CN101892280B - 一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，含以下步骤：(1)冷匀浆选取贝肉于预冷水中匀浆得贝肉匀浆液；(2)超声波复合酶解处理在贝肉匀浆液中加入碱性蛋白酶，混匀，在超声波作用下进行酶解；(3)进一步酶解将超声波复合酶解后的匀浆液于水浴中进行继续恒温酶解，酶解完毕灭酶，冷却后离心分离得含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液；(4)膜分离和纯化处理将含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用5～10kDa和1kDa的超滤膜进行逐步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，经纯化处理得其粉末。该方法操作简单，工艺新，超声波辅助酶解可大大提高合浦珠母贝肉的水解率，缩短水解时间，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于海产品加工技术领域，具体涉及一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法。
背景技术
合浦珠母贝，属珍珠贝科珠母贝属，是世界上生产养殖珍珠的主要贝种。我国海南、广东、广西等省马氏珠母贝资源丰富。自六十年代中期我国合浦珠母贝人工育苗取得成功并大批量生产之后，合浦珠母贝养殖业得到快速发展，养殖产量从1981年14.5公斤增到2009年的10000公斤。目前海南有海水珍珠养殖场1000多个，出产的珍珠占全国海水珍珠总产量的30～40％。合浦珠母贝开珠后产生大量的贝肉，合浦珠母贝肉富含蛋白质、脂肪含量低，营养价值很高，目前只有少量加工为珍珠贝肉干，产品形式单一，高值化加工几乎没有。如何合理高值化利用珍珠贝肉资源，是合浦珠母贝养殖产业急需解决的问题。
随着现代社会的发展，生存环境的恶化以及社会压力的加大使现代人的健康受到严重的威胁，自由基引起机体损伤变性，导致机体各种疾病产生，已经引起人们强烈的重视。抗氧化剂的消费量越来越大，低价、高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点，其中以分子量小、易吸收、活性强，能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生等研究为主。天然抗氧化剂在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面应用前景广阔，筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为食品科学、生物学、医学等研究的新趋势。目前关于合浦珠母贝贝肉抗氧化寡肽的制备工艺方面的研究较少，还存在很大的开发空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，该方法操作简单安全环保，使合浦珠母贝开珠后的贝肉得到高值化利用，可提高生产企业的经济效益。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，含以下步骤：
(1)冷匀浆：选取贝肉置于预冷水中匀浆后得贝肉匀浆液；
(2)超声波复合酶解处理：在贝肉匀浆液中加入碱性蛋白酶，混匀，将上述贝肉匀浆液和碱性蛋白酶的混合液置于超声仪器中，调节频率为35kHz、功率为280～360W，并调节温度为45～65℃进行酶解50～70min；
(3)进一步酶解：将超声波复合酶解后的贝肉匀浆液置于45～60℃的水浴中进行继续恒温酶解0.5～2h，酶解完毕进行灭酶处理、冷却后离心分离得含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液；
(4)膜分离和纯化处理：将含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用截留分子量为5～10kDa和1kDa的超滤膜进行逐步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，经纯化处理得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉末。
上述制备方法中：
步骤(1)中所述的贝肉需经预处理，所述的预处理过程为：选取冷冻贝肉解冻或鲜贝肉，除去内脏，用清水清洗2～3次，沥水5min以上。
步骤(1)中所述的贝肉与预冷水的重量体积比为1∶0.5～1.0。
步骤(1)中预冷水的温度为0～10℃，匀浆时间为2～5min。
步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的添加量为每克贝肉匀浆液中加入1800～2500U。
步骤(3)中灭酶的温度为100℃，灭酶的时间为5～10min。
步骤(3)中离心分离的过程是：调节冷冻离心机的转速为10000～15000r/min，在0～4℃下离心15～25min。
步骤(4)中超滤膜分离的条件是：操作压力为3～4bar，温度为3～10℃。
优选的，步骤(4)中的纯化处理过程为：将所得的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液经冷冻干燥得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉。
优选的，步骤(4)中的纯化处理过程为：将所得的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液采用无水乙醇脱水后再经减压浓缩得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉。
本发明与现有技术相比，具有以下的优点：
(1)本发明通过超声波复合酶解及超滤技术相结合的集成技术，将合浦珠母贝肉通过碱性蛋白酶进行酶解，利用超声波技术具有波动和能量的双重属性，一是空化现象，即在液体介质中表现为泡的形成和破裂及伴随的能量释放，二是介质和容器也可以通过声的吸收产生共振性质的二级效应，所以在超声波的辅助作用下促进碱性蛋白酶对合浦珠母贝肉进行水解，通过控制酶解的时间、温度、加酶量、料水比例，获取具有高抗氧化活性的寡肽。不仅对南海主要养殖珍珠贝-合浦珠母贝开珠后大量的贝肉进行高值化利用，而且得到具有功能保健作用的抗氧化寡肽，可广泛应用于食品、化妆品等轻工行业及医药保健，促进海水养殖珍珠产业的可持续发展，具有重要的经济意义和社会意义。
(2)合浦珠母贝肉通过碱性蛋白酶进行酶解，水解度约为33.8％，平均肽链长度约为3.2，得到的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液体为透明无色，固体为浅黄色粉末。产品具有较强的抗氧化活性，特别是对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基等的清除能力较强，具有良好的吸湿能力与保湿能力。
(3)该工艺操作简单，超声波辅助酶解可以大大提高水解率，缩短水解时间，生产成本低，产品安全，可提高生产企业的经济效益。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法如下：
(1)贝肉预处理：将冻贝肉解冻，除去内脏，用清水清洗2次，放在不锈钢或塑料框中沥水5min以上；
(2)冷匀浆：将水先预冷到4℃，称取贝肉，按重量体积比为1∶0.5加入预冷水，置于组织捣碎机中匀浆5min，得到贝肉匀浆液；
(3)加酶、超声波处理：将贝肉匀浆液置于不锈钢杯中，添加诺维信食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L蛋白酶，丹麦NOVO公司产品，酶活为2.0×104U/g，按贝肉匀浆液的重量添加酶，每克贝肉匀浆液中添加2000U的Alcalase 2.4L蛋白酶，搅匀后，放在超声波仪器中，调节超声波工作频率为35kHz、超声波的强度为280W、控制处理温度为45℃，时间为70min；
(4)进一步酶解：经超声波处理后，将步骤(3)中的贝肉匀浆液继续在45℃恒温水浴酶解2h，在100℃下灭酶10min，灭酶后迅速冷却；
(5)离心：将步骤(4)中的酶解液在冷冻离心机中离心，离心机的转速为10000r/min，4℃下离心25min，取上清液；
(6)超滤：利用膜分离技术对步骤(5)中的上清液进行分离，膜分离的操作压力为3.5bar，超滤温度为4℃，先用截留分子量为10kDa的超滤膜进行分离，收集滤液，滤液再用截留分子量为5kDa的超滤膜进一步分离，收集滤液，滤液再用截留分子量为1kDa的超滤膜进一步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，呈无色透明；
(7)纯化：将上述合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液经冻干得到白色抗氧化寡肽粉。
实施例2
本实施例提供的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法如下：
(1)冷匀浆：选取鲜贝肉，除去内脏，用清水清洗3次，沥水5min以上，然后按除去内脏的鲜贝肉与预冷水的重量体积比为1∶1.0，置于5℃的预冷水中匀浆5min后得贝肉匀浆液；
(2)超声波复合酶解处理：在贝肉匀浆液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶可采用市售地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶，其酶活力为2.0×105～10×105U/g，其它可达到类似效果的碱性蛋白酶也可，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的添加量为每克贝肉匀浆液中加入2500U，混匀，将上述贝肉匀浆液和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的混合液置于超声仪器中，调节频率为35kHz、功率为300W，并调节温度为50℃进行酶解50min；
(3)进一步酶解：将超声波复合酶解后的贝肉匀浆液置于50℃的水浴中进行继续恒温酶解1.5h，酶解完毕进行灭酶处理，灭酶的温度为100℃，灭酶的时间为8min，冷却后离心，离心机的转速为12000r/min，2℃下离心20min，取含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液；
(4)膜分离和纯化处理：将含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液进行膜分离，膜分离的操作压力为4.0bar，超滤温度为5℃，先用截留分子量为8kDa的超滤膜进行分离，收集滤液，滤液再用截留分子量为5kDa的超滤膜进一步分离，收集滤液，滤液再用截留分子量为1kDa的超滤膜进一步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，将所得的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液采用无水乙醇脱水后再经减压浓缩得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉。
实施例3
本实施例提供的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法如下：
(1)贝肉预处理：将冻贝肉解冻，除去内脏，用清水清洗3次，放在塑料框中沥水10min；
(2)冷匀浆：将水先预冷到8℃，称取贝肉，按重量体积比为1∶0.8加入预冷水，置于组织捣碎机中匀浆4min，得到贝肉匀浆液；
(3)加酶、超声波处理：将贝肉匀浆液置于玻璃烧杯中，添加诺维信食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L蛋白酶，丹麦NOVO公司产品，酶活为2.0×104U/g，按贝肉匀浆液的重量添加酶，每克贝肉匀浆液中添加1800U的Alcalase 2.4L蛋白酶，搅匀后，放在超声波仪器中，调节超声波工作频率为35kHz、超声波的强度为360W、控制处理温度为60℃，时间为60min；
(4)进一步酶解：经超声波处理后，将步骤(3)中的贝肉匀浆液继续在60℃恒温水浴酶解1.0h，在100℃下灭酶5min，灭酶后迅速冷却；
(5)离心：将步骤(4)中的酶解液在冷冻离心机中离心，离心机的转速为15000r/min，0℃下离心15min，取上清液；
(6)超滤：利用膜分离技术对步骤(5)中的上清液进行分离，膜分离的操作压力为3bar，超滤温度为10℃，先分别用截留分子量为6kDa的超滤膜进行分离，收集滤液，滤液再用截留分子量为1kDa的超滤膜进一步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，呈无色透明；
(7)纯化：将上述合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液经冻干得到白色抗氧化寡肽粉。
Claims (10)
1.一种合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：含以下步骤：
(1)冷匀浆：选取贝肉置于预冷水中匀浆后得贝肉匀浆液；
(2)超声波复合酶解处理：在贝肉匀浆液中加入碱性蛋白酶，混匀，将上述贝肉匀浆液和碱性蛋白酶的混合液置于超声仪器中，调节频率为35kHz、功率为280～360W，并调节温度为45～65℃进行酶解50～70min；
(3)进一步酶解：将超声波复合酶解后的贝肉匀浆液置于45～60℃的水浴中进行继续恒温酶解0.5～2h，酶解完毕进行灭酶处理，冷却后离心分离得含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液；
(4)膜分离和纯化处理：将含合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用截留分子量为5～10kDa和1kDa的超滤膜进行逐步分离，收集滤液，即得到合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液，经纯化处理得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉末。
2.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的贝肉需经预处理，所述的预处理过程为：选取冷冻贝肉解冻或鲜贝肉，除去内脏，用清水清洗2～3次，沥水5min以上。
3.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的贝肉与预冷水的重量体积比为1∶0.5～1.0。
4.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中预冷水的温度为0～10℃，匀浆时间为2～5min。
5.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的添加量为每克贝肉匀浆液中加入1800～2500U。
6.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中灭酶的温度为100℃，灭酶的时间为5～10min。
7.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中离心分离的过程是：调节冷冻离心机的转速为10000～15000r/min，在0～4℃下离心15～25min。
8.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中超滤膜分离的条件是：操作压力为3～4bar，温度为3～10℃。
9.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的纯化处理过程为：将所得的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液经冷冻干燥得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉。
10.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的纯化处理过程为：将所得的合浦珠母贝肉抗氧化寡肽液采用无水乙醇脱水后再经减压浓缩得合浦珠母贝肉抗氧化寡肽粉。
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