CN101897730B

CN101897730B - 一种链霉菌抗菌产物的提取方法

Info

Publication number: CN101897730B
Application number: CN2009102310529A
Authority: CN
Inventors: 刘训理; 周启升; 毛志泉; 张楠; 曹宁宁; 张莎莎
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2009-12-13
Filing date: 2009-12-13
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-12-13
Also published as: CN101897730A

Abstract

本发明涉及一种链霉菌抗菌产物的提取方法，属于生物技术领域。链霉菌(Streptomyces.sp)S24经活化、发酵，发酵液经灭菌、离心、大孔吸附树脂AB-8吸附、75～85％丙酮解吸、解吸液回收溶剂蒸发、干燥，获得抗菌产物提取物。试验证明，该抗菌产物对粮食和饲料中的主要霉变真菌如黄曲霉、黑曲霉、赭曲霉、烟曲霉以及人体致病真菌黄曲霉、烟曲霉等具有广谱的抗菌活性。由于本发明提供的抗菌产物对多种引起粮食和饲料霉变真菌及人体致病真菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，并且抗菌产物的提取方法简便，成本低，在食品防腐剂、饲料添加剂及医药方面有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

Description

一种链霉菌抗菌产物的提取方法

(一)技术领域

本发明涉及用大孔吸附树脂从链霉菌S24发酵液中提取其产生的抗菌产物的方法，属于生物技术领域。具体的说就是从链霉菌S24发酵液中提取抗菌产物的方法。

(二)背景技术

本发明的目的在于提取链霉菌S24发酵产生的抗菌产物用于防治粮食及饲料中的主要霉变真菌及人体致病真菌黄曲霉、烟曲霉等。

曲霉属真菌污染粮食和饲料可导致人畜发生曲霉病，产生的毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌作用，自从上世纪六十年代，人们对其进行了广泛的研究，并致力于其有效防治。国内研究者较多集中在毒素脱毒技术的改进及检测方法的优化等方面，以往防治曲霉属真菌及其毒素污染粮食和饲料的方法主要是用物理、化学和生物学方法清除食品中污染的曲霉及毒素，不仅成本高，而且效果也不理想。

链霉菌属(Streptomyces)菌株具有丰富的物种多样性和代谢类型多样性，是极其重要的产生天然活性产物的资源微生物。自Waksman发现链霉素以来，链霉菌的分离及其代谢产物的研究受到微生物学家及药学家的广泛关注。作为一类具有重要经济价值的微生物资源，至今发现的12000余种微生物来源的生理活性物质中，55％以上是由链霉菌属菌株产生的，其中包括抗生素、免疫抑制剂和酶抑制剂等。目前临床上应用的抗生素约2/3来源于链霉菌属。从链霉菌中提取活性物质一直是多年来的研究热点。我们以黄曲霉标准菌株为靶标，从泰山土壤及储粮仓尘土中，分离、筛选获得高效抗黄曲霉链霉菌S24，研究发现该菌株发酵产生的抗菌产物不仅对粮食及饲料中的主要霉变真菌具有高效广谱抗性，而且对人体致病真菌黄曲霉、烟曲霉也有很好的抑制作用。本发明利用树脂法提取链霉菌S24抗菌产物，具有设备简单、操作方便、生产周期短、成本低等优点，利于工业化生产。

(三)发明内容

本发明提供一种链霉菌抗菌产物的提取方法。

本发明采用如下技术方案实现：一种链霉菌，该菌株表述为链霉菌S24。该菌株已于2009年12月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；菌株保藏编号：CGMCC No.3503；菌株分类命名：链霉菌Streptomyces.Sp。

本发明所述的链霉菌(Streptomyces sp)S24的研究起源于“黄曲霉生防菌的筛选”，样品主要取自泰山林地土壤，从其中筛选菌种，总共收集得到活性菌株200多个，以黄曲霉标准菌株为靶标，筛选黄曲霉拮抗菌，利用其对粮食及饲料中常见霉变真菌如：黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉等及人体常见致病真菌如：黄曲霉、烟曲霉、茄病镰刀菌等多种常见病原真菌进行平皿对峙拮抗菌筛选，菌株发酵，无菌发酵液复筛，最后筛选出一株具有能够产生广谱高效抗菌产物的链霉菌S24。

链霉菌S24的特性：

1、菌株形态学特征

S24菌株具有丝状菌丝，基生菌丝较平直，气生菌丝稍有弯曲且有较多分枝，菌丝体横隔明显、能断裂成段；孢子丝直，二级轮生，孢子丝成串排列，孢子为椭圆形。

2、菌株培养特征

链霉菌S24在8种不同的培养基上生长差异较大，其基生菌丝及气生菌丝颜色(见下表)在不同培养基上产色素的情况不同。基生菌丝为以黄色为基调的多种颜色；气生菌丝是以白色为基调的多种颜色。

链霉菌S24的培养特征

注：“-”代表生长缓慢；“+”代表稀疏；“++”代表较多；“+++”代表较茂盛；“++++”代表茂盛

3、生理生化特征

生理生化试验表明：该菌可在15～37℃环境下生长，环境温度达到45℃时生长受到抑制；其存活pH值为4～12，明胶不液化、牛奶凝固、淀粉水解呈显阳性，能还原硝酸盐，能在滤纸上生长，但不能利用纤维素，可产生H₂S和黑色素，耐盐性差，在含NaCl3％的培养基上即生长非常缓慢；链霉菌S24在生长过程中，可以产生凝乳酶、淀粉水解酶、硝酸盐还原酶，不能产生蛋白酶，不能产生纤维素酶。

链霉菌S24的生理生化特征

注：“-”代表阴性或菌丝不生长；“+”代表阳性或菌丝生长量

本发明的目的是给出链霉菌S24抗菌产物的提取方法，该抗菌产物不仅对粮食及饲料中的主要霉变真菌具有高效广谱抗性，而且对人体致病真菌黄曲霉、烟曲霉、茄病镰刀菌也有很好的抑制作用，因此，该抗菌产物具有作为食品防腐剂，饲料添加剂和药物的潜力，本发明利用树脂法提取链霉菌S24抗菌产物，具有设备简单、操作方便、生产周期短、成本低等优点，利于工业化生产，可以使其得到大范围的应用。

一种链霉菌抗菌产物的提取方法，通过以下步骤实现：

a、将斜面保存的菌种转接至平板PDA培养基，28℃恒温培养48～72小时；PDA培养基为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，(NH₄)₂SO₄1g，MgSO₄1g，KH₂PO₄0.6g，CaCO₃3g，水1000ml；

b、将PDA平板菌种转接至种子培养基，摇床发酵24小时，按2％接种量转接至发酵培养基摇床发酵84-96小时，收集发酵液，低速大容量离心机4200转/分，离心30分钟，收集发酵上清液；种子及发酵培养条件为：温度28℃，摇床转速200转/分，摇瓶装液量为50ml/250ml(或100ml/500ml)；种子及发酵培养基配方为复合培养基，具体为：葡萄糖16g，可溶性淀粉2.5g，蛋白胨10g，豆饼粉26g，NaCl 7.5g，(NH₄)₂SO₄4g，水1000ml；

c、将大孔吸附树脂与发酵上清液按一定比例混合，150转/分，振荡吸附3-4小时；

d、将吸附后的树脂收集装柱，用一定浓度乙醇洗脱后去除部分杂质，然后用一定浓度丙酮洗脱抗菌产物，流速为1.0ml/min，从色素带流出开始收集洗脱液，收集1.2-1.5倍柱体积后停止收集；

e、蒸发浓缩干燥丙酮洗脱液，所得到的干物即为抗菌产物；

其中：

步骤c中所述的大孔吸附树脂为AB-8；大孔吸附树脂AB-8与发酵上清液比例为1∶20(m∶V)。

步骤d中所述的洗脱液为丙酮。

步骤d中所述的乙醇浓度为15％-25％，洗脱液丙酮浓度为75％-85％。

链霉菌S24产生的抗菌产物回收率计算：

生测平板的制备：PDA培养基熔化后，温度降至50～55℃时，加入黄曲霉孢子悬液，使孢子的浓度为2～4×10⁴CFU/mL，将培养基孢子悬液倒入培养皿，20mL/培养皿，制备混菌平板；效价的测定：采用牛津杯法，将牛津杯放入生测混菌平板后，抗菌物质溶液100℃灭菌10分钟，加入牛津杯中(250μL/孔)，28℃培养18小时，十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈的直径大小计算效价，抗菌产物效价计算方程：Y＝10^{(x+10.931)/10.797}×n〔Y：抗菌产物效价(U)；x：抑菌圈直径(10.5mm＜x＜18.0mm)；n：稀释倍数〕；回收率计算方程：抗菌产物回收率＝Y₁V_I/YV(Y：发酵上清液效价；V：发酵上清液体积；Y₁：洗脱液效价；V₁：洗脱液体积)。

根据本发明提取的链霉菌S24抗菌产物具有以下优点：

(1)抗菌广谱性好，对引起粮食和饲料霉变的主要真菌(如黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉、赭曲霉)及人体致病真菌(黄曲霉、烟曲霉、茄病镰刀菌)均具有较强的抑制作用。

(2)抑菌活性高，用树脂法提取的抗菌产物对黄曲霉最小抑/杀菌浓度(MIC和MFC)分别为19.53μg/mL和39.06μg/mL，黄曲霉在没有抗菌产物存在时很容易侵染花生且生长很旺盛，在有抗菌产物存在的情况下黄曲霉的生长受到明显的抑制。

(3)发酵性状优良，发酵周期短，且性状稳定，抗菌产物对热稳定，耐储藏。

(4)本发明选用的大孔吸附树脂对抗菌产物的吸附选择性良好，吸附快，解吸也快，吸附容量较大，所用溶剂皆可回收利用，适于大规模生产。

(四)具体实施方式

实施例1：

(1)链霉菌S24培养及发酵：斜面保存菌种活化后，转至平板PDA培养基生长48小时，打孔接种至种子培养基，种子培养条件：温度28℃，摇床转速200转/分，培养时间24小时；种子培养液按2％接种于发酵培养基，发酵培养条件：温度28℃，摇床转速200转/分，摇瓶装液量50ml/250ml，培养时间96小时；发酵结束后，收集发酵液，低速大容量离心机4200转/分，离心30分钟，收集发酵上清液，体积为2400ml，生测效价为4563μg/mL；

(2)大孔吸附树脂AB-8吸附抗菌产物：将吸附树脂AB-8与发酵液离心后的上清液按比例m/V＝1∶20混合，150转/分振荡吸附4小时；将吸附后的树脂收集装入层析柱；

(3)洗脱剂解吸抗菌产物：去离子水洗脱2-3倍柱体积，用15％乙醇洗脱后去除部分杂质，然后用浓度为80％丙酮进行洗脱活性产物，流速1.0ml/min，色素带流出开始收集丙酮洗脱液，共获得洗脱液180ml，生测效价为54135.43μg/mL；

(4)抗菌产物的获得及回收率的测定：将收集获得的丙酮洗脱液浓缩干燥获得的干物即为链霉菌S24产生的抗菌产物；分别测定原发酵上清液，AB-8树脂吸附后发酵残液及丙酮洗脱液效价，测得AB-8树脂对抗菌产物的吸附率为98.62％，解吸剂对抗菌产物的解吸率为93.78％，抗菌产物回收率为88.98％。

实施例2

(1)链霉菌S24培养及发酵：斜面保存菌种活化后，转至平板PDA培养基生长56小时，打孔接种至种子培养基，种子培养条件：温度28℃，摇床转速200转/分，培养时间24小时；种子培养液按2％接种于发酵培养基，发酵培养条件：温度28℃，摇床转速200转/分，摇瓶装液量100ml/500ml，培养时间96小时；发酵结束后，收集发酵液，低速大容量离心机4200转/分，离心30分钟，收集发酵上清液，体积为4600ml，生测效价为4325.5μg/mL；

(3)洗脱剂解吸抗菌产物：去离子水洗脱2-3倍柱体积，用20％乙醇洗脱后去除部分杂质，然后用浓度为85％丙酮进行洗脱活性产物，流速1.0ml/min，色素带流出开始收集丙酮洗脱液共获得洗脱液320ml，生测效价为54058.48μg/mL；

(4)抗菌产物的获得及回收率的测定：将收集获得的丙酮洗脱液浓缩干燥获得的干物即为链霉菌S24产生的抗菌产物。分别测定原发酵上清液，AB-8树脂吸附后发酵残液及丙酮洗脱液效价，测得AB-8树脂对抗菌产物的吸附率为96.89％，解吸剂对抗菌产物的解吸率为91.82％，抗菌产物回收率为86.94％。

Claims

1.一种链霉菌抗菌产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

a、将斜面保存的菌种转接至平板PDA培养基，28℃恒温培养48～72小时；PDA培养基为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，(NH₄)₂SO₄ 1g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 0.6g，CaCO₃ 3g，水1000ml；

b、将PDA平板活化菌种转接至种子培养基，摇床发酵24小时，按2％接种量转接至发酵培养基摇床发酵84-96小时，收集发酵液，低速大容量离心机4200转/分，离心30分钟，收集发酵上清液；种子及发酵培养条件为：温度28℃，摇床转速200转/分，摇瓶装液量为50ml/250ml(或100ml/500ml)；种子及发酵培养基配方为复合培养基，具体为：葡萄糖16g，可溶性淀粉2.5g，蛋白胨10g，豆饼粉26g，NaCl 7.5g，(NH₄)₂SO₄4g，水1000ml；

c、将大孔吸附树脂AB-8与发酵上清液按比例1∶20M∶V混合，150转/分，振荡吸附3-4小时；

d、将吸附后的树脂收集装柱，用浓度为15％-25％的乙醇洗脱后去除部分杂质，然后用浓度为75％-85％的丙酮洗脱抗菌产物，流速为1.0ml/min，从色素带流出开始收集洗脱液，收集1.2-1.5倍柱体积后停止收集；

e、蒸发浓缩干燥丙酮洗脱液，所得到的干物即为抗菌产物。