CN101892312A - 一种鸡肉品质分子育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物育种学和分子生物学领域，具体涉及一种鸡肉品质分子育种方法。本发明方法是首先组建优质白耳鸡基础群，在2周龄采集血样对影响肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)和肌内脂肪含量的候选基因(A-FABP-3、Ex-FABP-3)的进行多位点序列分型检测，通过多个候选基因的核苷酸序列变异来确定有利基因型，进行标记辅助选择，从而加快遗传进展，提高肉品质性状的育种效率。
Description
技术领域
本发明属于动物育种学和分子生物学领域。
背景技术
目前，我国在研究鸡肉品质相关基因多应用PCR检测技术的方法，具有操作简单、特异性高、重复性好等优点，而且可以直接确定突变的部位和性质，因此在多态性检测中应用很广。而多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)是一种通过直接测定多个功能基因的核苷酸序列来发现基因变异的分型方法，是在普通PCR的基础上加以改进，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，因此一经提出，即得到众多研究者的青睐，在生命科学的各个领域，多位点序列分型已经成为一项成熟而重要的研究手段，然而在鸡肉品质方面的相关研究国内外还未见报道。另一方面，优质鸡是我国的特色产业，是保护、开发以及利用我国丰富鸡遗传资源的主要途径，但是优质鸡育种中存在肉品质性状表型选择遗传进展慢、育种效率低等问题，本专利在已有研究的基础上，以影响肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)(Genebank登录号：AY665560)和影响肌内脂肪含量的候选基因(A-FABP-3、Ex-FABP-3)(Genebank登录号分别为：AY545055、DQ078254)为研究对象，利用多位点序列分型技术，对相关功能基因同时进行多个位点的多型检测，并结合标记辅助育种方法，建立一 套具有自主知识产权的肉品质分子育种技术体系，为优质鸡专门化品系和配套系的选育提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是对多个影响鸡肉品质的候选基因同时进行序列分型。
本发明的技术方案是：首先组建优质白耳鸡基础群，在2周龄采集血样对影响肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)和肌内脂肪含量的候选基因(A-FABP-3、Ex-FABP-3)的进行多位点序列分型检测，通过多个候选基因的核苷酸序列变异来确定有利基因型，进行标记辅助选择，从而加快遗传进展，提高肉品质性状的育种效率。
附图说明
图1是Ex-FABP基因的变性胶电泳图，其中AA：3，6，8，9，11；BB：1；CC：12；AB：2，10；AC：5，7；BC：4。
图2是A-FABP基因的变性胶电泳图，其中AA：5；BB：1，3；AB：2，4，6
图3是GARS-AIRS-GART基因的变性胶电泳图，其中TT：1，4；CC：2，3，6，7；CT：5
图4是本发明育种方法的流程示意图。
具体技术路线如下：
1 材料与方法
1.1.组建优质鸡基础群
以现有优质白耳鸡群为基础，综合考虑羽色(黄羽、麻羽)、体重等性状，组建优质鸡基础群。
1.2 试验材料
采集2周龄鸡只的翅静脉血，常规酚/氯仿法提取DNA，-20℃保存备用。
1.3肉品质性状分子标记基因型检测
对已组建的基础群，采用PCR-SSCP和PCR-RFLP等分析技术，对肌苷酸含量相关候选基因(GARS-AIRS-GART)和肌内脂肪相关候选基因(A-FABP-3、Ex-FABP-3)进行检测，鉴定个体基因型并测定相应优势基因型的肌内脂肪含量和肌苷酸含量，进而确定用于多位点序列分型的选育群。
结果发现：
(1)Ex-FABP基因在外显子均没有检测到SNP突变(SNP：单核苷酸的多态性)，在内含子3检测到C3654T、C3699T、A3700G 3个SNP突变，共6种基因型，将Ex-FABP-3纯合型分别定义为AA、BB和CC型，杂合型定义为AB、AC和BC型(杨霞.鸡Ex-FABP基因单核苷酸多态性及其与脂肪性状的相关研究[D].四川农业大学，2006)，不同基因型的变性凝胶电泳图如图1，而其中BB型的鸡种肌内脂肪含量是最高的(表1)；
表1.白耳鸡Ex-FABP不同基因型肌内脂肪含量(单位：％)
(2)A-FABP基因外显子3(A-FABP-3)检测到A1763G的SNP突变，将其的纯和型分别定义为AA、BB型，杂合型定义为AB，(罗桂芬，陈继兰，文杰，赵桂苹，郑麦青，孙世铎.鸡A-FABP基因多态性 分析及其与脂肪性状的相关研究[J].2006，28(1)：39-42：)而其中AA型的鸡种肌内脂肪含量是最高的(表2)；
表2.白耳鸡A-FABP不同基因型肌内脂肪含量(单位：％)
(3)GARS-AIRS-GART基因经比较测序结果，发现片段中有1个核苷酸发生了突变，多态性是由该突变造成的。CC型的序列与GenBank中的序列相同，定义为野生型，TT型在-179位点发生了核苷酸变异，由C突变为T，定义为突变型，该突变为沉默突变，并没有引起所编码的氨基酸发生改变，(束婧婷，张学余，季从亮，吴信生，陈国宏.鸡GARS-AIRS-GART基因5′侧翼序列多态性与鸡肉IMP含量的关联分析[J].2007(3)：27-30)而其中TT型的鸡种肌酐酸含量是最高的(表3)。
表3.白耳鸡GARS-AIRS-GART不同基因型肌酐酸含量(单位：％)
1.4肉品质性状多位点序列分型检测
对影响肌苷酸含量的GARS-AIRS-GART基因有利基因和肌内脂肪含量的A-FABP、Ex-FABP有利基因(具体基因是：A-FABP-3和Ex-FBP-3、GARS-AIRS-GART和Ex-FABP-3)进行多位点序列分型。
1.4.1 引物设计
在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找相关基因(A-FABP-3、Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART)多态位点碱基变异信息，利用Primer Premier5.0软件设计特异性引物。三者的引物序列分别为：
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4.2 PCR条件优化
经过对PCR反应中模板浓度、最适引物量、镁离子浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等进行优化选择，并最终确立最优反应体系。
1.4.3 PCR扩增体系
PCR扩增反应体系为10×PCR缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，20μmol/L NE-F引物1μL，20μmol/L NE-R/R引物1μL，Taq酶1U，15ng/μL DNA模板1μL，总体积为25μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，电泳后于凝胶成像仪紫外灯下观察成像。
1.5建立高肌酐酸群体和高肌内脂肪群体
本发明中利用的是A-FABP-3和Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART和Ex-FABP-3的多位点序列分型，根据基因检测结果，综合选择Ex-FABP-3的基因型为BB型和A-FABP-3的基因型为AA型，选择 GARS-AIRS-GART的基因型是CC型和Ex-FABP-3的基因型为BB型的个体建立高肌酐酸群体和高肌内脂肪群体，其余个体淘汰。
1.6 分子育种体系的建立
具体流程如图4，利用肉品质性状(肌苷酸和肌内脂肪)有利基因型进行分子标记和常规育种值估计，确定分子综合选择指数(I＝MS+EBV，其中MS代表分子评分，EBV为估计育种值)，根据选择指数的高低，分别在12周龄和22周龄进行选育，公鸡最终留种率为20％，母鸡留种率为80％。
2 结果
结果显示：肌苷酸含量的候选基因(GARS-AIRS-GART)和影响肌内脂肪含量的候选基因(A-FABP、Ex-FABP)中A-FABP-3和Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART和Ex-FABP-3基因多位点序列分型条带清晰，并进行了基因部分基因型个体的测序，发现这几种基因可用于直接序列测定，结果见附图。
本发明可对影响鸡肉质的相关基因进行同时分型，通过本发明对基因进行多位点序列分析，建立一套具有自主知识产权的肉品质分子育种技术体系。
Claims (1)
1.一种鸡肉品质分子育种方法，其特征是：
(1)首先组建优质白耳鸡基础群，
(2)利用A-FABP-3和Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART和Ex-FABP-3的多位点序列分型，根据基因检测结果，综合选择Ex-FABP-3的基因型为BB型和A-FABP-3的基因型为AA型，选择GARS-AIRS-GART的基因型是CC型和Ex-FABP-3的基因型为BB型的个体建立高肌酐酸群体和高肌内脂肪群体，其余个体淘汰；
(3)利用上述有利基因型进行分子标记和常规育种值估计，确定分子综合选择指数I＝MS+EBV，其中MS代表分子评分，EBV为估计育种值，根据选择指数的高低，分别在12周龄和22周龄进行选育，公鸡最终留种率为20％，母鸡留种率为80％。
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