CN101915842A - β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条及其制备方法，可有效解决能快速、简便地同时检测出β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇的问题，方法是：基材PVC板上面自后向前依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜和后部覆盖膜组成的覆膜，载体玻璃纤维内吸附有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体和抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，硝酸纤维膜上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试线包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物，本发明有效用于同时检测β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇，方便、快捷、结果准确。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条及其制备方法。
二、背景技术
β-***是一类拟肾上腺素，因其能使动物和人体组织中的β受体兴奋(激动)从而调节体内不同组织的机能而得名，其化学成分为苯乙醇胺衍生物，该类药物具有促进畜禽脂肪分解、增加肌肉生长作用，作为营养重分配剂，以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖者作为养殖促进剂非法使用。在养殖业中最常用的是盐酸克仑特罗(Clenbuterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)和莱克多巴胺(ractopamine)，在家畜饲料中使用β-***而造成消费者食物中毒事件时有发生。β-***作为促进动物生长、提高瘦肉率的饲料添加剂，但长期使用会使该类药物在动物食品中蓄积，人食用了饲喂含β-***作为添加剂饲料的畜产品后，就会出现中毒症状，通常会出现肌肉震颤、心悸、精神紧张、头疼、肌肉疼痛、晕眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，甚至死亡。因此，世界许多国家禁止在饲料中使用盐酸克伦特罗等β-***来增加动物的瘦肉率。我国政府已明令禁止在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗等β-***。
目前，现有技术对于盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测主要依赖化学仪器分析、酶免疫检测试剂盒及单独检测盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测测试条。监管部门并不知道养殖户使用了何种β***，检测存在一定的盲目性，常常造成漏检。因此，市场迫切需要有一种试剂能同时检测常见的β***，以方便日常监管工作。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明目的在于提供一种能快速、简便地同时检测出β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条及其制备方法，为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：包括基材PVC板和覆膜，基材PVC板上面自后向前依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜和后部覆盖膜组成的覆膜，载体玻璃纤维内吸附有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体和抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，硝酸纤维膜上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗(为公知市售产品，如郑州兰森生物技术有限公司的产品)，测试线包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物；硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触；其制备方法是，由以下步骤实现：首先分别制备胶体金标记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被膜、固化金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成长条即可。
本发明可有效用于同时检测β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇，本发明测试条在使用时，将引水玻璃纤维(膜)一端竖向***标本样品中，或将标本样品滴至测试条前部引水玻璃纤维上，样品在毛细作用下，沿测试条向后部吸水棉浆板方向泳动，如果标本样品中含有β-***莱克多巴胺和沙丁胺醇或一种，它们与相应标记抗体(胶体金标记单克隆抗体)反应形成标记抗体-抗原复合物；当标本样品泳动至包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物检测带时则不发生反应，而与质控线反应，结果仅出现一条红线(质控线)或两条红线；如果标本样品中无β-***莱克多巴胺和沙丁胺醇，标记抗体(抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体)分别与包被膜上莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物以及质控线结合形成红色线条带，结果出现n+1条红线；如质控线不出现红线，则表明测试条已失效。因此，利用本测试条，只需一次加样，5～10分钟即可对二种β-***进行检测。该方法简单、方便、快捷、结果准确。
四、附图说明
附图为本发明测试条立体结构图(覆膜掀起)。
五、具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明。
由附图给出，本发明二元检测测试条其结构是，包括基材PVC板和覆膜，基材PVC板1上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆板5，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜7和后部覆盖膜6组成的覆膜(所称的前部覆盖膜7、后部覆盖膜6是以测试条使用时标本样品泳动方向为准，引水端为前，吸水端为后)，载体玻璃纤维内吸附有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体和抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，硝酸纤维膜上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试线包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物；硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。
为了保证使用效果，所说的覆膜为不干胶膜。
本发明二元检测测试条的制备方法是，由以下步骤实现：首先分别制备胶体金标记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被膜、固化金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成长条即可；具体是：
1.胶体金标记单克隆抗体的制备：采用辛酸-硫酸铵法，取1份含有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，在18-25℃搅拌下逐滴加入辛酸33μl/ml小鼠腹水(即每1ml的小鼠腹水中加入33μl的辛酸)，混匀后，室温(18-25℃)放置30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7.2，在上清液中加入硫酸铵，其加入量为每1mlPH值7.2的上清液中加入0.277g(0.277g/ml)，快速使硫酸铵溶解，于18-25℃室温搅拌30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的0.01M PBS pH 7.2溶液溶解，再放入0.01M PBS pH 7.2溶液中浸没，4℃透析48小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即制备成胶体金标记用的抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体、抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量为500μl/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只鼠，10天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；
2.制备胶体金溶液：在烧杯中加入1000ml蒸馏水，100℃煮沸约5分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液10ml和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液15～20ml，搅拌至溶液呈深红色，冷至18-25℃室温，用碳酸钾(K2CO3)调PH值至待标记单克隆抗体的等电点或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；
3.胶体金标记物的制备：取100ml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体1～10μg/ml胶体金溶液(即每1ml胶体金溶液中加入单克隆抗体1-10μg)，搅拌2分钟，加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)15μl/ml胶体金溶液终止反应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7.4的0.01M PBS(即磷酸盐缓冲液)稀释至步骤2的原胶体金溶液体积的30％，制备成抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；
4.固化金标物的制备：用载体玻璃纤维吸取抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；
5.包被膜制备：取兔抗鼠多抗、莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜，其中：兔抗鼠多抗包被浓度为0.5～5mg/ml，莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物包被浓度为0.05～2mg/ml；
6.测试条装备：自前而后依次将引水玻璃纤维3，吸附抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的载体玻璃纤维4，包被有兔抗鼠多抗、莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物的硝酸纤维膜2、吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，覆盖上覆膜，切割成长条即可。
实施例1：本发明在具体实施中，还可为包括基材PVC板1、粘附于基材中部的硝酸纤维膜2、粘附于基材PVC板1前部的引水玻璃纤维3及载体玻璃纤维4、粘附于基材后部的吸水棉浆板5、上部覆膜6及下部覆膜7，引水玻璃纤维3后端面和载体玻璃纤维4前端面紧密相接，硝酸纤维膜2两端面分别和载体玻璃纤维4的后端面及和吸水棉浆板5前端面紧密接触，下部载体玻璃纤维4为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体和抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物，胶体金溶液制备中质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为17ml，胶体金标记抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为5μg/ml；中部硝酸纤维膜2上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试线包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物，兔抗鼠多抗包被浓度为1mg/ml，莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物包被浓度为0.2mg/ml。
实施例2：本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为15ml，胶体金标记抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为4μg/ml；兔抗鼠多抗包被浓度为0.9mg/ml，莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物包被浓度为0.1mg/ml。其它同实施例1。
实施例3：本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为19ml，胶体金标记抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为8μg/ml；兔抗鼠多抗包被浓度为2mg/ml，莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物包被浓度为0.5mg/ml。其它同实施例1。
本发明经试验，利用本测试条同时测试β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇，只需一次加样，5-10分钟即可对β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇进行测试，经158次试用，除1例不明确外，其余157例均达到了满意效果，准确率达99％以上，因此，本发明具有方法简单，方便快捷，结果准确之特点，是β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇检测上的创新。
Claims (3)
1.一种β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条，包括基材PVC板和覆膜，其特征在于，基材PVC板(1)上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维(3)、载体玻璃纤维(4)、硝酸纤维膜(2)和吸水棉浆板(5)，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜(7)和后部覆盖膜(6)组成的覆膜，载体玻璃纤维内吸附有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体和抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，硝酸纤维膜上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试线包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物；硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。
2.根据权利要求1所述的β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条，其特征在于，所说的覆膜为不干胶膜。
3.权利要求1所述β-***莱克多巴胺、沙丁胺醇二元检测测试条的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)胶体金标记单克隆抗体的制备：取1份含有抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，在18-25℃搅拌下逐滴加入辛酸33μl/ml小鼠腹水，混匀后，18-25℃放置30分钟，15000转/分4℃离心20分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7.2，在上清液中加入硫酸铵，其加入量为每1ml PH值7.2的上清液中加入0.277g，快速使硫酸铵溶解，于18-25℃搅拌30分钟，15000转/分4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的0.01M PBS pH 7.2溶液溶解，再放入0.01M PBS pH 7.2溶液中浸没，4℃透析48小时，用紫外分光光度计测定胶体金标记物蛋白含量，即制备成胶体金标记用的抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体、抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量为500μl/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只鼠，10天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；
(2)制备胶体金溶液：在烧杯中加入1000ml蒸馏水，100℃煮沸5分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液10ml和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液15～20ml，搅拌至溶液呈深红色，冷至18-25℃，用碳酸钾调PH值至待标记单克隆抗体的等电点或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；
(3)胶体金标记物的制备：取100ml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体1～10μg/ml胶体金溶液，搅拌2分钟，加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白15μl/ml胶体金溶液终止反应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7.4的0.01M PBS稀释至步骤2的胶体金溶液体积的30％，制备成抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；
(4)固化金标物的制备：用载体玻璃纤维吸取抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或抗沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；
(5)包被膜制备：取兔抗鼠多抗、莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜，其中：兔抗鼠多抗包被浓度为0.5～5mg/ml，莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物包被浓度为0.05～2mg/ml；
(6)测试条装备：自前而后依次将引水玻璃纤维3，吸附抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体或沙丁胺醇蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的载体玻璃纤维4，包被有兔抗鼠多抗、莱克多巴胺蛋白质偶联物、沙丁胺醇蛋白质偶联物的硝酸纤维膜(2)、吸水棉浆板(5)固定粘贴于基材PVC板(1)上，覆盖上覆膜，切割成长条即可。
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