CN101914560B - 谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途 - Google Patents

谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，该基因的DNA序列为SEQ ID NO.1。本发明变体基因通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在中性pH值的催化活力，拓宽了酶的最适pH值范围，使对应的变体酶在pH6.0条件下催化谷氨酸生成GABA的提高到野生型酶的2倍。随着酶的最适pH值范围的拓宽，使得催化反应可以在高于pH 5.0的条件进行，因此也解决了在pH4.0-5.0条件下催化时底物谷氨酸溶解度低的问题，为利用该酶通过生物转化生产GABA创造了条件。

Description

谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶的变体基因及其用途。
背景技术
定点突变(site-directed mutagenesis或oligonucleotide-directedmutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的有力工具，也是在实验室中改造基因的常用手段。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者***，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。特别是在酶的理性设计中，或利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸位点后，进行定点突变分析，将有利于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用。
谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15)是一种广泛地存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)。GABA是哺乳动物神经***的一种关键的神经递质抑制剂，具有抑制中枢神经***的过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。由于身心紧张会导致人体血压升高、免疫功能失调、代谢紊乱，因此GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压，改善免疫功能，延缓衰老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家***批准为“新资源食品”。目前，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的生物制备正得到越来越多的重视。
作为生物技术富集生产GABA的关键酶，细菌GAD的活力与pH值关系限制了其在大规模生物反应器中的应用。细菌GAD的活力对pH值较为敏感，酶的最适pH值一般在4.0-5.0之间，这对于利用GAD制备GABA有两点不利。首先，这要求对催化环境的pH值进行严格控制，如此才能使GAD发挥最大酶活；其次，由于L-谷氨酸在此pH范围内溶解度较低，因此，该pH值范围不利于反应的操作。
中国专利200510049189.4和中国专利200510049187.5公开了一种生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306，对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，可实现可溶表达，该基因表达的GAD最适催化pH为4.8，在pH6.0及以上环境中基本没有催化活性。
发明内容
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，解决了传统谷氨酸脱羧酶在pH6.0及以上的环境中催化活性低的问题。
一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过对来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306中的GAD基因进行定点突变，将该基因第468位组氨酸(His)的密码子CAC突变为丙氨酸(Ala)的密码子GCC，序列长度没有变化。
本发明还提供了一种上述变体基因编码的谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供一种包含上述变体基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒以及转化子。
表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞(如BL21(DE3))中实现胞内可溶表达。
本发明提供了上述变体基因在催化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸中应用。本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在中性pH值的催化活力，拓宽了酶的最适pH值范围，使对应的变体酶在pH6.0条件下催化谷氨酸生成GABA的达到野生型酶的2倍。随着酶的最适pH值范围的拓宽，使得催化反应可以在高于pH 5.0的条件进行，因此也解决了在pH4.0-5.0条件下催化时底物谷氨酸溶解度低的问题，为利用该酶通过生物转化生产GABA创造了条件。
附图说明
图1为质粒pET28a(+)-GAD的基因图谱；
图2为突变位点His468在GAD三级结构中的位置图(以红色标注)；
图3为定点突变原理示意图；
图4为野生GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱。
具体实施方式
构建重组质粒
将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306培养至指数生长中期，取4.5ml菌液10000rpm离心一分钟后弃去上清，利用试剂盒(上海生工)按说明书提取基因组DNA。
设计如下简并引物：
上游简并引物1：5’-cgggatccatgaaYaaRaaYgaYcaRgaRc-3’；
上游简并引物2：5’-cgggatccatggcWatgttRtaYggWaaac-3’；
和一个下游简并引物：
5’-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3’
其中，上游引物中的“ggatcc”为BamH I酶切位点，下游引物中的“gaattc”为EcoR I酶切位点。
分别用上游引物1(Up1)和上游引物2(Up2)与下游引物(Down1)配对，选择和优化不同的模板/Pfu/引物比例，退火温度，循环次数，以所得基因组DNA为模板进行PCR，以得到扩展片段大小合适、丰度适度和非特异条带少的PCR结果，最终采用上游简并引物2与下游简并引物配对，得到了一个长度约为1400bp的DNA条带。
所确定的PCR体系组成为(单位：μl)：纯净水，38.5；Pfu buffer，5；上游引物1，0.5；下游引物，0.5；dNTP，4；模板，1；Pfu，0.5；反应总体积为50。
所用PCR条件为：94℃变性5min后进入扩增循环，即94℃变性1.5min，57℃退火1min，72℃延伸3.5min，共循环32次，最后在72℃延伸8min。扩增产物经凝胶电泳检验，结果图4所示，产物条带单一、清晰、明亮，大小在1000-1500bp之间、且接近1500bp。阴性对照无条带，说明扩增特异性较好。将克隆产物测序，发现谷氨酸脱羧酶基因的保守序列。
用BamH I和EcoR I对扩增得到目的基因和pET-28a(+)进行双酶切，酶切条件如下：DNA 20μl、10×K buffer 4μl、BamH I 4μl、EcoR I 4μl、ddH2O 8μl，酶切温度为35℃。
质粒酶切1h，PCR产物酶切4h。分别对酶切产物进行电泳纯化和切胶回收，电泳验证回收产物，然后进行连接，连接条件为：10×buffer2μl、gad 10μl、质粒1μl、PEG30006μl、T4连接酶1μl，连接温度为16℃，连接16小时。
连接反应结束后60℃保温5min灭活连接酶，再分别取连接产物转化DH5α感受态细胞(氯化钙法)。转化产物涂布于含有终浓度为30ug/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养18小时后挑出阳性克隆，分别在含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养阳性克隆，提取质粒后进行BamH I和EcoR I双酶切、PCR验证，转化子含重组质粒pET28a(+)-GAD。经测序，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306中GAD基因如SEQ ID NO.5所示，编码的GAD氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
取构建的表达谷氨酸脱羧酶的质粒pET-28a(+)-gad转化BL21(λDE3)感受态细胞，得到表达短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的重组工程菌(BL21(λDE3)-pET-28a(+)-gad)。挑取菌体在含有终浓度为30ug/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上于37℃活化10小时，然后挑取单菌落接种20ml含有30ug/ml卡那霉素的LB，在37℃、200rpm摇床培养过夜后按2％的接种量接种置于250ml锥形瓶的50ml含有30ug/ml卡那霉素的LB，在，37℃、转速为200rpm的恒温振荡器进行培养2-3小时。当发酵液中菌体浓度(OD600)达到0.6-0.8时，向培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1.0mmol/L，改变培养温度到30℃左右，继续培养5-8小时。培养结束后，在4℃，8000g的条件下离心10min收集菌体。
然后采用破胞缓冲液重悬细胞，然后用Ni-NTA(QIAGEN)进行金属螯合层析，得到纯野生型GAD，其操作步骤和所用试剂如突变酶的纯化。
定点突变PCR产物的获得
向200μL的Eppendorf管中加入200μmol的dNTPs，上、下游引物各1μmol，约10ng pET28a(+)-GAD重组质粒作为模板DNA，5μL的10×Pfu Buffer，2.5U的Pfu DNA聚合酶，然后加无菌蒸馏水至总体积为50μL。反应参数是在95℃预变性5min后，95℃变性1min，53℃退火2min，72℃延伸14min，经过18个循环，最后72℃延伸10min。
上游引物：GATTCACTgcCTAAGAATTCGAGCTCCGTCG
下游引物：GAATTCTTAGgcAGTGAATCCGTATTTTTTAGGTTG
其中，小写字母代表发生替换的碱基，下划线部分为EcoR I的酶切位点。
定点突变PCR产物的转化与验证
将上述获得的定点突变PCR产物用DpnI酶进行消化，以降解野生型质粒，消除转化子中野生型个体出现的可能。消化的体系为：PCR产物10μL，10×buffer 2μL，DpnI 1μL，加dH2O至总体积为20μL。
将消化以后的产物用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)，具体操作如下：
(1)从-70℃冰箱中取100μL的感受态细胞悬液，冰上融化；
(2)加入定点突变PCR消化产物5μL，轻轻混匀，冰上放置30min；
(3)于42℃水浴热激110s，然后立即冰上放置2min；
(4)向管中加入900μL SOC培养基，混匀，37℃振荡培养1h，使细胞复苏；
(5)将上述菌液摇匀，取适量涂布在含有30μg/mL卡那霉素的LB平板上，正面向上放置半小时，待菌液被培养基吸收后倒置平板，37℃培养过夜。
待转化子长出后，随机挑选若干个克隆，提取质粒，进行全自动DNA测序，证实突变位点为His468→Ala。
突变酶的表达与纯化
将转化子接种到20mL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡过夜培养，然后以1％的接种量接种到含有30μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，30℃，150rpm继续诱导8h。诱导结束后，4℃下5000×g离心10min，收集菌体沉淀。用pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，1mM PMSF，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300W，工作3s，间隙6s)，15000×g离心10min收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析对上步所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
所用缓冲液配制如下：
裂解缓冲液(disruption buffer)：50mM磷酸二氢钠，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0。
洗柱缓冲液(wash buffer)：50mM磷酸二氢钠，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0。
洗脱缓冲液(elution buffer)：50mM磷酸二氢钠，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。
突变酶在pH6.0处活力测定
配制底物溶液(pH6.0，0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，含0.01mMPLP，10mM底物L-MSG)，取200μL底物溶液于40℃预热后加入10μL酶液(GAD浓度为240μg/mL)，迅速混匀后在40℃反应2h，反应结束后迅速放入沸水浴中10min以终止反应，离心，收集上清液，采用高效液相色谱法测定反应生成的GABA的量。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为对照。HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2C18(250mm×4.6mm)(大连依利特公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10μL，控制柱温25℃，流动相A为甲醇，流动相B为四氢呋喃∶甲醇∶0.05M醋酸钠(pH 6.2)(5∶75∶420，V/V)。梯度洗脱程序见下表：
Figure BDA0000025470810000061
结果每mg突变酶的GABA产量为11.3mM，而在同样条件下每mg野生型GAD的产量仅为5.6mM，因而在pH6.0处突变酶H468A的活力是野生型酶的2倍。
以表达变体谷氨酸脱羧酶的工程菌转化谷氨酸盐制备γ-氨基丁酸
用无菌生理盐水重悬实施例4中得到的表达谷氨酸脱羧酶的工程菌细胞，然后再次离心收集菌体。取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为60mM，控制反应体系温度在35～40℃，体系pH值在4～6之间。反应3小时，反应液离心经高效液相色谱分析得γ-氨基丁酸含量约为6g/L。
以变体谷氨酸脱羧酶Gad H468A转化谷氨酸盐制备γ-氨基丁酸
用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系稀释实施例4中制备的谷氨酸脱羧酶纯酶制备反应体系，体系pH值在4～6之间。向体系中加入一定量谷氨酸或其盐进行催化即可得到γ-氨基丁酸。在本实施例中，选择的催化底物为L-谷氨酸钠，底物浓度为30mM，控制反应体系温度在35～40℃，反应2小时，反应液离心经高效液相色谱分析得γ-氨基丁酸含量约1.73g/L。
Figure IDA0000025470900000011
Figure IDA0000025470900000031
Figure IDA0000025470900000041
Figure IDA0000025470900000051
Figure IDA0000025470900000061
Figure IDA0000025470900000071

Claims (6)

1.一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其特征在于：碱基序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求1所述的变体基因的谷氨酸脱羧酶表达单元。
4.一种包含权利要求1所述的变体基因的重组质粒。
5.一种包含权利要求1所述的变体基因的转化子。
6.如权利要求1所述的变体基因在催化L-谷氨酸或其盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
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