发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积的组合物。
本发明还提供了上述组合物的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积的组合物,其特点是,它是由表没食子儿茶素没食子酸酯以及绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯3者中至少1种组成,其重量配比如下:
表没食子儿茶素没食子酸酯 0.1~10
绿原酸 0~10
积雪草皂苷 0~10
银杏内酯 0~10。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积的组合物,其特点是,它是由表没食子儿茶素没食子酸酯以及绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯3者中至少1种组成,其重量配比如下:
表没食子儿茶素没食子酸酯 0.1~10
绿原酸 0.1~10
积雪草皂苷 0.1~10
银杏内酯 0.1~10。
以上所述的本发明的组合物配方中,表没食子儿茶素没食子酸酯为组方必备原料;绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯3者是可选原料;3种可选原料中至少1种可以与表没食子儿茶素没食子酸酯进行组方,即:可以是绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯中任意1种与表没食子儿茶素没食子酸酯组方,形成2味原料组方的组合物;也可以是绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯中任意2种与表没食子儿茶素没食子酸酯组方,形成3味原料组方的组合物;还可以是绿原酸、积雪草皂苷和银杏内酯3种与表没食子儿茶素没食子酸酯组方,形成4味原料组方的组合物,4味原料组方为优选原料组方;当可选原料中的重量配比选择“0”时,代表组方中不含有该原料。
本发明所述的各原料中:表没食子儿茶素没食子酸酯为从茶叶中提取、精制而来的多酚成分,纯度在50%以上,优选90%以上;绿原酸为从金银花、杜仲叶等富含绿原酸的植物中提取、精制而来的酚酸成分,纯度在50%以上,优选90%以上;积雪草皂苷为从积雪草中提取、精制而来的皂苷成分,总皂苷或者是积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B中至少一种成分含量在50%以上,优选70%以上;银杏内酯为从银杏、银杏叶中提取、精制而来的内酯成分,总内酯或者是银杏内酯A、B、C、J、M、K、L及白果内酯中至少一种成分含量在50%以上,优选90%以上。
本发明所述的有效成份原料可以是市售的表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、积雪草皂苷、银杏内酯,也可以是按常规提取方法从相关植物中提取所得的有效成份,也可以是现有技术中公开的任何一种提取方法所提取的有效成份。
本发明组合物的用途为在制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积药物、保健食品、化妆品中的应用,其功能包括防治呼吸道感染、***、生殖器疱疹、色素沉着等疾病,同时具有抗氧化,保护细胞和DNA受损害、美白的功效,可防治痴呆、黄褐斑,也可用于癌症的辅助治疗。
本发明提取物可制备成各种药物、保健食品、化妆品,其所包括的口服剂型有胶囊、软胶囊、片、滴丸、颗粒、口服液、泡腾片等。外用剂型包括酊剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、膜剂、霜剂、巴布剂、洗剂、搽剂、糊剂、气雾剂、喷雾剂、橡胶膏剂或者涂膜剂。制剂所需辅料可以是现有技术中所公开的任何一种可适用的药用、食用辅料,包括所需的适当基质或赋型剂,制备方法可以根据其剂型采取现有技术中公开的任何一种可适用的方法。
本发明组合物经过大量基础配比优化、筛选研究,确定了较优的部分组合及良好的功能活性,各组方原料均具有一定的协同增效功能。以下是发明人所做的药效作用实验。
实验一、本组合物不同配方抗菌活性研究。
精密定量称取各配比组合物(EGCG单用;EGCG+绿原酸5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷5∶5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5∶5;EGCG+积雪草皂苷5∶5;EGCG+银杏内酯5∶5;EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5;),用无菌水配制成20mg/ml的溶液。然后将配制的溶液分别用适量无菌水进行倍比稀释,使各药液成一系列浓度梯度,依次是:20,10,5,2.5,1.25,0.625,0.312,0.156,0.078,0.039(mg/ml)。然后取各梯度药液2ml,分别加入到无菌平皿(平皿直径9cm)中,再加入已灭菌融化的保温于55℃水浴中的MH培养基18ml,立即充分混匀,冷凝后待用。同时设空白对照,只加入20ml的琼脂培养基。
将已预先活化的各试验菌株分别接种到2ml培养液中,37℃培养过夜,再用相应的培养液作适当的稀释,使菌液浓度约为:107~108(CFU/ml)(控制菌液浓度方法:用分光光度计测定培养液的光密度,然后作适当的稀释)。然后用多点接种仪点种各试验菌于各含药的MH培养基平板上,空白对照同时进行。每点含菌量约为:104~105(CFU)。37℃,培养24小时,观察并记录各菌的最低抑菌浓度MIC值,并计算MIC50和MIC90。结果见表1~7。
表1EGCG单用对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表2EGCG+绿原酸组合物对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表3EGCG+绿原酸+积雪草皂苷组合物对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表4EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯组合物对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表5EGCG+积雪草皂苷对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表6EGCG+银杏内酯组合物对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
表7EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯组合物对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
上述结果表明各组合样品对各试验菌株如克氏肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、沙门杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、不动杆菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌等均具有一定的抗菌活性。且各EGCG组方效果均优于EGCG单方效果。
实验二、本组合物不同配方对抗甲型流感病毒、乙型流感病毒研究。
(1)病毒毒力测定:
细胞按1×105的浓度,接种到96孔细胞培养板上,每孔0.2ml,24h长成单层细胞,弃去上清,将病毒不同稀释比例(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5),加入20μL病毒液,每个浓度4个复孔,吸附1h,用Hank’s溶液洗去未吸附的病毒,加入细胞培养液1ml,37℃5%CO2培养72h。根据出现细胞病变情况,用Reed-Munch公式计算病毒的TCID50。
结果显示:甲型流感病毒的TCID50=10-3.3,乙型流感病毒的TCID50=10-4.6,腺病毒的TCID50=10-4.8。
(2)组合物对细胞的毒性作用
将MDCK细胞按1×105的浓度,接种到96孔细胞培养板上,每孔0.2ml,24h后长成单层细胞,备用。弃去上清,将含不同配比组合物(EGCG单用;EGCG+绿原酸5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷5∶5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5∶5;EGCG+积雪草皂苷5∶5;EGCG+银杏内酯5∶5;EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5)浓度的细胞培养液0.2ml加入细胞,每个浓度4个复孔,37℃5%CO2培养3d;利用MTT法测定细胞活力,进行抗病毒试验。
结果显示:EGCG单用、EGCG+绿原酸、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯、EGCG+积雪草皂苷、EGCG+银杏内酯、EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯组合物的细胞毒性最大无毒浓度分别为200、150、150、120、200、200、150mg/ml。
(3)组合物抗病毒活性
将MDCK细胞按1×105的浓度,接种到96孔细胞培养板上,每孔0.2ml,24h后长成单层细胞,备用。实验设细胞空白对照;病毒对照;EGCG单用;EGCG+绿原酸5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷5∶5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5∶5;EGCG+积雪草皂苷5∶5;EGCG+银杏内酯5∶5;EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5;共9个组。取长成单层的细胞,弃去上清,加入100μL100TCID50病毒液,吸附1h,用Hank’s液洗去未吸附的病毒,加入含不同浓度药物的细胞培养液200μl,每个浓度4个复孔,37℃5%CO2培养72h。利用MTT法测定细胞活力。结果见表8、9。
MTT法测定细胞活力:于实验结束前4h加入终浓度为0.5g/L的MTT,℃、5%CO2下作用4h后弃去上清液,每孔加入DMSO150μL,置振荡器上振荡10min使结晶充分溶解,用酶标仪490nm测定OD值,观察细胞活力。
MTT法结果表明,各个组合物组对甲型流感病毒H1N1株均具有一定的抑制作用,在一定的浓度范围与病毒对照组相比较,有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。
各组合物组对乙型流感病毒株均具有明显的抑制作用,OD值和病毒对照组相比,有显著统计学差异(P<0.05)。
表8组合物不同配方对甲型流感病毒的抑制作用(X±SD)
注:和病毒对照组相比,**P<0.01,*P<0.05
表9组合物不同配方对乙型流感病毒的抑制作用(X±SD)
注:和病毒对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。
实验三、本组合物不同配方对抗单纯性疱疹病毒II型活性研究
单纯疱疹病毒(HSV)是一种常见的传染性病原体,HSV-II可引起外阴疱疹,是***的协同诱因。而目前临床中常用的抗病毒药物往往特异性不强,或因易产生耐药毒株以及副作用等因素限制了应用。此实验旨在通过体外研究本组合物不同配方抗单纯性疱疹病毒II型的活性,探讨其对病毒性生殖***感染疾病的治疗作用。
(1)病毒滴度测定
将病毒悬液作连续10倍稀释,常规方法感染单层Vero细胞,37℃,5%CO2培养3d,观察细胞病变情况,按Reed-Muench方法计算TCID50。
(2)样品的细胞毒性测定
取对数生长期的细胞,离心(1000r/min,10min)后将细胞重悬,细胞浓度调至2×106/ml。在96孔细胞培养板上将被检样品2倍倍比稀释,共设6个梯度,每个梯度设3个重复孔,另设阳性对照组及细胞对照组。分别加细胞悬液后,置37℃,5%CO2培养箱中孵育。于第4天用MTT法用酶标仪测定各孔的OD值。按下列公式计算被检样品对细胞生长的抑制率,并计算IC50(50%inhibition concentration值)。
细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%
(3)MTT法检测化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用
在96孔平底培养板上,将待测组合物(EGCG单用;EGCG+绿原酸5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷5∶5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5∶5;EGCG+积雪草皂苷5∶5;EGCG+银杏内酯5∶5;EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5)用RPMI1640培养基进行2倍系列稀释。共6个稀释度,每孔100μl,设两个重复孔。同时设置不含组合物的未感染病毒的细胞对照组和感染病毒的病毒对照组;离心Vero细胞(1000r/min,10min),用完全培养基重悬细胞,每孔加入75μl 4×104细胞;感染HSV的每个稀释度中的两孔加入25μl病毒,对照组加入25μl培养基。每孔终体积200μl。置37℃,5%CO2培养箱中培养,第3天补加100μl新鲜培基;第6天将96孔细胞培养板低速离心后(1000r/min,10min),吸弃250μl上清,再加20μlMTT溶液(5mg/ml),37℃,5%CO2培养箱中孵育4h左右,加入20%SDS-50%DMF(pH 4.7),孵育过夜;第7天用酶标仪测定各孔的OD值,根据下面公式计算出组合物对HSV-II感染细胞的保护率,并用***法计算EC50(50%Effective concentration)值和治疗指数TI(Therapeutic index)值:
并进一步计算出治疗指数(TI=IC50/EC50)。
HSV-II接种在Vero细胞上的滴度为103.0/ml。实验用病毒浓度为80TCID50。
结果见表10。
表10本组合物不同配方对II型单纯疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用
结果表明:阳性对照AVC显示出保护HSV-II感染Vero细胞的作用,其EC50为5.33μg/ml治疗指数TI值为2814。本组合物各配方组的EC50值以及治疗指数见表。与阳性对照药物ACV相比,本组合物各配方组的治疗指数(TI)虽然偏低,但对HSV-II感染Vero细胞仍显示出了较强的保护作用。
实验四、本组合物不同配方抗人***瘤病毒的作用研究
人***瘤病毒(HPV)感染是引起***(CA)的主要病因,为探讨本组合物不同配方抗人***瘤病毒作用的效果,我们采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,观察EGCG对离体***皮损的HPV-DN的影响,发现本组合物不同配方具有抗人***瘤病毒的作用。
(1)CA混悬液的制备
从南京中医药大学第一附属医院皮肤科采集来自于***患者外***位的疣体标本(经鉴定为HPV6/11型),集中到一只离心管中,称重30mg,用玻璃匀浆器匀浆,再加入5ml生理盐水,配成6mg/ml的离体CA混悬液,备用。
(2)样品处理疣体的方法
用移液枪吸取25μl样品液和25μl CA混悬液至1.5ml离心管中,振摇均匀,使本组合物各配方组(EGCG单用;EGCG+绿原酸5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷5∶5∶5;EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5∶5;EGCG+积雪草皂苷5∶5;EGCG+银杏内酯5∶5;EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯5∶5∶5)(终浓度为100ug/ml)与疣体能充分作用,置37℃水浴箱培养,另设生理盐水组、阳性对照(阿昔洛韦)组、蒸馏水对照组。在样品处理疣体1、3、5、7天后,各取一组进行以下试验。
(3)HPV-DNA的提取
从温浴箱中取出经样品处理的CA混悬液,按试剂盒步骤提取DNA:加入50μl生理盐水,混匀后再加入100μl DNA提取液;振摇均匀,1200r/min离心10min,弃去上清液,再加入25μl DNA提取液;充分混匀,100℃沸水煮10min,1200r/min离心10min,上清液即为HPV-DNA模板。
(4)DNA扩增
取检测试剂盒中的PCR反应液37.6μl,Taq DNA聚合酶0.4μl,UNG 0.03μl于PCR反应管中,再加入HPV-DNA模板2μl,扣严管盖,置于定量PCR仪上循环扩增。HPV-DNA经高温变性、低温退火及延伸进行循环扩增,循环程序设置为:37℃,5min;94℃,1min;95℃,5sec;60℃,30sec;循环40次。
(5)定量标准曲线
用荧光探针检测定量,按照检测试剂盒要求,设立4个系列浓度的HPV-DNA定量阳性标准品,依次为5×107/ml,5×106/ml,5×105/ml,5×104/ml,经PCR检测(其检测灵敏度为1×103/ml,结果小于该浓度者判定为阴性)。以起始拷贝数的自然对数为横坐标,循环阈值为纵坐标,得到的回归直线为标准曲线,据此对样品的扩增倍数进行定量。
阳性结果以DNA扩增的定量对数值表示(单位为:拷贝/mL),说明病毒没受到破坏,其DNA得以大量扩增;阴性结果以“-”表示,表明病毒DNA受到杀灭破坏,扩增被抑制。按照以上步骤进行3次试验,测定DNA的扩增数量取平均值。结果见表11。
表11本组合物不同配方对HPV-DNA作用结果(拷贝/ml,n=3)
从上表可知:生理盐水和蒸馏水组结果为阳性,HPV-DNA经PCR扩增反应后数量可达107,可见病毒复制及生存能力极强;而经本组合物各配方作用1天后,PCR结果即为阴性,说明本组合物不同配方其对病毒有明显破环作用,抑制其复制扩增,且药效时间较长;溶剂并不干扰药物的作用效果。
实验五、本组合物不同配方对豚鼠生殖器疱疹的影响
将90只豚鼠预先取***分泌物滴板检测无HSV-2病毒感染后,随即分为6组:生理盐水对照组、EGCG单用组、EGCG+绿原酸组(5∶5)、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷(5∶5∶5)组、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯组(5∶5∶5∶5)、EGCG+积雪草皂苷(5∶5)、EGCG+银杏内酯(5∶5)、EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯(5∶5∶5)、阿昔洛韦(ACV)组,每组10只。生理盐水清洗外阴,干棉签摩擦***数次,然后用梅花针轻轻叩刺豚鼠外阴使其外阴充血和少许渗血,干净棉拭子擦净外阴。用1ml注射器吸取0.15ml HSV-2病毒株,配上灌胃针头后将针头伸入豚鼠***内约3-4cm,将病毒注入***穹隆后缓慢退出,用明胶海绵塞入***以维持毒液。针头上少许毒液滴在外阴,用玻棒轻轻涂抹均匀,使病毒深入皮肤。
症状评分方法:根据病变程度评分:0为无症状;0.5为仅红肿无水疱;1.5为单个小水疱(≤2mm);2.0为单个大水疱(>2mm);2.5个为多个小水疱或***溃疡出血;3.0为多个大水疱;3.5为严重外阴肿胀;4.0为多个大小疱融合;4.5为后肢瘫痪;5.0为外阴溃疡。
给药方法:阿昔洛韦组组豚鼠分别与造模前给与0.0775g/kg/d,灌胃5d后,按照造模方法接种病毒0.15ml,再次连续给药10d后,每天观察豚鼠全身和外阴症状。本组合物各配方组分别在造模4h后用小棉球蘸取浓度为0.1g/ml、0.05g/ml的溶液0.1ml,用注射器吸取0.1ml各浓度受试品,配上灌胃针头后将针头伸入豚鼠***内约3-4cm,将病毒注入***穹隆后缓慢退出,针头上少许溶液滴在外阴,用玻棒轻轻涂抹均匀,使病毒深入皮肤。在接种病毒后第1、3、5、7、9天分别用0.1ml生理盐水冲洗各组豚鼠外阴,取冲洗液滴板测定病毒滴度。结果见表12、13。
表12本组合物不同配方对豚鼠***内病毒滴度的影响(x±s,n=10)
*表示P<0.05,**表示P<0.01
由上表可见,生理盐水组接种后第1天感染滴度最高,以后随时间延长逐渐下降。其他给药组随着给药天数的增加,病毒滴度基本呈逐渐下降的趋势,其中以阿昔洛韦组下降趋势最为明显,并且在第3、7、9d与空白对照组比较有极显著差异(P<0.01),第5天有显著性差异(P<0.05);同时本组合物不同配方各组在给药第5、7、9d病毒滴度与空白组比较有显著性差异(P<0.05),表现出了较好的抗病毒效果。
表13EGCG对豚鼠生殖器疱疹模型外阴临床症状的影响(x±s,n=10)
*表示P<0.05,**表示P<0.01
由上表可见,接种病毒后的豚鼠均出现类似于人类外阴生殖器疱疹的症状,主要表现为外阴红、肿、水疱、溃疡、结痂。生理盐水对照组大多2d出现水疱,5~7d病变最为明显,以后症状逐渐减轻。本组合物不同配方各组大多3~5d出现水疱,且症状评分均低于生理盐水对照组。外阴症状评分组间比较,有显著差异(P<0.05,P<0.01)。
实验六、用清除有机自由基DPPH法评价本组合物不同配方的抗氧化能力
本实验从体外清除自由基能力方面进行探讨组合物配方的抗氧化能力,以便进一步验证其抗氧化能力。
1、DPPH自由基样品溶液的配制
精密称定一定量的DPPH,溶于95%乙醇中,后再用95%乙醇定溶致1000ml,使DPPH的最终浓度为38.60mg/L,避光保存。
2、本组合物不同配方溶液样品的配制
减量法精确称定400.00mg本组合物不同配方受试品,用95%乙醇定溶致1000ml,使终浓度为400mg/L。
3、坏血酸溶液样品的制备
减量法精确称定400.00mg坏血酸,用95%乙醇定溶致1000ml,使其终浓度为400mg/L。
4、本组合物不同配方清除自由基能力的测试步骤
(1)取其中一玻璃试管加入5ml的DPPH自由基样品溶液,再加入等量95%乙醇溶液,混合均匀,37℃避光反应1h,以95%乙醇为空白管调零,用紫外分光光度计测定其在517nm的吸光度,同个样品重复测定三次,取平均值记为A0。
(2)另取容量为10ml的玻璃试管,按顺序依次每管精密加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml的本组合物不同配方溶液样品,然后每管再加入5ml的DPPH自由基样品溶液,不足10ml的部分用95%乙醇补足。各试管均匀混合,37℃避光反应1h后以,95%乙醇为空白管调零,用紫外分光光度计测定其在517nm的吸光度,同个样品重复测定三次,取平均值分别记录数值。
(3)重复上步骤,试管中加样以坏血酸溶液替换掉受试品溶液样品,加样体积及顺序同上,结果纪录。
(4)另取容量为10ml的玻璃试管,按顺序依次每管精密加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml的本组合物不同配方溶液样品,然后每管以95%乙醇溶液补足致10ml,各试管均匀混合,37℃避光反应1h后以,95%乙醇为空白管调零,用紫外分光光度计测定其在525nm的吸光度,同个样品重复测定三次,取平均值分别记录数值。
(5)重复上步骤,试管中加样以坏血酸溶液替换掉受试溶液样品,加样体积及顺序同上,结果纪录。
(6)重复步骤(1)~(5)两次,每次结果分别记录。
5、数据处理与计算
根据以上检测结果计算样品对DPPH自由基溶液的清除率,计算公式如下: 清除率=[1-(An-Bn)/A0]×100%
计算结果用SPSS 13.0统计软件处理,结果以x±s表示,结果见表14。
表14DPPH法评价本组合物不同配方体外清除自由基能力结果(x±s)
由上表结果可知,本组合物不同配方具有很强的清除自由基能力,相同浓度下其清除自由基能力强于坏血酸。
实验七、本组合物不同配方体内抗氧化活性研究
购入动物后实验室环境下正常实验三天,后随即分为9组:空白对照组、模型对照组、EGCG单用组、EGCG+绿原酸组(5∶5)、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷(5∶5∶5)组、EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯组(5∶5∶5∶5)、EGCG+积雪草皂苷(5∶5)、EGCG+银杏内酯(5∶5)、EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯(5∶5∶5),雌性各半,每组10只。其中各配方组分别灌胃给予0.5g/kg的受试品溶液,给药体积为20ml/kg,空白、模型两组给于等容积的生理盐水,每天给药一次,共给药30d。末次给药当天晚各组小鼠禁食不禁水8h,后分别再灌胃给药1次,给药30分后,除空白组外,各组灌胃给予0.4mg/kg溴代苯油,灌胃量10ml/kg,18小时后处死动物,取血清,按试剂盒说明测定其SOD和GSH-Px水平。实验结果见表15。
表15本组合物不同配方对溴代苯油致小鼠血清抗氧化能力降低模型
血清SOD和GSH-Px的影响(x±s)
△△表示与空白组比较P<0.01,**表示与模型组比较P<0.01
由上表可知:造模后模型组小鼠血清中SOD和GSH-Px水平明显减低(P<0.01),说明造模成功。本组合物不同配方给药组小鼠血清中SOD和GSH-Px水平与模型组相比升高明显(P<0.01),说明本组合物不同配方具有较强的体内抗氧化能力。
实验八、本组合物不同配方抗实验性色素沉着研究
1、皮肤色素沉着动物造模、实验分组
取豚鼠90只,雌性,体重230~250g,取10只作为正常组,其余随机分为5组。分组:(1)正常组:给予赋形剂;(2)模型组:给予赋形剂;(3)EGCG单用组:0.25g/kg;(4)EGCG+绿原酸(5∶5)组:0.25g/kg;(5)EGCG+绿原酸+积雪草皂苷(5∶5∶5)组:0.25g/kg;(6)EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯组(5∶5∶5∶5):0.25g/kg;(7)EGCG+积雪草皂苷(5∶5)0.25g/kg;(8)EGCG+银杏内酯(5∶5)0.25g/kg;(9)EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯(5∶5∶5)0.25g/kg。除正常组以外,其余各组豚鼠用波长约320nm的中波紫外线(UVB)每日照射豚鼠一次,每次照射时间60min,连续30日。造模同时每日给药。
2、一般情况观察
每日观察豚鼠的一般情况以及背部脱毛部位皮肤变化情况。
3、皮肤黑色素细胞病理形态学观察、黑色素阳性目标计算机图像分析
末次涂药24h后,脱颈椎处死豚鼠,剥取豚鼠右侧背部去毛皮肤一块,以10%***固定。常规石蜡包埋切片,片厚4~5μm,载玻片经防脱片处理后捞片、烘片。再经脱蜡至水、抗原修复。用HMB45(melanoma黑素瘤)为第一抗体,以ElivisionTMplus免疫组化方法显示表皮中的黑色素颗粒,以评价黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情况。
各组每只动物去毛部位皮肤各制成1张病理切片,每片观察5个不同视野,找到阳性目标后,用病理图像分析仪对目标图像进行定量分析:得出每张切片5个视野的目标面积、目标个数、平均灰度、平均光密度、积分光密度等。
4、实验结果
一般情况:
紫外线照射20日后观察造模豚鼠脱毛部位皮肤变化情况,发现各造模组脱毛部位皮肤色泽暗于正常组,部分动物皮肤逐日出现黑色斑块,以模型组最为严重,各给药组情况好于模型组。
病理结果:
正常组 表皮为复层鳞状上皮,基底层细胞为立方形或柱状,其内可见个别黑色素颗粒染色阳性的细胞。真皮可见毛囊、皮脂腺及毛发,上皮下为致密的纤维***。未见黑色素颗粒染色阳性的细胞。
模型组 表皮结构正常,低倍镜下基底层内查见多量胞质染深棕褐色的细胞,高倍镜下见细胞内充满免疫组化染色阳性的颗粒,因颗粒数量多,致使胞质呈深棕褐色。细胞数量多,常密集成行。
EGCG单用组:基底层内查见较多的胞质染深棕褐色的细胞,细胞数量较模型组减少,染色强度减弱。
EGCG+绿原酸组:基底层内胞质染深棕褐色的黑色素细胞数量较模型组减少,多数区域黑色素细胞散在分布。
EGCG+绿原酸+积雪草皂苷组:基底层内胞质染深棕褐色的黑色素细胞数量明显减少,黑色素细胞呈散在、稀疏分布,染色浅。
EGCG+绿原酸+积雪草皂苷+银杏内酯组:皮肤基底层黑色素细胞数量明显减少,黑色素细胞散在分布,很少密集排列。真皮及上皮下组织内未查见黑色素细胞。
EGCG+积雪草皂苷组:黑色素细胞数量较模型组减少,大部分区域黑色素细胞散在分布。
EGCG+银杏内酯组:基底层内胞质的黑色素细胞数量减少。
EGCG+积雪草皂苷+银杏内酯组:基底层内胞质染深棕褐色的黑色素细胞数量较模型组减少,黑色素细胞稀疏分布,染色较浅。
对造模豚鼠黑色素细胞面积、数量的影响
造模后模型组豚鼠黑色素细胞目标面积、目标个数、明显高于正常组(p<0.05,p<0.01);各给药组豚鼠黑色素细胞指标明显低于模型组,提示本组合物各配方组对模型黑色素面积、数量的增加具有一定的抑制作用。结果见表16。
表16本组合物不同配方对造模豚鼠黑色素细胞面积、数量的影响(X±S)
注:与正常组比较△△p<0.01;与模型组比较*p<0.05,**p<0.01。
对造模豚鼠黑色素细胞染色深浅度的影响
黑素细胞染色颜色越深,灰度值越小,光密度越大。积分光密度是平均光密度与面积的乘积,颜色越深,面积越大,积分光密度越高。造模后豚鼠黑色素细胞平均灰度值明显降低,平均光密度值、积分光密度值明显升高(p<0.01);组合物各组平均灰度值升高,平均光密度值、积分光密度值降低,与模型组比较有显著性差异(p<0.05,p<0.01),提示各组合物配方组染色细胞颜色较模型组明显变淡。结果见表17。
表17本组合物不同配方对造模豚鼠黑色素细胞染色深浅度的影响(X±S)
注:与正常组比较△△p<0.01;与模型组比较*p<0.05,**p<0.01。
上述结果提示本组合物各配方组对模型黑色素面积、数量、颜色的增加具有一定的抑制作用。
经以上实验证明,本发明组合物具有确切的抗菌、抗呼吸道感染病毒、抗***、生殖器疱疹等生殖器病毒、抗氧化、清除自由基、抗色素沉着等作用。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案,以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明,而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸0.1。加入常规辅料,制成胶囊或软胶囊,口服用于防治呼吸道感染。
实施例2。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸0.1;积雪草皂苷0.1。加入常规辅料,制成片剂,口服用于癌症的辅助治疗。
实施例3。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸0.1;积雪草皂苷0.1;银杏内酯0.1。加入常规辅料,制成滴丸,口服用于防治早老性痴呆。
实施例4。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;绿原酸1;银杏内酯0.1。加入常规辅料,制成霜剂,外用防治皮肤老化和色素沉着。
实施例5。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;绿原酸1;积雪草皂苷0.1。加入常规辅料,制成凝胶剂,外用防治***、生殖器疱疹等。
实施例6。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;积雪草皂苷1;银杏内酯1。加入常规辅料,制成滴丸,口服用于防治血管性痴呆。
实施例7。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯2;银杏内酯1。加入常规辅料,制成膏剂,外用防治黄褐斑。
实施例8。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.5;积雪草皂苷0.5。加入常规辅料,制成膜剂,外用防治皮肤老化。
实施例9。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;绿原酸5;积雪草皂苷5;银杏内酯5。加入常规辅料,制成洗剂,外用防治色素沉着。
实施例10。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;绿原酸1;积雪草皂苷5;银杏内酯5。加入常规辅料,制成泡腾片,口服用于防治衰老。
实施例11。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;绿原酸1;积雪草皂苷5。加入常规辅料,制成胶囊,口服用于防治病毒性感染,如流感。
实施例12。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;绿原酸1;积雪草皂苷2;银杏内酯1。加入常规辅料,制成雪花膏,外用达到养颜、美白的目的。
实施例13。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;绿原酸10;积雪草皂苷10;银杏内酯10。加入常规辅料,制成滴丸,口服用于防治早老性痴呆。
实施例14。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸10;积雪草皂苷0.1;银杏内酯10。加入常规辅料,制成片剂。
实施例15。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;绿原酸0.1;积雪草皂苷10;银杏内酯0.1。加入常规辅料,制成颗粒剂。
实施例16。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;绿原酸5;积雪草皂苷1;银杏内酯1。加入常规辅料,制成丸剂。
实施例17。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯2;绿原酸8;积雪草皂苷8;银杏内酯2。加入常规辅料,制成滴丸。
实施例18。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯3;绿原酸4;积雪草皂苷3;银杏内酯4。加入常规辅料,制成胶囊。
实施例19。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;绿原酸7;积雪草皂苷2;银杏内酯3。加入常规辅料,制成霜剂。
实施例20。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯2;绿原酸4;积雪草皂苷8;银杏内酯7。加入常规辅料,制成口服液。
实施例21。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸或积雪草皂苷或银杏内酯10。加入常规辅料,制成胶囊或软胶囊,口服用于防治呼吸道感染。
实施例22。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;绿原酸或积雪草皂苷或银杏内酯0.1。加入常规辅料,制成胶囊或软胶囊。
实施例23。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;绿原酸或积雪草皂苷或银杏内酯5。加入常规辅料,制成片剂。
实施例24。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;绿原酸或积雪草皂苷或银杏内酯1。加入常规辅料,制成口服液。
实施例25。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯3;绿原酸或积雪草皂苷或银杏内酯6。加入常规辅料,制成胶囊。
实施例26。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;绿原酸0.1;积雪草皂苷或银杏内酯10。加入常规辅料,制成片剂,口服用于癌症的辅助治疗。
实施例27。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;绿原酸10;积雪草皂苷或银杏内酯0.1。加入常规辅料,制成霜剂,外用防治皮肤老化和色素沉着。
实施例28。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯2;绿原酸3;积雪草皂苷或银杏内酯5。加入常规辅料,制成凝胶剂,外用防治***、生殖器疱疹等。
实施例29。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯1;积雪草皂苷1;积雪草皂苷或银杏内酯1。加入常规辅料,制成滴丸,口服用于防治血管性痴呆。
实施例30。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯2;积雪草皂苷0.1;银杏内酯8。加入常规辅料,制成膏剂,外用防治黄褐斑。
实施例31。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;积雪草皂苷1;银杏内酯2。加入常规辅料,制成膜剂,外用防治皮肤老化。
实施例32。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯5;积雪草皂苷5;银杏内酯5。加入常规辅料,制成洗剂,外用防治色素沉着。
实施例33。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯8;积雪草皂苷6;银杏内酯4。加入常规辅料,制成泡腾片,口服用于防治衰老。
实施例34。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯0.1;积雪草皂苷10;银杏内酯10。加入常规辅料,制成胶囊,口服用于防治病毒性感染,如流感。
实施例35。一种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗色素沉积作用的组合物,它是由以下重量配比的原料组成,表没食子儿茶素没食子酸酯10;积雪草皂苷10;银杏内酯1。加入常规辅料,制成雪花膏,外用达到养颜、美白的目的。