CN104862283A

CN104862283A - 一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104862283A
Application number: CN201510157324.0A
Authority: CN
Inventors: 向军俭; 杨全利; 黄建芳
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Purui Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: CN104862283B

Abstract

本发明公开了一对分泌高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3M4和5M7（均于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC C201529和CCTCC C201530），以及其分泌的单克隆抗体3M4和5M7。该对抗体具有高特异性和高亲和力，能特异性结合人肌红蛋白的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血清中肌红蛋白的定量检测，具有很好的检测特异性和灵敏度。检测灵敏度与进口试剂盒相近，而本发明建立的双抗体夹心Elisa方法具有更大的线性范围，可在临床上用于人血清中肌红蛋白的检测，对心肌梗塞的早期诊断具有重要的指导意义，具有商业应用价值。

Description

一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

一直以来，心血管疾病，特别是急性心肌梗塞（AMI）是严重影响人类健康的罪魁祸首，一旦心肌梗塞发作，如果在短时间内得不到明确的诊断和有效的治疗，人心肌就会因为缺血缺氧而造成不可逆的坏死。因此，急性心肌梗塞早期及时正确的诊断对降低死亡率来说显得尤为重要。血清心肌损伤标志物的发现为急性心肌梗塞的诊断提供了重要的依据。

利用心肌损伤标志物进行急性心肌梗塞的诊断已经有50多年的历史，大致经历了三个重要的发展阶段。在上个世纪的50至60年代，门冬氨酸氨基转化酶（AST) 、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）是急性心肌梗塞检测的主要指标，随后在70至80年代发现了心脏特异性更高的肌酸激酶同功酶（CK-MB），到了90年代初期，肌红蛋白、肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T（TnT）的发现与应用则成为了急性心肌梗塞诊断更特异、更敏感的检测指标。作为一种理想的心肌损伤标志物应该具备以下一些优点：（1）在心肌细胞内高浓度，而在其他组织细胞中不存在或少量存在的物质；（2）在心肌细胞有轻微损伤时就能立刻释放入血，并能用目前的检测手段检测出来；（3）能够检测早期心肌损伤，并且窗口期较长；（4）能估计梗死范围大小判断预后，并能评估溶栓效果等。肌红蛋白由于存在于心肌细胞细胞质中，并且分子量小，是急性心肌梗塞发生后最早释放到血液中的心肌损伤标志物，使得疾病的及时诊断成为可能。另外由于其在血液中半衰期很短，所以是推测心梗面积和判断溶栓疗效的重要指标。如果胸痛后8h，肌红蛋白水平仍然处于正常值，那么可以排除AMI的可能性，阴性排除率为100%。虽然由于其在骨骼肌中也大量存在，肾脏***功能异常的疾病也可能引起肌红蛋白含量的升高，其特异性并不是特别高，但是结合肌钙蛋白、肌酸激酶等其他特异性较高的指标则能显著提高其诊断价值。因此，综合考虑，肌红蛋白是一个非常好的急性心肌梗塞的诊断标志物。

目前，临床上主要是采用以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法来检测肌红蛋白，这其中双抗体夹心Elisa由于其灵敏度高、特异性强，适用于同时检测多个样本，并且操作简单，不需要特殊的仪器设备等优点而得到广泛应用。目前国外已经成功开发出了能用于检测人肌红蛋白的双抗体夹心Elisa试剂盒，但是开发出能与进口试剂盒媲美的国产试剂盒、打破国外产品的垄断，仍然是国产试剂盒研发的努力方向。用于双抗体夹心Elisa的抗体除了具备高特异性、高亲和力之外，还要能识别同一抗原的不同表位。另外两株抗体除了与免疫原有反应之外，还要能与样本中的天然抗原起反应。因此，制备的单克隆抗体的质量是成功研发双抗体夹心Elisa试剂盒的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中肌红蛋白检测技术存在的缺陷和不足，提供一对靶向人肌红蛋白（Human Myoglobin）不同表位的鼠源性单克隆抗体，该对抗体能高亲和力、高特异性的结合人肌红蛋白的不同表位，并形成双抗体夹心模式，从而能够对肌红蛋白进行定量检测。

本发明的目的是提供一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体。

本发明另一目的是所述高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种分泌高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3M4，于2015年3月25日保藏于中国. 武汉. 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201529。

一种分泌高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5M7，于2015年3月25日保藏于中国. 武汉. 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201530。

一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体3M4和5M7，分别由上述杂交瘤细胞株3M4和杂交瘤细胞株5M7分泌得到。

其中，所述单克隆抗体3M4和5M7的可变区基因均包括重链可变区基因和轻链可变区基因；单克隆抗体3M4的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；单克隆抗体5M7的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述单克隆抗体3M4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述单克隆抗体5M7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

上述单克隆抗体3M4和5M7在检测人血清中肌红蛋白方面的应用，以及在制备检测人血清中肌红蛋白的试剂或试剂盒方面的应用，均在本发明的保护范围之内。

一种检测人血清中肌红蛋白的双抗体夹心ELISA方法，是以上述单克隆抗体3M4作为检测抗体，以单克隆抗体5M7作为捕获抗体建立的。

优选地，所述双抗体夹心ELISA方法的步骤如下：

S1.用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释捕获抗体5M7至包被浓度为2.5μg/ml，4℃包被过夜；

S2.用PBST洗涤3次后，采用5%脱脂奶粉或2% BSA进行封闭，封闭条件为37℃，1h；

S3.加入80μl用样本稀释液两倍稀释的待检测血清样本，随后加入120μl HRP标记的检测抗体3M4（HRP标记的检测抗体3M4用低交叉反应稀释液稀释至工作浓度0.5μg/ml），37℃反应1h；

S4.用PBST洗涤五次，每次3min，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD450值。

其中，本发明实施例中所用的样本稀释液和低交叉反应稀释液购自德国Candor Bioscience公司。

同时，以上述双抗体夹心ELISA方法为基础建立的检测人血清中肌红蛋白的试剂盒也应在本发明的保护范围之内。

另外，对所得抗体的序列和结构分析可知，所述单克隆抗体3M4的重链可变区由348个碱基组成，编码116个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码6个氨基酸，CDR2编码19个氨基酸，CDR3编码8个氨基酸（如附图1所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达91.8%，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体3M4的轻链可变区由309个碱基组成，编码103个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码12个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码7个氨基酸（如附图2所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为95.7%，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体5M7的重链可变区由357个碱基组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码16个氨基酸（如附图3所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达83.3%，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体5M7的轻链可变区由324个碱基组成，编码108个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码15个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码6个氨基酸（如附图4所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为92.9%，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

上述两株抗人肌红蛋白单克隆抗体蛋白的功能由抗体轻、重链可变区抗原互补决定族（complementarity determing regions CDRs）CDR1、CDR2、CDR3（是本发明的功能活性区）中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性结合人肌红蛋白上的不同表位。

本研究通过大量的研究和探索，得到了13株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，其中3M4和5M7这两株高特异性、高亲和力的抗体能形成配对，且5M7/HRP-3M4这个配对组合有较高的灵敏度和较大的线性范围；利用最佳配对组合5M7/HRP-3M4建立标准曲线，以3M4作为检测抗体，5M7作为捕获抗体建立了双抗体夹心Elisa方法，其线性范围为25ng/ml-1000ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围25ng/ml-500ng/ml。

样本检测结果显示，本发明的双抗体夹心Elisa方法对人肌红蛋白的阳性检出率为95%（19例/20例），阴性检出率为100%（40例/40例），因此可以明确，本发明得到了2株高特异性，高亲和力的抗人肌红蛋白单克隆抗体，可用于夹心Elisa试剂盒的研制。

另外，本发明应用主要是检测血清中的一个指标，即肌红蛋白，检测的直接结果是血清中肌红蛋白的有无或含量多少，不直接涉及疾病的诊断。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一对能特异性结合人肌红蛋白的鼠源性单克隆抗体3M4和5M7，该对抗体能特异性结合人肌红蛋白的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血清中的肌红蛋白的定量检测，可在临床上用于人血清中肌红蛋白的检测，对心肌梗塞的早期诊断具有重要的指导意义。

以3M4作为检测抗体，5M7作为捕获抗体建立的双抗体夹心Elisa方法具有很好的检测特异性和灵敏度。检测灵敏度与进口试剂盒比较相近，而本发明建立的双抗体夹心Elisa方法具有更大的线性范围，具有推广应用的商业价值。

附图说明

图1为3M4抗体重链可变区3个CDR（互补决定簇）区

图2为3M4抗体轻链可变区3个CDR（互补决定簇）区。

图3为5M7抗体重链可变区3个CDR（互补决定簇）区。

图4为5M7抗体轻链可变区3个CDR（互补决定簇）区。

图5为9株抗人肌红蛋白纯化抗体的SDS-PAGE分析，M为蛋白Marker，泳道1为2M1，2为3M4，3为5M7，4为10D4，5为2M5，6为5M11，7为2M11，8为10M1，9为3M7。

图6为鼠源抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7纯化的SDS-PAGE检测结果图；1号泳道为Marker，2号泳道为变性条件下纯化后3M4单抗，3号泳道为变性条件下纯化后5M7单抗。

图7为鼠源抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7亲和纯化后的效价检测ELISA结果图。

图8为抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7 的亲和力曲线。

图9为两株鼠源抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7亲和纯化后的特异性鉴定Western Blot结果图。

图10为本发明以抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7为基础建立的双抗体夹心ELISA试剂盒与进口试剂盒的的标准曲线对比结果图。

图11为鼠源抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4经HRP标记过后效价的ELISA检测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 抗原的制备

人肌红蛋白（Human Myoglobin），从ABCam公司购买，货号ab77876，其浓度为2.4mg/mL，为天然的人肌红蛋白分子，分子量为16.7kDa，由154个氨基酸残基组成。人肌红蛋白的主要功能是在肌细胞内转运和储存氧气，当心肌梗塞发生时，是最早出现在血液中的标志物之一。

实施例2单克隆抗体的制备

1、本实施例所用材料

（1）试剂及动物：人肌红蛋白标准抗原、抗人肌红蛋白标准抗体、人肌红蛋白Elisa检测试剂盒均购自ABCam公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，PRMI1640 培养基、胎牛血清、HAT、HT、聚乙二醇(PEG，Mw4000) 均为美国Gibco公司产品；低交叉反应稀释液和酶标抗体保护液均购自德国Candor Bioscience公司；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)为本实验室传代保存；SPF级BALB/c纯系雌性小鼠，鼠龄6～8周，购自南方医科大学动物中心；辣根过氧化物酶标记试剂盒（A型、B型）购自泰天和生物技术有限公司；正常人血清和病人血清取自广州华侨医院检验科。

（2）仪器 Multiskan MK3 酶标仪、BB15 型CO2培养箱均为美国Thermo Fisher 公司产品；Milli-Q AdvantageA10超纯水仪是美国Millipore公司产品；高速冷冻离心机为eppendorf为公司产品；Protein G亲和层析柱为GE公司产品。

2、动物免疫

（1）初次免疫：30μg抗原加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射；

（2）二次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射；

（3）三次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射（10天后尾静脉采血测其效价）；

（4）加强免疫：三次免疫效价达到细胞融合要求后，用初次免疫同样的抗原量不加佐剂进行腹腔注射；

（5）72h后取脾脏融合。

3、细胞融合

（1）饲养细胞的制备：取一只健康的Balb/c小鼠，摘眼球采血，待血放干净以后，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用5mL注射器注射10 ml RPMI1640基础培养基（RPMI Medium 1640 basic，gibco购买，货号8114056，使用前加入青霉素与链霉素，加入量为每100ml培养基加入1ml含100U的青霉素与链霉素双抗）到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的无菌10ml离心管中，1000rmp离心7分钟，用10%胎牛血清RPMI 1640（含HAT）完全培养基重悬，稀释约为2×105个/ml,随后加入到96孔板中，每孔100μl,置于细胞培养箱（37℃，5%CO2）中备用。

（2）取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640基础培养基洗涤，吹悬稀释后计数；

（3）取小鼠脾脏，RPMI1640基础培养基洗涤、碾磨制备单个脾细胞悬液，计数；

（4）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，1000rpm离心7min；

（5）弃上清，用滴管吸尽残余液体，在37℃水浴条件下1min内逐滴加入1mL的聚乙二醇（PEG），静置90秒，2～4min内逐滴加入15mL RPMI 1640基础培养基终止反应；

（6）1000rpm离心7min，弃上清，用100mL 10%胎牛血清RPMI 1640（含HAT）轻轻混悬；滴加于预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5%CO2培养箱内培养。

4、融合细胞的筛选与克隆化

（1）于细胞融合后第7天左右取细胞培养上清，用包被有30ng/孔人肌红蛋白的ELISA板进行间接ELISA检测，筛选阳性孔；用免疫小鼠融合前取的血清作为阳性对照，用SP2/0上清作为阴性对照。最终筛选出13株阳性细胞株，分别命名为2M1、3M4、5M7、10M4、2M5、5M11、2M11、10M1、3M7、10M6、4M8、10M8、1M3。

（2）将筛选到的阳性孔杂交瘤进行有限稀释法第一次克隆化，经间接ELISA检测过后，挑取阳性值高的单克隆孔再经过多次亚克隆筛选，直到所有的单克隆孔均为阳性，即得到稳定分泌抗人肌红蛋白单克隆抗体的13株杂交瘤细胞株，将所得到的细胞株建株冻存。

选取13株阳性细胞株中上清效价较高的9株细胞，采用小鼠体内诱生法进行腹水型抗体的制备，采用饱和硫酸铵法对抗体进行粗纯后再用Protein G亲和层析柱进行进一步纯化，具体方法如下。

5、腹水型单克隆抗体的制备

（1）取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；

（2）1周后于小鼠腹腔接种约5*105个杂交瘤细胞，细胞接种7～12天后可诱生腹水；

（3）待腹水尽可能多时抽取腹水；

（4）间隔1～2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm 离心10min，取上清置于-20℃保存。

6、单克隆抗体的纯化

（1）取腹水4℃ 12000rpm离心30min，取上清；

（2）持续搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜；

（3）过夜后的液体于7500rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.1M PBS复溶；

（4）将复溶液用脱盐柱进行脱盐处理，具体操作步骤如下：

①平衡柱子：用0.1M PBS（5～10倍柱体积），平衡柱子，冲出柱内20%乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，上样完毕后持续通入0.1M PBS，当A值开始上升时，收集液体（目的蛋白），当A值下降到10以下时停止收集。收集的样本继续进行下一步的纯化。

③平衡柱子：当A值为“0”时，用0.1M PBS （5倍以上柱体积）过柱；

④保存：用20%乙醇（5倍柱体积）过柱子，保存柱子。

（5）Protein G亲和层析柱纯化脱盐后的蛋白，纯化步骤如下：

①装柱平衡柱子：用0.1M PBS（5～10倍柱体积），平衡柱子，冲出柱内20%乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，当A值开始上升时，收集液体（杂蛋白）防止蛋白质未结合上柱子，当样品即将上样完毕时加入0.1M PBS稀释，使蛋白质几乎完全上柱；

③洗脱：当A值降至“0”时，用洗脱液洗脱目的蛋白，当A值开始上升时收集液体（由于蛋白质带负电，呈弱碱性，收集管中预先加入一定量中和液，使收集液pH保持在7.0以上）；

④平衡柱子：当A值为“0”时，用0.1M PBS （5倍以上柱体积）过柱；

⑤保存：用20%乙醇（5倍柱体积）过柱子，保存柱子。

⑥蛋白质超滤浓缩后取少量进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度。

结果如附图5所示，可见重链和轻链条带，分别在50KD和25KD左右，并未见明显的其它条带，说明纯化效果较好，可以用于后续的实验。

其中，另外对单克隆抗体3M4和5M7纯化进行了纯化（后续实验发现，该对抗体进行配对最佳），纯化后SDS-PAGE检测结果如附图6所示，其它分装于-20℃保存。

7、对所得抗体的序列和结构分析可知，所制备得到的单克隆抗体3M4和5M7的可变区基因均包括重链可变区基因和轻链可变区基因；单克隆抗体3M4的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；单克隆抗体5M7的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述单克隆抗体3M4的重链可变区由348个碱基组成，编码116个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码6个氨基酸，CDR2编码19个氨基酸，CDR3编码8个氨基酸（如附图1所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达91.8%，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

实施例3单克隆抗体的特性鉴定

1、Ig类及亚类测定

采用市购的小鼠mAb分型试剂盒对经过亲和纯化的10株抗人肌红蛋白单克隆抗体进行Ig类及亚类鉴定，所有操作均严格依照试剂盒说明书操作。

结果如表1所示，其中，2M1、5M7、10M4、2M5和5M11均为IgG1，3M4和2M11为IgG2b，10M1和3M7为IgG3。

2、单抗效价测定

用间接Elisa对亲和纯化的9株抗体进行效价测定。

将人肌红蛋白标准抗原用包被液稀释为300ng/ml，每孔加入100μl，4℃孵育过夜。用PBST（吐温含量为0.05%)洗涤三次，每次3min，再用5%的脱脂奶粉37℃封闭1h,PBST洗涤三次，每次3min，拍干后放置-20℃备用。效价测定时，将抗体从1：10 000开始进行两倍比稀释。稀释后，每孔加入100μl,并用包被量为1μg/ml的人血红蛋白作为对照，37℃孵育1h。PBST洗涤3 次，每次3min,再加入8 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育40 min。PBST 洗涤5次，加入AB显色液，室温避光反应10 min后终止，酶标仪读取OD450值，取OD450值在1.0左右时抗体稀释倍数作为抗体效价。

结果如表1所示，2M1、3M4、5M7和10M4的效价均达到或超过了106，其中2M1的效价最高，达到了2.6×10⁶，并且所有的抗体与机构和功能相似的人血红蛋白并无明显的交叉反应，显示特异性良好。

表1 抗体特性鉴定

其中，单克隆抗体3M4和5M7亲和纯化后的效价检测ELISA结果图如附图7所示。

实施例4单克隆抗体的双抗体夹心配对实验

1、双抗体夹心初步配对实验

（1）选取亲和纯化后效价较高的6株抗体分别进行HRP标记和包被，分别做为检测抗体和捕获抗体，采用棋盘法双抗体夹心配对实验进行配对抗体的初步筛选。捕获抗体的包被浓度为10μg/ml，用碳酸盐缓冲液（pH9.6）进行包被，4℃孵育过夜后用PBST（含0.05%吐温）洗涤三次，3min/次，加入5%的脱脂奶粉37℃封闭1h后用PBST洗涤三次，3min/次，拍干后依次加入人肌红蛋白标准抗原（300ng/ml）和HRP标记的检测抗体，37℃孵育1h后，PBST洗涤五次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

（2）对于效价测定结果较高的6株抗体（10M4、2M11、2M5、5M7、3M4、2M1）分别进行包被和HRP标记，用于抗体配对实验。在双抗体夹心配对过程中，抗体针对相同或者相近的表位无法形成夹心配对，只有针对的两个表位不同并且相隔较远，才有可能形成配对。在加入抗原量相同的情况下，OD₄₅₀值越高，说明配对效果越好。本实验中，只要OD₄₅₀值高于0.3即认为可以进行夹心配对。

配对结果如表2所示，在36（6×6）种抗体配对组合中，有10种组合可形成双抗体夹心配对，其中，具有较好配对效果的共有3种组合：2M1/HRP-3M4、5M7/HRP-3M4、10M4/HRP-5M7。

表2 抗人肌红蛋白单抗配对抗体筛选

注：“+”表示能够进行配对（OD₄₅₀≥0.3），“—”表示不能进行配对（OD₄₅₀＜0.3）。

另外，在后续的实验中发现，无论是线性范围还是灵敏度上，5M7/HRP-3M4这个配对组合均优于其它配对组合，所以后续的实验主要采用这一配对组合来进行。

2、配对抗体亲和常数测定

（1）根据初步配对筛选结果以及后续的实验选出配对效果最好的两株抗体(5M7/HRP-3M4)，采用非竞争酶免疫实验测定3M4和5M7的亲和常数Ka值。参考G.P．S．Raghava 的方法【5】，按照公式Ka = ( n-1)/2( n［Ab'］t-［Ab］t) 计算亲和力常数Ka值。5M7的抗原包被梯度为300、75、18.75ng/ml，3M4的抗原包被梯度为300、150、75ng/ml,用人肌红蛋白标准抗原包被Elisa 板，再加入两倍比稀释的5M7/3M4，37℃ 孵育1h后，PBST洗涤3次，3min/次，拍干后加入1∶ 8 000 稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃ 孵育40min，PBST洗涤5次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD450值。以抗体浓度作为横坐标，OD450值为纵坐标作图，曲线上部平坦段的OD450值最大OD值，通过拟合算出最大OD值一半所对应的抗体浓度，然后按照上述公式计算出亲和常数Ka值。

（2）实验得到的曲线如附图8所示，按照公式Ka = ( n-1)/2( n［Ab'］t-［Ab］t) 计算亲和力常数Ka值。

3、配对抗体特异性鉴定

（1）采用免疫印迹法（Western blot）进行配对抗体特异性鉴定。以鉴定3M4和5M7这2株配对抗体的特异性，即鉴定这2株配对抗体是否与血清中某种成分有交叉，是否能识别血清中具有天然构象的抗原；先对人血清进行SDS-PAGE 电泳，上样量为20μl，上样顺序依次为人肌红蛋白阳性血清（Cmyo＞500ng/ml）、正常人血清。100V电泳80min后停止电泳，转膜采用湿转，将蛋白转移到经过甲醇活化的0.2μm PVDF 膜上。转印条件为120V，50min。转膜完毕后，用PBST（含0.05%吐温）洗涤3次，5min/次，随后加入5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜，再将3M4、5M7和抗人肌红蛋白标准抗体稀释成1ug/mL后作为一抗分别在室温孵育2h。孵育完毕后，用PBST 洗涤3次，5min/次; 再加入HRP 标记的羊抗鼠二抗，采用1:10 000稀释，于室温孵育1h。用PSBT 洗涤3次，5min/次，沥干后加入增强型化学发光( ECL) 底物，进行显影。

（2）结果如附图9所示，从结果可以看出，标准抗体、3M4和5M7均只有单一条带，且只在阳性血清泳道有条带，在阴性血清泳道中没有条带出现，说明3M4和5M7这两株抗体特异性强，与血清中的其它复杂成分没有交叉反应，并且能与人血清中天然肌红蛋白发生反应。

实施例5单克隆抗体对3M4和5M7对人血清中肌红蛋白的检测

1、标准曲线建立

（1）通过一系列的条件优化，以5M7作为捕获抗体，以3M4作为检测抗体，建立了检测人肌红蛋白的双抗体夹心Elisa检测方法。

操作如下：

S1.捕获抗体5M7采用碳酸盐缓冲液（pH9.6）4℃包被过夜，包被浓度为2.5μg/ml；

S2.用PBST洗涤3次后采用2% BSA进行封闭，封闭条件为37℃，1h；

S3.加入不同浓度的用样本稀释液两倍稀释的人肌红蛋白标准抗原和待检测血清样本，加入量80μl，随后加入HRP标记的检测抗体3M4，采用HRP标记试剂盒（泰天和 Glue B型活化辣根过氧化物酶HRP标记试剂盒）标记，用低交叉反应稀释液稀释至工作浓度0.5μg/ml，加入量为120μl，37℃反应1h；

S4.用PBST洗涤五次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD450值。

其中，所用的样本稀释液和低交叉反应稀释液购自德国Candor Bioscience公司。

（2）进口试剂盒（购自ABCam公司，货号3108652）的标准曲线则严格按照试剂盒说明书进行操作。

（3）所得到标准曲线的对比如附图10所示。自制试剂盒的标准曲线的线性检测范围在25～1000ng/ml，而进口Elisa试剂盒的检测范围在25～1000ng/ml范围内线性不是特别理想，线性范围约在25～500ng/ml，因此比较可以发现，本发明所自制的试剂盒具有更好的线性相关性和线性范围。

2、同时，对单克隆抗体3M4经HRP标记过后的效价进行了检测，检测结果如附图11所示。

3、血清样本的检测

用建立的标准曲线进行血清样本的检测，并与进口试剂盒进行对照，验证样本检测的准确度。

共从医院收集了20份阳性血清和40份阴性血清，分别用本发明建立的方法和试剂盒（以抗人肌红蛋白单克隆抗体3M4和5M7为基础建立的双抗体夹心ELISA方法），以及市购的进口试剂盒（购自ABCam公司，货号3108652）进行测定，统计阳性率和阴性率，比较结果的准确性。

结果如表3所示，20个阳性样本，商品化试剂盒能全部检测出来，自己建立的方法能检测出19个，阳性检出率为95%，对于个别弱阳性样本会出现假阴性情况。对于40个阴性样本，均没有假阳性情况的出现，阴性率为100%。

表3 血清样本的检测结果

综上所述，与进口试剂盒相比，灵敏度比较相近。另外，本发明建立的双抗体夹心Elisa方法具有更大的线性范围，具有推广应用的商业价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 单克隆抗体3M4的重链可变区的基因序列

<400> 1

gtcaaactgc aggagtctgg aggaggcttg gtgcaacctg gaggatccat gaaactctcc 60

tgtgtagcct ctggatttaa tttcagtagt tactggatgt cttgggtccg ccagtctcca 120

gagaaggggc ttgagtgggt cgctgaaatt agattgaaat ctgataatta cgcaacacat 180

tacgcggagt ctgtgaaagg gaagttcacc atctcaaggg atgattccaa aagtagtctc 240

tacctgcaaa tgaacaactt aagaactgag gacactggaa tttatttttg tgcagatcac 300

ggacttacgg ggcactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348

<210> 2

<211> 309

<212> DNA

<213> 单克隆抗体3M4的轻链可变区的基因序列

<400> 2

ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca tctcctgggg agaaggtcac cttgacctgc 60

agtgccagct cgagtgtaag ttccagctac ttgtactggt accagcagaa gccaggatcc 120

tcccccaaaa tctggattta tagcacatcc aacctggctt ttggagtccc tgatcgcttc 180

agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gcaccatgga ggctgaagat 240

gctgcctctt atttctgcca tcagtggagt agttacccgt tcacgttcgg tgctgggacc 300

aagctggag 309

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 单克隆抗体5M7的重链可变区的基因序列

<400> 3

aggtcaaact gcagcagtct ggggctgagc tggcaagacc tggggcttca gtgaagttgt 60

cctgcaaggc ttctggctac acctttacta tctactggat gcagtgggta aaacagaggc 120

ctggacaggg tctggaatgg attgggtcta tttatcctgg agatggtgat actaggtata 180

atcagaagtt caagggcaag gccacattca ctgcagataa atcctccagc acagcctaca 240

tgcaactcat cagtttggca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca accggtctct 300

actatggtta cgacgagggc cactggtact tcgatgtctg gggccaaggg accacggtca 360

<210> 4

<211> 329

<212> DNA

<213> 单克隆抗体5M7的轻链可变区的基因序列

<400> 4

gacattgtga tgtcacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 329

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 单克隆抗体3M4的重链可变区的氨基酸序列

<400> 5

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser Tyr Trp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

50 55 60

Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Asp His Gly Leu Thr Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 103

<212> PRT

<213> 单克隆抗体3M4的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 6

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr Ser

35 40 45

Thr Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe

85 90 95

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

100

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 单克隆抗体5M7的重链可变区的氨基酸序列

<400> 7

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr Trp

20 25 30

Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 单克隆抗体5M7的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 8

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

Claims

1.一种分泌高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3M4，其特征在于，该杂交瘤细胞株3M4于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201529。

2. 一种分泌高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5M7，其特征在于，该杂交瘤细胞株5M7于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201530。

3. 一对高特异性高亲和力结合人肌红蛋白的单克隆抗体3M4和5M7，其特征在于，分别由权利要求1所述杂交瘤细胞株3M4和权利要求2所述杂交瘤细胞株5M7分泌得到。

4. 根据权利要求3所述单克隆抗体3M4和5M7，其特征在于，所述单克隆抗体3M4和5M7的可变区基因均包括重链可变区基因和轻链可变区基因；单克隆抗体3M4的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；单克隆抗体5M7的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

5. 根据权利要求4所述单克隆抗体3M4和5M7，其特征在于，所述单克隆抗体3M4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述单克隆抗体5M7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6. 权利要求3～5任一所述单克隆抗体3M4和5M7在检测人血清中肌红蛋白方面的应用。

7. 权利要求3～5任一所述单克隆抗体3M4和5M7在制备检测人血清中肌红蛋白的试剂或试剂盒方面的应用。

8. 一种检测人血清中肌红蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，该方法以权利要求3所述单克隆抗体3M4作为检测抗体，以单克隆抗体5M7作为捕获抗体。

9. 根据权利要求8所述双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，步骤如下：

S3.加入待检测血清样本，随后加入HRP标记的检测抗体3M4，37℃反应1h；

S4.用PBST洗涤3～5次，每次3min，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

10. 一种检测人血清中肌红蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，是以权利要求8所述双抗体夹心ELISA方法为基础建立的。