剂：

①裂解液：50mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

②洗涤液1：50mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

③洗涤液2：50mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，20mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

④洗涤液3：50mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，30mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

⑤洗脱液1：50mM Tris-HCl Ph 8.0，150mM NaCl，100mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

⑥洗脱液2：50mM Tris-HCl Ph 8.0，150mM NaCl，300mM imidazole，1mM PMSF，5mM 2-Me

B、纯化步骤：

(1)将1升2YT培养基表达人载脂蛋白AI重组融合蛋白的大肠杆菌悬浮在50ml裂解液中

(2)在冰上超声4-5次，30秒/次，

(3)10000g高速离心15分钟

(4)取上清再10000g高速10分钟

(5)取上清上柱到5ml镍柱中

(6)用50ml洗涤液1清洗镍柱

(7)用50ml洗涤液2清洗镍柱

(8)用50ml洗涤液3清洗镍柱

(9)用6ml洗脱液1从镍柱上洗脱目的蛋白，每11滴收集一个试管

(10)用6ml洗脱液2从镍柱上洗脱目的蛋白，每11滴收集一个试管

(11)将洗脱的样品混合在一起，并用1XPBS，4℃透析三次过夜

(12)将透析好的样品保存在-80℃

实施例3重组蛋白的证明(15％的SDS-丙稀酰胺凝胶电泳和蛋白印迹法)

详细步骤：

1)15％的SDS-丙稀酰胺凝胶，通过Tris-glycine缓冲液，90V电压，3小时电泳，检测最终获得的重组蛋白。检测结果为该特异条带与人载脂蛋白AI分子量相符。

图5A是亲和柱纯化以前不同表达宿主菌的总菌裂解液电泳的结果。如电泳结果所示，经含有人载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold所转化的宿主菌BL21(DE3)PlysS，Roesetta-gami，KS1000，分别经IPTG诱导后，与IPTG诱导前的样品相比，在30KD左右可见一条明显的诱导蛋白差异条带，与预期人重组ApoA1蛋白分子量相符。如图5A所示，E.coli该类宿主菌种均可成功表达重组人ApoA1蛋白。图5A为未经亲和柱纯化的不同表达宿主菌总菌裂解液电泳结果；15％SDS-PAGE检测最终获得的重组蛋白；其中，M：标准蛋白；1：IPTG诱导前BL21(DE3)PlysS总菌裂解液；2：IPTG诱导后BL21(DE3)PlysS总菌裂解液；3，IPTG诱导前Roesetta-gami总菌裂解液；4：IPTG诱导后Roesetta-gami总菌裂解液；5，IPTG诱导前KS1000总菌裂解液；6：IPTG诱导后KS1000总菌裂解液。(不同宿主菌中重组质粒转化方法均相同，详细见Sambrooks等编著的《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社1998年出版)。

图5B是经含有人载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold所转化的宿主菌Roesetta-gami经IPTG诱导后的菌液，经继续纯化后所获得人载脂蛋白A的蛋白条带，该蛋白分子量大小约为30kD，电泳结果表明该纯化产物纯度很高，与预期的蛋白分子量大小相符。因此，从分子大小上判断该纯化产物为人载脂蛋白AI蛋白。图5B为亲和柱纯化以后产物电泳的结果；其中，1：为亲和柱纯化产物；M：标准蛋白。

2)在15％丙稀酰胺胶，90V，3小时电泳后，通过Tris-glycine缓冲液将丙稀酰胺上的蛋白片段电转到PVDF膜上，条件为1Xtris-glycine缓冲液，20％甲醇，70V电压下，室温转移3小时。

①将电转后的PVDF膜取出，用1X PBST清洗30分钟

②用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭45分钟

③用1X PBST漂洗PVDF膜3次，10分钟/次

④加入含1∶2000稀释的抗人ApoA1抗体的PBST 8mL，室温反应1小时

⑤用1X PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次

⑥加入含1：1000稀释的抗小鼠的抗体，室温反应40分钟

⑦用1X PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次

⑧用含0.3％H202和6mg二氨基联苯胺的显色液，显色1分钟。

实验结果如图6所示，经蛋白印迹法验证所得蛋白与已知抗人载脂蛋白AI商业化抗体呈特异性反应，因而，判断所得蛋白为人载脂蛋白AI。图6为蛋白印迹试验；其中，Lane 1：IPTG诱导以前总菌裂解液；Lane 2：IPTG诱导以后总菌裂解液；Lane 3：镍柱纯化后的产物；Lane M：标准蛋白。

实施例4纯化蛋白分子量的质谱分析

该实验委托浙江理工大学完成，具体实验方法见仪器操作手册。人载脂蛋白AI分子量为28KD，本发明的重组人载脂蛋白AI-his tag蛋白分子量大小约为30KD，图7所示的大峰为单一的重组载脂蛋白AI，小峰为重组载脂蛋白AI二聚体。实验结果如图7所示，表明所得目的蛋白的分子量除去his-tag后与人载脂蛋白AI分子量一致，可以判断所得目的蛋白为人载脂蛋白AI-his。

实施例5纯化蛋白多肽的质谱分析

该实验委托浙江理工大学完成，详细操作步骤见质谱仪器说明书。通过对纯化产物的肽段分子量及氨基酸组成分析，并与已知的多肽数据库进行比较；得出的结论为该纯化产物是人载脂蛋白AI蛋白。实验结果如图8所示，经多肽的氨基酸分析确认所得蛋白为人载脂蛋白AI。

序列表

<110>德赛诊断***(上海)有限公司

<120>人载脂蛋白AI的基因工程制备方法及其表达载体和工程菌

<160>3

<210>1

<211>735

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTGGGATCGAGTGAAGGACCTGGCCACTGTGTACGTGGATGTGC

TCAAAGACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAAGGCTCCGCCTTGGGAAAACAGCTAAACCTA

AAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGT

GACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGAT

CTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGA

TGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGC

TGCACGAGCTGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATG

TGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCC

TTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCT

GAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCT

GGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTGA

<210>2

<211>731

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

扩增序列  4GATGAACCCCCCCAGAGCCCCTGGGATCGAGTGAAGGACCTGGCCACTGTGTACGTGGAT  63

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报道序列111GATGAACCCCCCCAGAGCCCCTGGGATCGAGTGAAGGACCTGGCCACTGTGTACGTGGAT 170

扩增序列64 GTGCTCAAAGACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAAGGCTCCGCCTTGGGAAAA 123

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报道序列171GTGCTCAAAGACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAAGGCTCCGCCTTGGGAAAA 230

扩增序列124CAGCTAAACCTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTG 183

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报道序列231CAGCTAAACCTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTG 290

扩增序列184CGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAG 243

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报道序列291CGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAG 350

扩增序列244GGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTAC 303

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报道序列351GGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTAC 410

扩增序列304CTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAG 363

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报道序列411CTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAG 470

扩增序列364CCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAG 423

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报道序列471CCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAG 530

扩增序列424CTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGC 483

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报道序列531CTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGC 590

扩增序列484ACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCT 543

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报道序列591ACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCT 650

扩增序列544CTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTG 603

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报道序列651CTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTG 710

扩增序列604AGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCC 663

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报道序列711AGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCC 770

扩增序列664GTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTC 723

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报道序列771GTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTC 830

扩增序列724AACACCCAGTGA 735

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报道序列831AACACCCAGTGA 842

<210>3

<211>255

<212>氨基酸序列

<213>人工序列

<400>3

MNHKVHHHHHHMDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLN

LKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQP

YLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARA

HVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPAL

EDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

Claims (9)

1.一种人载脂蛋白AI(ApoA1)的基因工程表达载体，其特征在于，该载体为含有人载脂蛋白AI基因序列的质粒载体pCold，并且载脂蛋白AI编码序列位于pCold载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。

2.一种基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌为pCold-ApoA1/Escherichia coli，宿主菌是大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、Roesetta-gami、或KSi000，并被权利要求1所述的表达载体所转化。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为pCold-ApoA1/Rosetta-gami。

4.一种人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过RT-PCR技术从人肝组织总RNA中扩增获得人载脂蛋白AI的cDNA；

(2)扩增人载脂蛋白AI基因并克隆到pCold载体中；

(3)培养、表达如权利要求3所述的基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami；

(4)离心收集基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami；

(5)人载脂蛋白AI融合蛋白的亲和柱纯化；

(6)透析除盐，得到可溶性目的蛋白。

5.如权利要求4所述人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，在步骤(2)中自所述人载脂蛋白AI基因cDNA编码的第一个氨基酸的核苷酸起第73个核苷酸的位置起设计引物；

其中，上游引物：5‘AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT，

下游引物为：5’AT AAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA。

6.如权利要求4所述人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，基因工程菌pCold-ApoA1/Rosetta-gami在生长到对数期O.D.值为0.4-0.8左右时加入IPTG后，对宿主菌进行10-20℃的低温诱导培养10-15小时；然后收集表达菌。

7.如权利要求4所述人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述融合蛋白为无信号肽的人载脂蛋白AI在其N端加上6个多聚组氨酸构成的蛋白。

8.如权利要求4所述人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述亲和柱纯化时采用不同梯度咪唑浓度的洗脱方式。

9.如权利要求8所述人载脂蛋白AI的基因工程制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述亲和柱纯化时采用的洗涤液为10mM咪唑、20mM咪唑、30mM咪唑；洗脱液为100mM咪唑、300mM咪唑。

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