CN101883861A

CN101883861A - 利用hima表达减少的重组发酵单胞菌属菌株从包含木糖的培养基生产乙醇的方法

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Publication number: CN101883861A
Application number: CN2008801137733A
Authority: CN
Inventors: P·V·维塔宁; L·陶; K·克诺克; Y·张; P·G·凯米; M·张; Y-C·仇; M·A·弗兰登
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Alliance for Sustainable Energy LLC
Current assignee: Alliance for Sustainable Energy LLC; EIDP Inc
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: BRPI0817152A2; CN101883861B; ES2361385T3; WO2009058938A3; AU2008318720B2; AU2008318720A1; EP2205753A2; ATE506447T1; JP2011515067A; BRPI0817152A8; DE602008006446D1; US7897396B2; EP2205753B1; WO2009058938A2; US20090203099A1; CA2704539C; CA2704539A1

Abstract

通过筛选发酵单胞菌属突变体文库，发现himA基因涉及乙酸盐对发酵单胞菌属性能的抑制效应。将利用木糖的发酵单胞菌属菌株进一步工程化以减少himA基因的活性，发现其当在包含木糖尤其是在存在乙酸盐的混合糖培养基中培养时，与亲本菌株相比乙醇产量提高。

Description

利用HIMA表达减少的重组发酵单胞菌属菌株从包含木糖的培养基生产乙醇的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2007年10月30日的美国临时申请60/983761的优先权，该申请以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和美国能源部与管理美国国家可再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory)的可持续能源联盟(Alliancefor Sustainable Energy，LLC)签署的合同号DE-AC36-08GO28308的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。

发明领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，发现了编码整合宿主因子的α亚基的himA基因涉及发酵单胞菌属(Zymomonas)的乙酸盐抗性。开发了利用木糖的发酵单胞菌属菌株，该菌株对himA基因进行了基因修饰，它在存在乙酸盐的情况下表现出改进的乙醇产量。

发明背景

通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。运动发酵单胞菌属(Zymomonasmobilis)是一种产生乙醇的细菌，它可利用葡萄糖、果糖、和蔗糖生长，经由Entner-Douderoff途径将这些糖代谢成CO₂和乙醇。

希望使用水解的木质纤维质生物质通过发酵生产乙醇，所述木质纤维质生物质能够提供丰富的可利用低成本碳底物。木糖是水解的木质纤维质材料中的主要戊糖。虽然运动发酵单胞菌属的野生型菌株不能利用木糖作为碳源，但是已经工程化了能够利用该糖生长的重组菌株(US 5514583，US 5712133，WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science267：240-243)。这些菌株经修饰用于表达木糖代谢所需的四种酶：1)木糖异构酶，它催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107；Zhang等人(1995)Science 267：240-243)。具有这四种酶并且在细胞的正常代谢机制下，三分子木糖被转化成两分子6-磷酸葡萄糖和一分子3-磷酸甘油醛，它们随后通过葡萄糖支路途径被转化成乙醇和CO₂(图1)。

虽然已经成功地工程化了运动发酵单胞菌属菌株用于木糖代谢，该菌株在木糖上的生长以及乙醇生产不像它在葡萄糖上一样好。甚至在理想环境下，木糖代谢比葡萄糖代谢慢3至4倍(Lawford等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86：277-293)，在不利条件下差距更大。因为碳通量缓慢，木糖上稳态水平的ATP也增加较慢(Kim等人(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1)：186-193)，因此运动发酵单胞菌属在该糖上生长时更易于受到胁迫和抑制剂的影响(Joachimsthal等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84-86：343-356；Kim等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84-6：357-370)。使用水解木质纤维质生物质进行发酵时会遇到的特别胁迫是乙酸盐(Kim等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84-86：357-370)，它来自预处理和糖化加工期间半纤维素中的乙酰化木糖残基。

运动发酵单胞菌属应对乙酸和其它有机酸相关的胁迫的机制仍未被阐明，并且文献中无关于该过程中起作用的基因的报道。因此使用合理设计来基因工程化具有高乙酸盐抗性的菌株不是当前的选择。另一方面，已经描述了具有高乙酸盐抗性的运动发酵单胞菌属突变体(Joachimsthal等人(1998)Biotechnol.Lett.20(2)：137-142；Jeon等人(2002)Biotechnol.Lett.24：819-824；美国专利申请20030162271)。在用亚硝基胍(NTG)进行随机化学诱变后，进行选择以生成这些突变体，但是在这些实例的任何一个中未鉴定出负责抗乙酸盐表型的修饰基因。也未测定是否需要一种突变或多种突变以在存在乙酸盐的情况下进行更好的发酵。因此当前从上文所引用的研究中不知道如何使用定向基因工程将乙酸盐抗性赋予运动发酵单胞菌属的其它菌株。

需要鉴定涉及乙酸盐抗性的基因，可修饰该基因以产生发酵单胞菌属抗乙酸盐菌株，该菌株用于发酵从预处理并糖化的木质纤维质生物质中制备的水解产物，从而生产乙醇。

发明内容

本发明涉及使用利用木糖的发酵单胞菌属菌株来生产乙醇，所述菌株在存在乙酸盐的条件下具有改善的性能。申请人已经发现乙酸盐抗性受编码整合宿主因子α亚基的himA基因的影响。利用木糖的发酵单胞菌属具有进行了基因修饰的himA基因，当它在存在乙酸盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中培养时，其乙酸盐抗性提高。himA修饰使内源himA基因的表达减少。在这些条件下，himA经修饰的菌株的木糖利用率和乙醇产量显著高于具有正常himA基因表达的可比较菌株。

因此，本发明提供从包含木糖的混合糖培养基生产乙醇的方法，所述方法包括：

(a)提供能够利用木糖生产乙醇的重组发酵单胞菌属菌株，所述菌株包含至少一种减少整合宿主因子α亚基蛋白(HimA)的表达的基因修饰；和

(b)在包含木糖的混合糖培养基中培养所述(a)的菌株，其中所述菌株利用木糖作为碳源来生产乙醇。

附图简述和序列描述

通过下面的发明详述、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成本专利申请的一部分。

图1示出四种酶(加框表示)的图表，它们已经用于工程化运动发酵单胞菌属使其能利用木糖以及用于利用木糖生产乙醇的生物化学途径。

图2示出pMODgap/aada的质粒图谱，该质粒用于生成ZW801-4中的转座子***文库。

图3是W801-4在存在两种不同量乙酸盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中的生长示意图。

图4是富集的转座子***突变体文库培养物与对照菌株ZW801-4的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量的比较示意图，它们在具有100g/L葡萄糖，90g/L木糖、和6g/L乙酸盐的培养基(A)或具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸盐培养基(B)中生长。

图5是在包含葡萄糖的培养基中的ZW801-4(A)和转座子***突变体AcR#3(B)在不同量乙酸钾情况下的生长示意图。

图6是在包含葡萄糖的培养基中生长43小时后的ZW801-4(A)和转座子***突变体AcR#3(B)的终点值示意图，所述培养基具有不同的乙酸盐。

图7是AcR#3和ZW801-4在具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸盐的培养基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量示意图。

图8是ZW801-4(A)和AcR#3(B)在100％模拟水解产物培养基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量示意图，所述培养基包含～9.5g/L的乙酸盐和190mM的铵离子，以及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。

图9是在构建himA基因敲除菌株载体pLDHTc139#7(A)、pLDHTc139#7-9WW(B)、和pLDHSp-9WW(C)期间制备的质粒的图谱。

图10A示出用于制备***himA***载体pHimA的himA侧接DNA的引物的基因组位置，图10B是pHimA质粒的环形图谱。

图11是ZW801-4(A)和ZW801-4::ΔhimA(B)在100％模拟水解产物培养基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇产量示意图，所述培养基包含～9.5g/L的乙酸盐和190mM的铵离子，以及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。

图12是ZW801-4(A)、AcR#3(B)、和ZW801-4::ΔhimA(C)在包含葡萄糖的培养基中的生长示意图，培养基中以钾盐形式加入0或8g/L的乙酸盐。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。

随同在光盘上提供了序列表。包含序列表的光盘的内容遵照37CFR 1.52(e)，其以引用方式并入本文。提交两张彼此相同的光盘。所述光盘标记有“Copy 1-Sequence Listing”和“Copy 2 Sequence listing”。它们包含以下文件：CL4041 seq list.ST25。

SEQ ID NO：1是运动发酵单胞菌属himA编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2和3是序列转座子***位点的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：4和5是包含ldh基因和一些围绕DNA的DNA片段的PCR扩增引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6和7是包含来自pACY184的抗四环素盒的DNA片段的PCR扩增引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8和9是用于制备loxP位点的寡核苷酸序列，所述loxP位点用于***质粒pLDHTc139#7。

SEQ ID NO：10和11是用于制备loxP位点的寡核苷酸序列，所述loxP位点用于***质粒pLDHTc139#7-9W。

SEQ ID NO：12和13是包含来自质粒pHP15578的抗奇放线菌素盒的DNA片段的PCR扩增引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14和15是用于PCR扩增3’himA的侧接DNA片段引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：16和17是用于PCR扩增5’himA的侧接DNA片段引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：18和19是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的5’himA侧接DNA和其染色体副本之间发生的单交换事件。

SEQ ID NO：20和21是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的3’himA侧接DNA和其染色体副本之间发生的单交换事件。

SEQ ID NO：22和23是PCR引物的核苷酸序列，该引物用于确认在pHimA中的5’和3’himA侧接DNA序列和染色体中的himA基因之间发生的双交换事件。

SEQ ID NO：24是运动发酵单胞菌属的GFOR编码区的完整核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是ZW801-4中遭中断的GFOR编码区的完整核苷酸序列(从初始起始密码子至初始终止密码子)。

SEQ ID NO：26是运动发酵单胞菌属HimA蛋白的氨基酸序列。

发明详述

本发明的公开内容描述了用于制备乙醇的方法，所述方法包括在包含糖(例如葡萄糖、木糖和乙酸盐)混合物的培养基中培养利用木糖的重组发酵单胞菌属菌株；其中所述菌株包含经修饰的所述菌株内源himA基因。对所述himA基因的修饰减少了所述基因的表达，并且使得经himA修饰的发酵单胞菌属菌株当在如本文所述的培养基中培养时具有改善的性能。由经himA修饰的发酵单胞菌属菌株生产的乙醇可用作化石燃料的替代能源。

以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。

将“整合宿主因子”缩写为IHF。

“基因”指能够表达特定蛋白质的核酸片段，其可包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含***到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。

术语“基因构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白的核酸片段。在基因构建体中基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。

如本文所用，术语“表达”指转录和衍生自基因的有义(mRNA)或反义RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“超表达”指在转基因生物中产生的基因产物超出在正常生物或未转化生物中产生的基因产物的水平。“共抑制”指产生能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源性基因表达的正义RNA转录物。(美国专利5,231,020)。

如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。

如本文所用，术语“无功能基因”指野生型菌株中通常不表达编码蛋白的基因，其中所述基因是内源的。可以在任何水平上中断无功能基因的表达，例如转录、RNA加工、或翻译。无功能基因通常很少表达或不表达其编码的蛋白。然而它也可编码酶活性低于野生型蛋白的修饰蛋白。

如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多种核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一种核酸序列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。

术语“高浓度混合糖”指培养基中的总糖浓度导致利用木糖的发酵单胞菌属的生长受到抑制。这通常在当总糖浓度高于约100g/L时发生，并且糖浓度越高，该效应越严重。然而，生长抑制开始发生时的精确糖浓度高度依赖于培养基中的其它组分。

术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。

术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质材料也可包含半纤维素。

术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。

术语“糖化”指从多糖中生产可发酵糖。

术语“预处理的生物质”意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。

“生物质”指任何纤维质或木质纤维质材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉多糖、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包括附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物或纤维，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。

“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。也可在糖化前预处理生物质。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with GeneFusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；以及Ausubel，F.M.等人，In Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing和Wiley-Interscience公布于1987年。

本发明涉及工程化利用木糖的发酵单胞菌属菌株，所述菌株在存在乙酸盐的条件下具有改善的性能。乙酸盐是发酵单胞菌属的抑制剂，如果在发酵期间乙酸盐存在的话，它会减少生长和乙醇产量。乙酸盐是发酵单胞菌属中的代谢副产品，并且它也是经预处理和糖化的生物质的组分。因此使用来源于生物质的糖用于发酵的一个挑战是克服乙酸盐对生物催化剂的抑制效应以提高乙醇产量。本文证明了当发酵培养基包含乙酸盐时，工程化中断利用木糖的运动发酵单胞菌属中的内源himA基因改善发酵性能，包括木糖利用率和乙醇产量。此外，本发明涉及生产乙醇的方法，其中本发明的发酵单胞菌属菌株在包含木糖的培养基中培养。

利用木糖的发酵单胞菌属宿主菌株

可使用能利用木糖作碳源的任何发酵单胞菌属菌株(包括运动发酵单胞菌属菌株)作为制备本发明所用的菌株的宿主。尤其有用的是已经进行了工程化的发酵单胞菌属菌株，它能将木糖发酵成乙醇。内源基因可提供部分代谢途径，或者可以通过任何已知的基因操纵技术进行改变以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代谢。例如，内源转酮醇酶可在建立木糖代谢途径时补充其它导入的酶活性。如以引用方式并入本文的US 5514583所述，通常已将四种基因导入运动发酵单胞菌属中表达四种涉及木糖代谢(图1)的酶。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。此外，转酮醇酶和转醛醇酶是戊糖磷酸化途径中的两种酶，它们将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与糖酵解Entner-Douderoff途径的中间体(6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛)，该途径使木糖代谢成乙醇。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源包括黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonads)、和发酵单胞菌属(Zymomonas)。尤其有用的是大肠杆菌(E.coli)的编码区。

将编码DNA序列可操作地连接至发酵单胞菌属细胞中表达的启动子如发酵单胞菌属甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)和发酵单胞菌属烯醇酶启动子(ENO启动子)。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得嵌合基因导入发酵单胞菌属并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合的方法整合进基因组中。特别有用的是利用木糖的菌株，它们包括CP4(pZB5)(US5514583)、ATCC31821/pZB5(US 6566107)、8b(US 20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)、和ZW658(ATTCC#PTA-7858)。

附加地将发酵单胞菌属菌株工程化以利用除木糖之外的其它糖，该菌株正常情况下不能利用这些糖，本方法也可使用这种菌株。将利用木糖的运动发酵单胞菌属菌株进一步工程化以利于***糖的一个实例描述于US 5843760，该专利以引用方式并入本文。

也可使用进行附加工程化以减少非期望的木糖醇副产物的发酵单胞菌属菌株。这些菌株描述于共有的和共同未决的美国专利申请#11/862566以及未决的US专利公布#US20080187973A1，这些专利以引用方式并入本文。描述的菌株ZW800、ZW801-4、和ZW801-6具有编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的中断基因。GFOR基因的表达中断可使用下文所述的用于中断himA基因的相同方法完成，该方法使用GFOR编码区(SEQ ID NO：24)的已知序列。围绕GFOR编码序列的DNA序列也可用于一些修饰方法，并且可用于发酵单胞菌属全基因组序列(GenBank Accession#AE008692)。发现减少GFOR的表达会降低木糖醇产量并提高乙醇产量。

发现himA涉及乙酸盐抗性

虽然对乙酸盐对发酵单胞菌属生长和产量的抑制效应的基础机制已经相当了解(Lawford等人(1993 Applied Biochemistry andBiotechnology 39-40：687-699；Kim等人(2000)Applied Biochemistry andBiotechnology 84-86：357-370)，但是仍未鉴定出该微生物在乙酸盐抗性中起作用的基因。申请人已经令人惊讶地发现对himA基因的基因操纵使得发酵单胞菌属在存在抑制浓度乙酸盐的情况下性能良好。具体地讲，申请人已经发现中断发酵单胞菌属himA基因能改善包含乙酸盐的培养基的生长和乙醇产量。用于发现本文实施例1和2中所述的himA的抗乙酸盐作用的突变文库富集方法是一种完全无偏方法，并且不基于任何预测结果。

未预料到中断发酵单胞菌属himA基因能改善该菌株在存在乙酸盐情况下的性能，因为文献中没有任何该基因在发酵单胞菌属或任何其它微生物中对乙酸盐抗性起作用的指示或建议。himA基因编码的蛋白本文称为“HimA”蛋白，它是整合宿主因子(IHF)的α亚基(SEQID NO：26)，整合宿主因子是一种也包括由himD基因编码的β亚基的蛋白。因此，IHF是一种由两种密切相关的亚基构成的异源二聚体蛋白。已经在大肠杆菌中对IHF进行了研究，研究显示一种DNA结合和DNA弯曲蛋白涉及DNA重组、DNA复制、和基因表达调控(Friedman(1988)Cell 55：545-554；Arfin等人(2000)J.Biol.Chem.”275：29672-29684)。大肠杆菌中的基因表达谱实验已经证明himA基因失活显著地改变至少120种基因的表达水平，并且该操纵活化比它抑制的基因更多的基因(Arfin等人(2000)J.Biol.Chem.”275：29672-29684)。也已知大肠杆菌himA基因转录最活跃的时期是当细胞从指数期过渡到稳定期时，并且认为himA基因产物在此过程中起到作用。因此himA影响广泛的DNA过程，并且是大肠杆菌中基因表达的调节子，但是这些被认为起到调节作用的许多基因中没有基因明显地与乙酸盐抗性相关。此外，已经使用微阵列对暴露于抑制浓度乙酸盐后的大肠杆菌中基因表达的整体分析进行了检查，himA基因不在受该处理影响的86种基因中(Arnold等人(2001)J.Bacteriol.183：2178-2186)。最后，发酵单胞菌属中的himA基因的作用是未知的。我们也未发现文献中有任何显示himA基因失活导致任何类型的有益效应的报道。实际上考虑到大量基因和蛋白可能受这一操纵的影响，这将是一个令人惊讶的实例。因此这一推断是合理的：本领域的技术人员不能预测到himA基因的失活将赋予运动发酵单胞菌属或任何其它微生物较高的乙酸盐抗性。

发酵单胞菌属HimA蛋白与大肠杆菌同源物(GenBank保藏号NP_416227)有46％相同。最密切相关的已知蛋白是鞘氨醇单胞菌的HimA同源物(GenBank保藏号YP_001264041)，使用运动发酵单胞菌属himA编码区(SEQ ID NO：1)作查询序列，通过tBLASTx搜索NCBI数据库测定它们有67％相同。

himA基因表达的改变

对本发明的利用木糖的运动发酵单胞菌属菌株进行了基因修饰，使得整合宿主因子α亚基蛋白(HimA)的表达减少或消失。通常通过减少himA基因表达的修饰使得HimA蛋白表达减少。减少HimA蛋白表达可包括例如减少编码mRNA翻译的修饰，或者降低HimA蛋白稳定性的修饰。HimA蛋白的表达减少导致在存在乙酸盐的情况下具有改善的性能。可使用本领域技术人员已知的任何用于减少蛋白表达的基因修饰方法改变HimA的表达。方法包括但不限于去除整个或部分himA基因、将DNA片段***himA基因(***启动子或编码区)使得编码蛋白不表达、将添加终止密码子或移码的突变导入himA编码区使得功能性蛋白不表达、以及将一种或多种突变导入himA编码区以改变氨基酸使得表达的活性蛋白无功能或功能减弱。此外，可通过表达反义RNA或干涉RNA阻止himA的表达，并且可导入导致共抑制的构建体。本领域的技术人员利用已知的himA编码序列(SEQ ID NO：1)以及围绕himA编码序列的运动发酵单胞菌属DNA序列能轻易地实施所有这些方法，所述序列在运动发酵单胞菌属全基因组序列中是可用的(GenBank Accession#AE008692)。

如本文实施例5和6所例示的那样，制备基因修饰的himA菌株的尤其适用的方法是使用himA侧接DNA序列介导的同源重组，该序列与奇放线菌素抗性基因或其它标记基因结合，导致标记基因***himA编码区，使得功能性蛋白不表达。此外，标记基因可通过位点特异性重组结合到位点上，以便对应的位点特异性重组酶的随后表达，所述抗性基因从himA基因中切除。位点特异性重组留下了中断himA基因表达的重组位点。也可以构建同源重组载体以在切除标记后在himA基因中留下去除，这是本领域技术人员熟知的方法。

优选完全消除himA的表达，然而在很大程度上减少himA的表达也是本发明的一个实施方案。在该实例中，无功能的himA基因指在正常情况下不行使功能，使得存在的编码蛋白低于正常水平。一些基因失活方法可导致一些持续的低水平表达，例如共抑制。本文中修饰himA菌株指具有减弱的HimA酶活性或无HimA酶活性的基因修饰菌株。

himA修饰菌株的性能

本发明的himA修饰的利用木糖运动发酵单胞菌属菌株当在包含一定量木糖的混合糖培养基中培养时具有改善的性能。该培养基也可包含一定量的乙酸盐。培养基中希望使用从糖化生物质中制备的糖用于利用木糖的运动发酵单胞菌属。通常生物质进行过预处理，例如如专利公布WO2004/081185以及共有的和共同未决的US专利公布US20070031918A1所述进行预处理，然后用糖化酶进行处理，参见Lynd，L.R.，等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)。包含木糖和其它糖(即，“混合糖培养基”)的预处理和糖化生物质的水解产物通常也包含乙酸盐。生物质中的半纤维素包含乙酰化木糖残基，并且所述乙酸盐在非常温和的条件下释放。虽然从处理过的生物质中除去乙酸盐是一个解决问题的方法，加入该步骤将大幅度增加制备纤维质乙醇的费用。因此，能够工程化运动发酵单胞菌属菌株以提供较高的乙酸盐抗性是一项大幅度的改善。

如本文所分析，在存在乙酸盐的情况下改善的性能包括生长速度、木糖利用率、以及乙醇产量。修饰himA的利用木糖运动发酵单胞菌属菌株相对于具有相同基因特征的菌株(同基因菌株)具有改善的性能，但是缺少对himA基因的修饰。用于himA基因修饰的亲本菌株通常用于该比较中。在任何乙酸盐水平上都能看到改善，其中未修饰himA的菌株不能充分发挥其生长和乙醇生产的潜力。取决于培养基的组成和pH控制，改善通常在乙酸盐浓度为约5g/L或更高的情况下发生。“乙酸盐抑制”程度也取决于pH，因为抑制物质实际上是乙酸，而乙酸和乙酸盐的平衡取决于pH。不控制pH的话，运动发酵单胞菌属像其它革兰氏阴性菌一样迅速酸化培养基。如果pH从5.8降至4.8，由于乙酸的～4.8pK_A，乙酸浓度增加5倍。因此乙酸(抑制剂)的实际浓度取决于培养基的pH以及培养基中存在的质子化的和非质子化的物质总量。

在存在乙酸盐的葡萄糖和木糖浓缩混合物中，未修饰和修饰了himA的菌株在控制pH的条件下同样地利用葡萄糖，其中葡萄糖在木糖消耗之前已经消耗了很多。然而，在发酵晚期，在所有葡萄糖已经消耗完之后，修饰himA的菌株与具有正常himA基因表达的同基因亲本菌株相比，能够将更多的木糖转化成乙醇。

himA基因修饰赋予的较高乙醇生产水平取决于在pH控制条件下的培养基组分，包括糖含量和不同类型糖的比率，以及存在的其它抑制剂。例如，在存在126g/L葡萄糖、107g/L木糖和10％乙酸盐的情况下，修饰himA的菌株与未修饰himA的同基因菌株相比，其乙醇滴定度具有4％的提高。当培养基也包含其它抑制剂时，乙醇产量的提高程度可能甚至更大。例如，在包括110g/L葡萄糖、90g/L木糖、～9.5g/L乙酸盐和190mM铵离子(另一种运动发酵单胞菌属生长抑制剂(Agrawal(1989)Biotechnology and Bioengineering 34：278-281)，它可以以这一浓度存在于生物质水解产物中)的模拟水解产物培养基中，乙醇产量具有约11％的提高，并且木糖利用更完全。因此，在较苛刻的条件下，在修饰himA的菌株和同基因的未修饰himA的菌株之间的乙醇产量差值可能甚至大于所引用的实例的差值。例如，在较高糖浓度下，或者当除铵离子和乙酸盐之外还存在来源于水解产物的其它抑制剂时。因此取决于培养条件，乙醇产量的改善可以是至少约4％或更高。

发酵生产乙醇

在本发明的方法中，在包含任何糖混合物(也包括木糖)的培养基中培养本发明的修饰himA的、利用木糖的菌株。具体地讲，本发明的菌株可在生物质水解产物或生物质水解产物的稀释液中培养。在生物质水解产物中糖化生物质制备糖，所述糖通常可包括木糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、和/或***糖的混合物。优选地是包括木糖和葡萄糖的混合糖组合物，其中可存在附加的糖。混合物中不同糖的比率可以不同，木糖通常占糖总量的至少约10％。木糖优选地介于约40％和约60％之间。果糖存在于通过糖化一些生物质(例如蔗渣)制备的糖中，并且可置换一部分木糖或果糖，使得木糖保持占糖混合物的至少约10％。此外，***糖来源于半纤维素，因此是来源于包含半纤维素的生物质糖化的混合糖的典型组分。在本发明的菌株发酵期间，木糖是其中一种用作乙醇生产碳源的糖。为了获得最大的乙醇产量和发酵效率，希望在包含包括木糖在内的浓缩混合物的培养基内培养本发明的修饰himA的、利用木糖的菌株。这允许直接使用生物质糖化糖，或者使用其低倍稀释液，从而减少发酵体积，这是商业规模的乙醇生产所期望的。使用较高的糖浓度以便可制备较高浓度的乙醇。发酵培养基中的混合糖的浓度通常为至少约120g/L，最多约300g/L。混合糖尤其可用的高浓度介于约150g/L和约235g/L之间。

在生产乙醇所需的高浓度混合糖条件下，可在发酵培养基中包括山梨醇用于培养修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属，该方法如共有的和共同未决的US专利公布#US20080081358A1所述，该专利以引用方式并入本文。山梨醇(D-山梨醇和/或L-山梨醇)可存在于培养基中，其浓度介于约2mM和200mM之间。培养基中较合适的终浓度介于约2mM和100mM之间，优选地介于5mM和20mM之间。甘露糖醇可替代山梨醇用于培养基中，或者与山梨醇组合用于培养基中。此外，发现可使用半乳糖醇和/或核糖醇替代山梨醇或甘露糖醇，或者与山梨醇或甘露糖醇组合使用。山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或它们的组合都使用与所述山梨醇浓度相同的浓度。

运动发酵单胞菌属在其中进行发酵并且产生乙醇的培养基中培养。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至少约24小时，并且可以运行48小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵运行温度可在介于约25℃和约40℃的范围内，发酵pH可在约4.5至约7.5。尤其合适的温度介于约30℃和约37℃之间。尤其合适的pH也包括使pH保持在高于乙酸pK_A至少约1pH单位的水平，使得pH介于约5.8和7.5之间，以降低乙酸对乙酸盐的比率。

可以在实验室规模的发酵罐中和按比例增加的发酵中(其中生产了商业规模量的乙醇)，在包含包括木糖在内的混合糖的培养基中培养修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属。此外，如上所述该培养基可包含乙酸盐。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例如，从修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属中的大规模生产可以通过分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭***，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向***中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批***中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞通常缓慢通过静态延滞期到达生长期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些***中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他***中可以获得稳定或指数后期生成。

标准分批式***的一种变型是补料分批***。分批补料培养方法也适用于修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属的培养，并且该方法包括典型的分批***，除了一点不同：底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式***是有用的。补料分批式***中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素(例如pH以及废气例如CO₂的分压)进行评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于Biotechnology：A Textbookof Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。

乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式***，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。

连续或半连续培养允许调节影响细胞生长、代谢、或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他***中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续***努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度达到最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock，同上所述。

尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。所需修饰himA的、利用木糖的运动发酵单胞菌属菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为30℃至约37℃，在回旋振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含相似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长至OD₆₀₀介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源如酵母提取物或大豆产物(0-10g/l)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一种附加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/L)耗尽时将混合糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。通过自动加入氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、或其它强碱，控制/保持发酵肉汤的pH。将发酵罐温度控制在所需范围内。为了最小化泡沫，按需加入消泡剂(任何种类--硅氧烷基的、有机物基的等)到罐中。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。

任何上述调整条件和这些条件中的附加变化是本领域技术人员熟知的，它们是通过本发明利用木糖的、修饰himA的重组发酵单胞菌属菌株生产乙醇的适用条件。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。

一般方法

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments withGene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

缩写的含义如下：“kb”指千碱基，“bp”指碱基对，“nt”指核苷酸，“hr”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“L”指升，“ml”指毫升，“μL”指微升，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指克，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔，“nm”指纳米，“μmol”指微摩尔，“pmol”指皮摩尔，“Cm”指氯霉素，“Cm^r”指氯霉素抗性，“Spec^r”指奇放线菌素抗性，“cfu”指每单位菌落数，“OD₆₀₀”指在600纳米波长下测得的光密度，“SE”指标准误差，“rpm”指每分钟转数，“～”指大约。

实施例1

生成ZW801-4基于转座子的敲除/超表达文库

在利用木糖的运动发酵单胞菌属重组菌株中构建基于转座子的基因组敲除/超表达文库以筛选抗乙酸盐突变体。使用转座子生成文库有两个首要原则。第一，它是完全无偏的方法，不需要作任何对在乙酸盐抗性中起作用的该基因的事先了解。第二，易于鉴定负责所需表型的中断基因，因为它用选择性标记“标记”过。易于生成文库的菌株是ZW801-4。如以引用方式并入本文的美国专利申请#60/847813所详述，ZW801-4通过中间体菌株ZW800衍生自ZW658(ATCC#PTA-7858)。ZW800通过从侧接有野生型loxP位点的抗奇放线菌素盒(Spec^r-盒)的***质粒双交换***编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的基因进行构建。所得GFOR敲除突变体显示具有降低的木糖醇产量，这是一种木糖代谢的有害副产物，并且在用葡萄糖和木糖进行的混合糖发酵期间具有更高的乙醇产量。然后通过Cre介导的Spec^r-盒切除将ZW800转化成ZW801-4。消除选择性标记在GFOR开放阅读框的中间留下一个单独的野生型loxP位点，它导致产生了过早截去翻译蛋白的框内终止密码子。此外，作为设计***构建体的结果，ZW801-4中的GFOR编码序列在围绕loxP位点的区域丢失了～72bp的初始野生型GFOR核苷酸序列。ZW801-4中的突变GFOR编码区的序列是SEQ ID NO：25。像它的中间前体(ZW800)一样，ZW801-4不生成任何可检测的木糖醇，因为它不产生功能性GFOR酶。

用于生成ZW801-4基因组敲除/超表达文库的方法基于Epicentre(Madison，WI)转座技术，该技术使用pMOD^TM-2<MCS>转座子构造载体(Transposon Construction Vector，Cat.No.MOD0602)。该质粒包括一种氨苄青霉素抗性基因(ampR)、一个大肠杆菌复制起点(ori)、和一个多克隆位点，所述多克隆位点位于Tn5转座酶相互作用的两个嵌合末端(Mosaic Ends，ME)之间。就本发明的专利申请而言，如图2所示将pMOD^TM-2<MCS>转化成pMODgap/aadA，这是通过将运动发酵单胞菌属的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Pgap)的Spec^r-盒(它具有自身启动子)和强组成型启动子***位于两个ME之间的多克隆位点；Pgap启动子和Spec^r-盒取向相反。因此，在转座期间使用该构建体随机***运动发酵单胞菌属染色体中的DNA片段包含Spec^r-盒和Pgap启动子。将Pgap启动子加到转座子上以提高文库的遗传多样性，因为它能潜在地改变邻近转座子***位点的运动发酵单胞菌属染色体基因的表达。

ZW801-4基因组敲除/超表达文库由～17,500种独立突变体组成，并且甘油原液的滴定量是～7.1×10⁸Spec^r菌落形成单位数(cfu)每毫升。这翻译成～1个转座子***事件/115种核苷酸，它基于转座子随机***序列和～2000种平均大小为～1kb的基因是约8x的全基因组覆盖度。因为运动发酵单胞菌属的低转化频率，期望无突变体或非常少的突变体将具有一种以上的转座子***序列。

实施例2

筛选ZW801-4基于转座子的敲除/超表达文库以获得具有较强乙酸盐抗性的突变体

筛选ZW801-4基因组敲除/超表达文库以获得如下所述的抗乙酸盐突变体。然而在进行该筛选之前，重要的是建立用于突变体富集方法的合适选择条件。目标是为了通过两个因素中的至少一个找到减缓生长速率的乙酸盐浓度，但仍旧允许将细胞分成几代以便生长较快的突变体能积聚起来。在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中、在与方法有关的条件下进行筛选也是重要的，因为以前的实验已经表明渗透压和乙酸盐以协同方式抑制生长。最后，控制pH也是至关重要的，因为真正的抑制化合物是乙酸盐，并且如果不控制pH，质子化物质对非质子化物质的比率将显著提高，这是因为细菌细胞酸化生长培养基。例如，如果pH从5.8降至4.8，乙酸浓度将提高5倍，因为该弱有机酸的pKA是～4.8。

图3限制两种不同浓度的乙酸盐对ZW801-4的生长速率和生物质终产量的抑制效应，使用该菌株生成所述文库。这些实验使用乙酸钾，并且下文给定的终浓度是基于以克每升加入的盐的乙酸盐组分。控制pH的生物反应器包含mRM3S培养基(10g/L酵母提取物，2g/LKH₂PO₄，1g/L MgSO₄，5mM山梨醇)加上100g/L的葡萄糖，90g/L的木糖和5g/L或6g/L的乙酸盐；pH5.8，温度30℃，以150rpm进行搅拌。基于图3和其它实验显示的结果，选择5g/L的乙酸盐进行文库筛选，因为该抑制剂浓度满足上述的两个原则。

为了富集抗乙酸盐突变体，使用以下规程。将文库甘油原液(OD₆₀₀＝4.3；～7.1×10⁸Spec^rcfu/ml)的等分试样(2mL)加入20mL的SM培养基(10g/L酵母提取物，2g/L KH₂PO₄，1g/L MgSO₄，75g/L葡萄糖，25g/L木糖，初始pH5.8)中，并且将该培养物在30℃培养1.5小时。在恢复期后，离心收获细胞并重悬于2.0mL的相同生长培养基中。然后将细胞悬浮液(～7×10⁶Spec^r cfu)的等分试样(10μL)接种到15mL的mRM3S培养基中，该培养基包含100g/L葡萄糖，90g/L木糖，和有助于最小化pH变化的4g/L碳酸氢钾；在加入细胞前用浓磷酸将初始pH调节到5.8，初始OD₆₀₀是～0.0025。这是用于突变体富集方法的种子培养物。它在30℃下生长至OD₆₀₀为～0.5，然后将7.5mL培养物接种到控制pH的生物反应器中。150mL的最终培养物包含mRM3S培养基加上100g/L的葡萄糖，90g/L的木糖，5g/L的乙酸盐，并且通过自动加入KOH将pH保持在5.8。在30℃下生长～24小时后，将培养物的等分试样(OD₆₀₀～0.5)转移到其中包含具有相同组合物的新生长培养基的新生物反应器中，初始OD₆₀₀为～0.02。基本如上所述另外重复这一步骤六次。通常每隔24-36小时转移细胞一次，反应器中的初始OD是～0.02至～0.03。因此，在两次转移期间有至少五代。在第七轮突变体富集程序后，制备培养物的甘油原液用于进一步的表征。

图4A显示具有高糖和乙酸盐的控制pH的生物反应器实验的结果，该实验在第七次转移后用富集的突变体培养物进行。该实验的对照物是亲本菌株ZW801-4。种子培养物在30℃下在SM培养基中生长至OD₆₀₀为～4.5，并且用10％的种菌开启生物反应器。最终的150mL培养物包含mRM3S培养基加上100g/L葡萄糖，90g/L木糖和6g/L乙酸盐。在150rpm下搅拌，分别将pH保持在5.8，将温度保持在30℃。在不同时间将1.0mL的培养物等分试样取出，使用配备折射指数检测器(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)的HP 1100进行HPLC分析，以测定发酵肉汤中存在的葡萄糖、木糖、和乙醇的浓度。在HPLC分析之前，离心移除细胞并通过0.22μm的乙酸纤维素Spin-X离心管过滤器(Costar，catalog number 8160)过滤上清液以除去小颗粒。在AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)上分离化合物，该柱子在55℃下，在等度条件下使用0.6mL/min的流速并使用0.01N H₂SO₄作流动相。使用已知浓度的可靠标准品定量受关注的峰值，结果用g/L表示。

图4A提供的结果显示富集的突变体文库培养物在发酵晚期具有较快的木糖利用速度和较快的乙醇生产速度。注意这发生在消耗完所有葡萄糖后，并且乙醇浓度接近毒性水平。然而，到两个实验的末期培养物已经消耗了所有糖并制备了相同量的乙醇。当使用浓度略高的糖(105g/L葡萄糖和100g/L木糖)和较多乙酸盐(9g/L)重复该实验时，能观察到相似的现象(图4B)，因此证实该结果是可复制的。

实施例3

突变株的基因表征

为了了解在选择过程中富集了何种类型的突变体，在第二次生物反应器实验(图4B)期间从文库培养物中分离单菌落。在24小时的时间点移除培养物的等分试样，细胞在包含MMG培养基(50g/L的葡萄糖，10g/L的酵母提取物，5g/L的蛋白胨，2.5g/L的(NH₄)₂SO₄，0.2g/L的K₂HPO₄，和1mM的MgSO₄)的琼脂板上生长。在厌氧条件下，在30℃培养48小时后，随机选择十七种所得菌落进行DNA序列分析以测定转座子***的位点。使用以下方法进行该分析。将所述菌落在50μL水中稀释，并且使用GenomiPHI扩增试剂盒(GE Healthcare LifeSciences Cat.No.25-6600-1)扩增基因组DNA。简而言之，将1μL细胞悬浮液加入到9μL Lysis试剂中，并且将混合物加热至95℃，保持3分钟，然后立即冷却至4℃。接下来将9mL酶缓冲液和1μL Phi 29DNA聚合酶加入溶解样本中。在30℃扩增18小时后，在65℃加热灭活聚合酶10分钟，然后将样本立即冷却至4℃。

然后向扩增样本(8μL)的等分试样中加入16mL的BigDye v3.1Sequencing Reagent(PN#4337457 Applied Biosystems，Foster City，CA)、1μL的Thermofidelase(Fidelity Systems，Gaithersburg，MD)、12μL的分子生物级水(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、和3μL的10μM引物：SpecT-FOR(SEQ ID No：2：GTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTC)或SpecT-Rev(SEQ ID No：3：CTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGG)。注意这些引物均与用于生成ZW801-4基因组敲除文库的转座子部分的Spec^r-盒杂交，但是它们的取向相反。然后如下进行热循环测序反应：96℃3分钟，随后进行200个循环(95℃30秒+55℃20秒+60℃2分钟)，4℃贮存。在测序之前，使用Edge Biosystem(Gaithersburg，MD)纯化板移除未掺入的ddNTP。将全部40-mL测序反应混合物吸移到预离心的96孔纯化板的一个孔中，所述板在Sorvall RT-7冷冻离心机中，在5000x重力条件下离心5分钟。然后将纯化后的反应物直接置于Applied Biosystems 3730DNA测序仪上，并用自动碱基判定测序。

引人注目的是，进行测序的所有17种菌落均具有***himA开放阅读框(运动发酵单胞菌属基因组(GenBank保藏号AE008692)从核苷酸#1138224至#1138565的反向互补序列)的转座子，并且鉴定了三个不同的***事件。十一种菌落(包括AcR#3，参见下文)在nt#1138413具有转座子***序列，四种菌落在nt#1138267具有***序列，两种菌落在nt#1138508具有***序列。因此，所有三个***事件发生在DNA的250bp片段中。在第七轮突变体富集程序后65％的himA敲除突变体在nt#1138413具有转座子***序列，这一事实表明该事件可赋予比其它两个***事件更快的生长速度或更高的存活能力。序列分析也观察到另一个令人感兴趣的结果。虽然理论上Tn5转座子能够将其自身以两个方向***DNA，它从选择方法中回收的所有三个***事件中具有相同的取向，即，Pgap启动子指向与himA开放阅读框相反的方向。

上述测序结果清楚地表明图4显示的实验具有混合种群的细胞，而不是纯化菌株。因此，选择AcR#3进行进一步表征himA表型，因为该菌株在nt#1138413具有转座子***序列，这是最频繁的分离事件。

实施例4

himA基因失活在方法相关的条件下对乙酸盐抗性和发酵性能的效应

AcR#3比ZW801-4对乙酸盐的抗性更强

用于突变体选择方法的生长培养基除了抑制水平的乙酸盐之外还包含高浓度的葡萄糖和木糖。因此在第七轮富集后观察到的发酵性能改善(图4)可能与渗透压或在木糖上较好的生长有关，因为木糖不像葡萄糖一样容易利用。也可能已经富集了的抗乙醇的突变体，因为推测它们在使用的实验条件下也将生长较快或者存活时间较长。为了排除这些其它的可能性并且了解himA基因失活是否真地赋予较高的乙酸盐抗性，在以下条件下比较菌株AcR#3和亲本菌株ZW801-4。实验在33℃下，在摇瓶(在50mL管中有20mL培养物)中进行，并且生长培养基包含10g/L酵母提取物，2g/L KH₂PO₄，1g/L MgSO₄，10mMKHCO₃(有助于保持pH)，50g/L葡萄糖和0、8、或12g/L乙酸盐，该乙酸盐以钾盐的形式加入；乙酸盐的浓度基于钾盐的乙酸盐组分决定。在加入细胞之前用磷酸将初始pH调节至5.8，并且在往复振荡器上轻轻搅拌培养物(150rpm)。种子培养物在无乙酸盐的相同培养基中生长至指数期后期(OD₆₀₀～1.4)，实验培养物的初始OD₆₀₀是0.03。必须注意到这些条件是在缺少乙酸盐情况下的运动发酵单胞菌属生长的理想条件，因为无渗透压并以优选的葡萄糖底物作为碳源。此外，该实验中能生成的乙醇的最高浓度是＜25g/L，它对运动发酵单胞菌属生长仅有较小效应或无效应。

在缺少乙酸盐的情况下，AcR#3和ZW801-4的生长动力学相似，并且根据如图5显示的最终的OD₆₀₀值，它们生产相同量的生物质。然而AcR#3菌株(图5B)具有比亲本菌株(图5A)更高的乙酸盐抗性。例如，ZW801-4生长在8g/L乙酸盐条件下几乎完全停滞，然而该抑制剂浓度仅对AcR#3具有可忽略不计的效应。实际上，himA敲除突变体对12g/L乙酸盐的抗性高于ZW801-4对8g/L乙酸盐的抗性。重复该实验能够获得相同的结果。重要的是要记得，当生长培养基的pH不受控制时乙酸盐的抑制能力较强，如图4所示的在生物反应器中的实验那样。在无pH控制的摇瓶实验中，细胞酸化培养基并且乙酸/乙酸盐的比率显著提高，如上所述该质子化的物质抑制细菌生长。

因为钾离子可能至少部分地导致上述实验中观察到的对两种菌株的生长抑制，其它来源的乙酸盐进行测试是重要的。用于这组实验的条件与上述的那些条件相同，但是该分析也包括乙酸钠和乙酸铵。在所有情况下乙酸根阴离子的浓度是8g/L(如上文定义)。图6显示了在43小时时间点不同培养物的最终OD₆₀₀值。ZW801-4(图6A)被8g/L的乙酸盐强烈抑制，无论使用的是哪种乙酸盐。这一观察结果清楚地指示在这些实验中的主要抑制剂是乙酸，而乙酸盐中的一价阳离子在所使用的浓度下对生长仅有较小效应或无效应。虽然所有三种乙酸盐也对AcR#3(图6B)的生长具有负面影响，当乙酸盐浓度仅为8g/L时，对该菌株的抑制不显著。图5和图6显示的实验合在一起，提供了AcR#3比亲本菌株ZW801-4乙酸盐抗性更强的明确证据。

AcR#3比ZW801-4在高糖加乙酸盐混合物中表现更好

当在与用于“混合种群”突变体相同的实验条件下测试AcR#3时(图4B)，它的表现胜过ZW801-4，并且在两种培养物之间的差异比较早实验中的差异更大(图7)。与以前的结果一致，所述改善仅仅在发酵后期，在消耗了所有葡萄糖并仅有木糖作剩余碳源后是明显的。实际上，图7显示的时间段接近的检查揭示AcR#3的葡萄糖利用和乙醇生产的初始速率些微较慢。然而，在发酵后期，在消耗了所有葡萄糖后，根据木糖利用曲线的斜率，明显地看出AcR#3能够以比ZW801-4更快的速率将木糖转化成乙醇。

在上述实验中不能评估AcR#3的全部潜力，因为使用的条件下，甚至对照菌株也能够在实验末期利用所有糖。为了消除这一限制，使用较严苛的条件再次测试AcR#3和ZW801-4。温度从30℃升温至33℃，并且使用更高浓度的葡萄糖和木糖。种子培养物在30℃下在SM培养基中生长至OD₆₀₀为～4.4，并且用10％的种菌开启生物反应器。最终的150mL培养物包含mRM3S培养基加上126g/L葡萄糖，107g/L木糖和10g/L乙酸盐。在150rpm下搅拌，分别将pH保持在5.8，将温度保持在33℃。ZW801-4进行三次平行实验，AcR#3进行两次平行实验，表1给出了葡萄糖、木糖、乙酸盐、和乙醇的终点值(67小时)(平均值±SE)。如实施例2所述进行发酵肉汤的HPLC分析，表中所有化合物的浓度以g/L表示。在这些较严苛条件下AcR#3比亲本菌株ZW801-4消耗多～10％的木糖并生产多～4％的乙醇。

表1：在控制pH的发酵罐中的木糖、乙醇、和木糖醇的终点值，其中ZW801-4和AcR#3菌株在高糖和乙酸盐中生长。

菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇
菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇	ZW801-4	0	27.1±1.4	10.8±0.1	90.3±0.3

菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇
菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇	AcR#3	0	18.7±0.4	10.8±0.1	93.8±0.2

AcR#3比ZW801-4在100％模拟水解产物中表现更好

在存在一定浓度铵离子和乙酸根离子的情况下评估AcR#3和ZW801-4的性能，期望所述铵离子和乙酸根离子存在于使用氢氧化氨预处理方法制备的生物质水解产物中。这是一个关键实验，因为它已经预测在氢氧化铵预处理的玉米秸秆水解产物发酵期间的铵离子的浓度可能超过180mM，而高浓度的铵离子抑制运动发酵单胞菌属的生长(Agrawal(1989)Biotechnology and Bioengineering 34：278-281)。用于这些实验的合成100％模拟水解产物100％MH)培养基包含5g/L酵母提取物，15mM(NH₄)₂HPO₄，160mM乙酸铵，1g/L MgSO₄和10mM山梨醇(pH5.8)。因此，在加入种子培养物后，在100％MH中的乙酸盐和铵离子终浓度分别为～9.5g/L和190mM。该实验在控制pH的生物反应器中进行。种子培养物在30℃下在SM培养基中生长至OD₆₀₀为～4.4，并且用10％的种菌开启生物反应器。最终的150mL培养物包含100％MH加上110g/L葡萄糖和90g/L木糖。在150rpm下搅拌，分别将pH保持在5.8，将温度保持在33℃。在不同时间移除等分试样用于发酵肉汤的HPLC分析，该分析使用如实施例2所述的相同方法。来自同时进行的一对代表性实验的结果显示于图8：在8A中的是ZW801-4，在8B中的是AcR#3。

与以前的观察结果一致，当葡萄糖是仅有的供代谢的糖时，AcR#3菌株的乙醇生产速率不增加。然而，AcR#3的优异性能在当木糖是仅有碳源时的发酵后期表现的非常明显。到那时候ZW801-4已经消耗了所有葡萄糖，乙醇浓度已经＞65g/L，该乙醇浓度甚至是运动发酵单胞菌属的杀菌浓度。高浓度的乙酸盐和铵离子增加了该严苛环境，它们都能加强乙醇的毒性。因为乙醇含量持续增加，木糖代谢变得越来越慢，最后停滞。AcR#3也发生了相同的一幕，但是持续时间延长了。因为AcR#3对乙酸盐有较高的抗性，与ZW801-4相比，它能够在毒性环境下存活更长的时间，并且因此实际上能够消耗生长培养基中的所有木糖并生产更多的乙醇。

重复两种菌株用100％MH进行的实验两次或更多次，结果实际上是相同的。表2中给出了三个实验的统计学分析，其中使用了葡萄糖、木糖、乙酸盐和乙醇的终点值(48小时)；所有浓度以g/L表示(平均值±SE)。用独立生长的种子培养物接种所有六个生物反应器。在100％MH中，AcR#3比ZW801-4多消耗～14g/L的木糖，这使得乙醇最终滴定量从82g/L提高到91g/L，该增长率超过了10％。这些结果甚至比表1给出的高糖加乙酸盐实验中获得的那些结果更高。当生长培养基中存在铵离子和乙酸盐时，胁迫水平提升到甚至更高的水平，并且himA基因失活的有益效果变得较为明显。像AcR#3这样的具有较高乙酸盐抗性的菌株明显地对环境中的其它抑制剂较有耐受性，像乙醇和铵离子。

表2：在控制pH的发酵罐中的葡萄糖、木糖、乙醇、和乙酸盐的终点值，其中ZW801-4和AcR#3菌株在100％模拟水解产物中生长。

菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇
菌株	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇	ZW801-4	0	15.6±3.9	11.5±0.5	81.9±2.8
AcR#3	0	1.0±0.2	10.7±0.4	91.3±0.7	ZW801-4	0	15.6±3.9	11.5±0.5	81.9±2.8

实施例5

在ZW801-4中生成敲除himA基因的***构建体

虽然迄今所得的结果有力地表明AcR#3的抗乙酸盐表型由中断himA基因产生，但有两个其它因素可能潜在地对其产生作用。如实施例1所述，用于生成ZW801-4基因组敲除/超表达文库的转座子包含Spec^r-盒和运动发酵单胞菌属Pgap启动子。这些元件取向相反，并且它们在转座期间都***himA开放阅读框中。因为运动发酵单胞菌属Pgap启动子是一个强组成型启动子，它可能已经改变了接近himA转座子***位点的基因的表达水平。AcR#3的至少部分抗乙酸盐表型也可能是由其它基因中的自发突变产生，所述其它基因也可能已经使得文库突变体富集过程(实施例2)期间的生长加快。为了排除这些可能性并了解himA基因失活是否单独导致AcR#3的较高乙酸盐抗性，我们设计了***构建体用于敲除ZW801-4中的himA基因。如下文详述，该非复制质粒具有一个抗奇放线菌素盒，但是不包含Pgap启动子。

本发明中用于敲除ZW801-4(“pHimA”)中的himA基因的***构建体基本上来源于另一个***构建体(“pLDHSp-9WW”)，该构建体前文用于通过宿主介导的、双交换的同源重组，并使用抗奇放线菌素基因作选择性标记，***失活运动发酵单胞菌属中的D-乳酸脱氢酶基因。pLDHSp-9WW也来源于许多以前生成的其它构建体。所有这些构建体的初始前体是可商购获得的质粒载体pNEB193(New England Biolabs#N3051S)。选择这一质粒是因为它能在大肠杆菌中复制，但是它不能在运动发酵单胞菌属中复制。在himA敲除构建体生成过程中涉及的所有步骤和中间体在下文按时间先后顺序描述，从质粒pNEB193开始。

构建pLDH193

pNEB193用SbfI和AscI进行双重消化以***下文所述的DNA片段中。限制性位点是唯一的，并且位于质粒的多克隆区域中。用SbfI/AscI线性化的pNEB193质粒DNA片段使用Qiagen’s QIAQuick纯化试剂盒(目录号#28104)，按照制造商规程进行纯化。被克隆到pNEB193中的DNA***序列是2268bp片段，该片段从分离自菌株ZW1(ATCC#31821)的运动发酵单胞菌属基因组DNA中使用Qiagen’sBlood & Cell Culture Maxi试剂盒(目录号#13362)进行PCR扩增。用于PCR扩增该片段的合成寡核苷酸是引物1和2。

引物1(SEQ ID NO：4)

CTACTCATTTcctgcaggTGGTAACTCATTGCGCGCTC

引物2(SEQ ID NO：5)

CATCTTACTggcgcggccAAAAATCTGCGGCTGACATAC

用下划线标示的引物1(正向引物)的碱基在编码磷酸甘油变位酶(pgm)的开放阅读框的3’末端与运动发酵单胞菌属基因组(GenBank保藏号AE008692)的核苷酸1262739-1262720杂交，然而小写字母对应于加到引物5’末端的SbfI位点。用下划线标示的引物2(反向引物)的碱基与运动发酵单胞菌属基因组的核苷酸1260490-1260472杂交，该核苷酸序列位于编码醇脱氢酶I(adhI)的开放阅读框的上游，然而小写字母对应于加到引物5’末端的AscI位点。因此是PCR扩增靶标的2268bp的DNA片段由起始于SbfI位点并终止于AscI位点的以下元件组成：(a)pgm基因的3’末端，(b)编码D-乳酸脱氢酶的全ldh基因，和(c)adhI基因的5’非翻译区。用SbfI和AscI切割PCR产物，将所得DNA片段连接到如上文所述的用SbfI/AscI线性化的pNEB193载体中。将连接反应混合物用于转化大肠杆菌JM110并将转化细胞置于包含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基上。包含具有正确尺寸***序列的抗氨苄青霉素的转化子最初通过PCR，使用重悬菌落(“菌落PCR”)以及引物1和2进行鉴定。随后用SbfI和AscI对质粒DNA进行限制性消化分析和通过用抗氨苄青霉素转化子进行菌落PCR生成的2268bp的片段的DNA序列分析来确认阳性克隆。选择用于进一步操纵的质粒称为pLDH193。

构建pLDHTc139#7

质粒pLDH193具有唯一的NcoI位点，该位点大约位于ldh开放阅读框的中间。该位点用于***赋予四环素抗性的DNA片段。用于该操纵的抗四环素盒(Tcr-盒)通过PCR生成，所述PCR使用质粒pACYC184(GenBank保藏号X06403)作为DNA模板并使用引物3和4作为PCR引物。

引物3(SEQ ID NO：6)：

ACTCATTTccatggCGATCGCACTATgcgggccgc

引物4(SEQ ID NO：7)：

ATCTCACTccatggCCGGCCAACTAttaatt

引物3(正向引物)的用粗体下划线标示的碱基杂交到四环素抗性基因启动子的上游。引物3也具有三个加到其5’末端的限制性位点(NcoI、AsiSI、和NotI)。NcoI位点以正常小写字母表示。AsiSI位点用细线进行下划线标示。Not I位点以斜体小写字母表示。引物4(反向引物)的用粗体下划线标示的碱基杂交到四环素抗性基因的终止密码子上游，并且该引物也具有三个加到其5’末端的限制性位点(NcoI、FseI、和PacI)。类似于上述的标签，NcoI位点以正常小写字母表示，FseI位点用细线进行下划线标示，PacI位点以斜体小写字母表示。用引物3和4生成的1448bp的Tc^r-盒用NcoI切割，并且通过制备琼脂糖凝胶电泳进行纯化。然后将所得DNA片段连接到唯一的NcoI位点上，该位点存在于质粒pLDH193的ldh开放阅读框中。为了最小化无***序列的载体再环化的可能性，在连接之前用小牛肠碱性磷酸酶使NcoI消化的pNEB193脱磷酸。将连接反应混合物导入大肠杆菌JM110并将转化细胞置于包含20μg/mL四环素的LB培养基上。包含具有正确***序列的质粒的抗四环素转化子通过用NcoI、AsiSI、NotI、FseI、和PacI进行的限制性消化分析来鉴定，并且通过使用合适引物的PCR分析确认Tc^r盒的取向。图9A显示了选择用于进一步操纵的质粒的环状示意图(命名为pLDHTc139#7)。在另一个实施方案中，使用宿主介导的、双交换的同源重组并在用作选择性标记的四环素上生长，将该***构建体成功用于在ZW1中对D-乳酸脱氢酶基因的***失活(“中断”或“敲除”)。

构建pLDHTc139#7-9WW

已经证明能使用pLDHTc139#7来“敲除”ZW1中的D-乳酸脱氢酶基因，然后修饰该构建体以便它将可能使用Cre重组酶在基因中断后从染色体中移除选择性标记。为了达到该目标，利用四个侧接Tc^r-盒的唯一限制性位点，称为在5’末端的AsiSI和NotI以及在3’末端的PacI和FseI，将两个野生型loxP位点(Lee和Saito，1998)加到pDHTc139#7上。第一个loxP位点在用两种酶切割构建体后，***质粒pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点之间，并且纯化所得大DNA片段。***该位置的loxP位点从两种合成寡核苷酸(Oligos 5和6)中生成，所述寡核苷酸均在它们的5’末端进行了磷酸化。

寡核苷酸5(SEQ ID NO：8)：

cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc

寡核苷酸6(SEQ ID NO：9)：

ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat

寡核苷酸5和6彼此互补，当它们一起退火形成全长双链野生型loxP位点时，该位点在两端具有单链突出端，它允许DNA片段在pLDHTc 139#7的AsiSI和NotI位点之间连接。在寡核苷酸5和6中的大写字母对应于全长野生型loxP位点，而小写字母指示用于将双链DNA片段连接到pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点中的核苷酸。

连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B，将转化细胞置于包含20μg/mL四环素的LB培养基上。包含具有loxP位点的质粒的抗四环素转化子通过限制性消化分析、使用合适引物的菌落PCR、以及对相关区域的DNA序列分析来鉴定，其中loxP位点正确***pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点。选择用于进一步操纵的质粒称为pLDHTc139#7-9W。

接下来，在用两种酶切割质粒并纯化所得大载体片段之后，将第二个野生型loxP位点***在pLDHTc139#7-9W中的Tc^r-盒的另一端的PacI和FseI位点之间。***该位置的loxP位点也从两种合成寡核苷酸(Oligos 7和8)中生成，所述寡核苷酸均在它们的5’末端进行了磷酸化。

寡核苷酸7(SEQ ID NO：10)：

taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg

寡核苷酸8(SEQ ID NO：11)：

ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat

寡核苷酸7和8彼此互补，当它们杂交形成全长双链野生型loxP位点时，该位点在两端具有单链突出端，它允许DNA片段在pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点之间连接。在寡核苷酸7和8中的大写字母对应于全长loxP位点，而小写字母指示用于将双链DNA片段连接到pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点中的核苷酸。

连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B，将转化细胞置于包含20μg/mL四环素的LB培养基上。包含具有loxP位点的质粒的抗四环素转化子通过限制性消化分析、使用合适引物的菌落PCR、以及对相关区域的DNA序列分析来鉴定，其中野生型loxP位点正确***pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点。将经选择用于进一步操纵的质粒称为pLDHTc139#7-9WW，图9B显示了该构建体的环状示意图。

构建pLDHSp-9WW

pLDHSp-9WW与pLDHTc139#7-9WW相同，不同的是在后者中的抗四环素盒用赋予奇放线菌素抗性的DNA片段取代(即Spec^r-盒)。后者通过PCR生成，所述PCR使用质粒pHP15578(如Cahoon等人所述，2003)作模板，以及引物9和10进行PCR扩增。pHP15578包含Spec^r盒的全核苷酸序列，包括其启动子，它基于编码3’(9)-O-核苷酸转移酶的Tranposon Tn7 aadA基因(GenBank保藏号X03403)的公布序列。

引物9(SEQ ID NO：12)：

ATAAAAgcgggccgcAGCACAGGATGA

引物10(SEQ ID NO：13)：

GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG

引物9(正向引物)的用下划线标示的碱基与Spec^r盒的启动子上游杂交(GenBank保藏号X03043的nts 6-17)，而小写字母对应于加到引物5’末端的NotI位点。引物10(反向引物)的用下划线标示的碱基与Spec^r盒的终止密码子下游的约130种碱基杂交(GenBank保藏号X03043的nts 1006-1019)，而小写字母对应于加到引物5’末端的PacI位点。PCR生成的1040bp的Spec^r盒用NotI和PacI进行双重消化，所得DNA片段通过琼脂糖凝胶纯化。也用相同的两种限制性酶切割质粒pLDHTc139#7-9WW以移除Tc^r-盒，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得大载体片段。然后将PCR产物和载体片段连接到一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将转化子置于包含奇放线菌素(200μg/mL)的LB培养基上并在37℃下生长。包含具有正确尺寸***序列的质粒的抗奇放线菌素转化子通过用NotI和PacI限制性消化分析进行鉴定，并且将选择用于进一步操纵的质粒称为pLDHSp-9WW；图9C显示该构建体的环状示意图。

在另一个实施方案中，pLDHSp-9WW用于敲除在ZW1中的D-乳酸脱氢酶基因，该方法使用宿主介导的双交换同源重组并在奇放线菌素上生长进行选择。通过在***构建体中侧接Spec^r-盒的两个DNA片段将双交换事件定向于ldh基因。这些片段的其中一个(下文称作5’ldh侧接DNA)位于Spec^r-盒的上游，并且位于SbfI和AsiSI位点之间。这种～1100bp的DNA片段的核苷酸序列与编码pgm基因3’末端和ldh开放阅读框的约前半部分的ZW1染色体DNA相同。其它DNA片段(下文称作3’ldh侧接DNA)位于Spec^r-盒的反向末端，并且位于FseI和AscI位点之间。3’1dh侧接DNA(也长～1100bp)的核苷酸序列与编码ldh基因另外一半和adhI基因的5’非翻译区的染色体DNA相同。当5’和3’ldh侧接DNA片段与它们的染色体副本相互作用并发生同源重组时，双交换事件发生。这一现象基本上是不可逆的并且完全由宿主酶机器介导，它通过将侧接两种野生型loxP位点的Spec^r-盒***开放阅读框的中间来失活染色体ldh基因。因为***构建体不能在运动发酵单胞菌属中复制，用pLDHSp-9WW生成稳定的抗奇放线菌素菌落的仅有方法是通过同源重组的双交换事件(除了发生频率极低的自发抗药突变之外)。

构建pHimA

为了生成himA基因的敲除构建体，pLDHSp-9WW中的1dh侧接DNA用himA侧接DNA置换以将选择性标记和双交换事件定向到染色体himA基因。需要四个DNA片段进行如下文所述的操纵。

片段1来源于pLDHSp-9WW(图9C)，通过用四种不同的限制性酶切割质粒获得：NotI、BsaI、SbfI和AscI。NotI在nt 2647切割pLDHSp-9WW，BsaI在nt 1816切割质粒。在用四种限制性酶完全消化质粒DNA后，通过电泳，使用1％的琼脂糖凝胶和Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(目录号#D4001，Zymo Research)纯化2666bp的SbfI-AscI DNA片段。该片段称为片段1，它包含一个在运动发酵单胞菌属中无功能的大肠杆菌复制起点和一种赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的基因。

片段2也来源于pLDHSp-9WW。用FseI和AsiSI双重消化质粒，通过电泳，使用1％的琼脂糖凝胶和Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(目录号#D4001，Zymo Research)纯化所得1105bp的FseI-AsiSI DNA片段。该片段称为片段2，它包含侧接两个野生型loxP位点的Spec^r-盒，在片段的两端各有一个该位点。

片段3包含3’himA侧接DNA。通过PCR使用引物A和B生成～1.12Kbp的片段3。PCR扩增的模板是使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(目录号#A1125，Promega)分离自ZW658(ATCC#PTA-7858)的基因组DNA。

引物A(SEQ ID NO：14)：

CTACTCATcctgcaggTTTAATGAATGAGCGGATGCTG

引物B(SEQ ID NO：15)：

CATCTTACTgcgatcgcTGACTTTCCGTGCCAGCCAG

引物A(正向引物)的用下划线标示的碱基与运动发酵单胞菌属基因组(GenBank保藏号AE008692)的核苷酸1137154-1137175杂交，该核苷酸序列位于谷胱甘肽S-转移酶蛋白家族的推定成员的编码区中间(Seo等人，Nat.Biotechnol.23(1)，63-68(2005))，即himA基因的下游，而小写字母对应于加到引物5’末端的SbfI位点。引物B(反向引物)的用下划线标示的碱基在himA开放阅读框的3’末端与运动发酵单胞菌属基因组的核苷酸1138276-1138257杂交，而小写字母对应于加到引物5’末端的AsiSI位点。图10A显示引物A和B的染色体结合位点以及生成的PCR产物(片段3)。PCR产物用SbfI和AsiSI进行双重消化，然后如上所述将所得1123bp的DNA片段通过琼脂糖凝胶纯化。

片段4包含5’himA侧接DNA。通过PCR使用引物C和D生成～1.16Kb的片段4。PCR扩增的模板是使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(目录号#A1125，Promega)分离自ZW658(ATCC#PTA-7858)的基因组DNA。

引物C(SEQ ID NO：16)：

TCACTCATggccggccGGGATATCAGCTTGCATGCTC

引物D(SEQ ID NO：17)：

CATCTTACTggggcggcggccGATATGCTGCCTTCCGAAGTG

引物C(正向引物)的用下划线标示的碱基在himA开放阅读框的5’末端与运动发酵单胞菌属基因组的核苷酸1138510-1138530杂交，而小写字母对应于加到引物5’末端的FseI位点。引物D(反向引物)的用下划线标示的碱基在推测编码双组分响应调节子的基因的3’末端与himA基因的运动发酵单胞菌属基因组上游的核苷酸1139668-1139648杂交(Seo等人，Nat.Biotechnol.23(1)，63-68(2005))，而小写字母对应于加到引物5’末端的AscI位点。图10A显示引物C和D的染色体结合位点以及生成的PCR产物(片段4)。PCR产物用FseI和AscI进行双重消化，然后将所得1159bp的DNA片段通过1％的琼脂糖凝胶纯化。

图10B示出上述四个DNA片段然后经过4路连接反应装配成himA敲除构建体pHimA。该反应使用的片段1-4的摩尔比为大约1∶1∶1∶1。连接反应混合物的等分试样通过电穿孔进入大肠杆菌DH10B中，并且将转化的细胞置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)；平板在37℃下培养。包含具有正确尺寸***序列的氨苄青霉素和奇放线菌素的双抗转化子最初通过菌落PCR，使用两对不同引物进行鉴定：引物A/引物B，和引物C/引物D。随后用SbfI和AscI对质粒DNA进行限制性消化分析和来自PCR阳性克隆的pHimA质粒DNA的DNA序列分析来确认阳性克隆。

为了获取转化运动发酵单胞菌属所需的未经甲基化的质粒DNA，将pHimA导入大肠杆菌SCS110中(dcm-，dam-)，并且将转化的细胞置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)；在37℃下生长。用于该操纵的化学感受态细胞获取自Stratagene(目录号200247)，并且按照制造商的规程进行操作。重要的是注意到使用未经甲基化的质粒DNA转化来源于ZM4的运动发酵单胞菌属菌株是成功的关键，因此分离自大肠杆菌野生型菌株的甲基化质粒DNA(如DH10B)用于被宿主的抑制/修饰体系破坏。在最后的步骤中，质粒DNA分离自其中一个SCS110转化子，该分离方法使用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(目录号12162)，DNA终浓度是～2μg/mL。

实施例6

生成801-4himA敲除突变体

为了失活ZW801-4中的himA基因，基本如US 5,514,583所述使用电穿孔将未甲基化的pHimA质粒DNA(它不在运动发酵单胞菌属中复制)导入ZW801-4中。简而言之，50mL的转化反应包含在10％(v/v)甘油中的～10¹⁰种细胞/mL和～0.5μg的未甲基化质粒DNA，该DNA如实施例5所述从大肠杆菌SSC110中分离。对照反应进行相同处理，但是不接受任何质粒DNA。电穿孔仪的设置是1.6kv/cm，200Ω，25μF，试管间隙宽度为0.1cm。在电穿孔之后，转化反应用1.0mL的MMG培养基稀释(50g/L的葡萄糖，10g/L酵母的提取物，5g/L的蛋白胨，2.5g/L的(NH₄)₂SO₄，0.2g/L K₂HPO₄，和1mM MgSO₄)，并且允许细胞在30℃下恢复～3小时。然后在室温下，在无菌的1.5mL微量离心管中离心收获细胞(13,000×g，5分钟)，小心地移除上清液。将细胞沉淀物重悬于200μl的液体MMG培养基中，并且将细胞悬浮液的25-、50-和100mL等分试样置于MMG培养基上，该培养基包含1.5％的琼脂和200μg/mL的奇放线菌素。平板在30℃的厌氧室中培养，在48-72小时后在所有试验平板上有至少100种菌落。相反的是，对照反应仅仅产生一种菌落，它在接种100mL细胞悬浮液的平板上。选择来源于用pHimA敲除构建体转化的两种抗奇放线菌素菌落厌氧如下所述的进一步操纵。

在我们的实验室中以前用运动发酵单胞菌属和类似于pHimA的***构建体进行的实验已经揭示在染色体和质粒DNA之间的初始相互作用是单交换事件，该事件发生在两种侧接DNA序列的其中一种上，并且该单交换事件最终导致双交换事件。双交换事件的转变通常非常迅速，通常在液体或固体培养基的一系列转移后发生，所述培养基包含***构建体的选择性试剂，在这一事例中是奇放线菌素。为了有利于本发明的双交换事件并且排除单交换和双交换事件获得“混合种群”的可能性，将上述的两个初级转化子接种到MMG平板上，该平板包含200mg/mL的奇放线菌素。在厌氧条件下，在33℃培养30小时后，通过将细胞划线接种在包含相同生长培养基的新琼脂板上，从两片菌斑中分离单种菌落。在厌氧条件下，在33℃培养30小时后，将来自每个初始初级转化子的一种菌落接种到新MMG平板上，该平板包含奇放线菌素(200μg/mL)，并且这两种菌株如下所述进行进一步表征。

使用三对不同的引物，使用菌落PCR实验证实双交换事件不发生以及分离的每种菌株由同系种群细胞组成。第一对引物是GTTCTGCGCCTGTTATTCTG(SEQ ID NO：18)和CTACCTCTGATAGTTGAGTCG(SEQ ID NO：19)，如果在***构建体中的5’himA侧接DNA与其染色体副本发生单交换事件的话，该引物对仅能生成尺寸正确的PCR产物。同样地，第二对引物是GATATTCCAGTGCTGATCGAC(SEQ ID NO：20)和CTACGTGAAAGGCGAGATCAC(SEQ ID NO：21)，如果在***构建体中的3’himA侧接DNA与其染色体副本发生单交换事件的话，该引物对仅能生成尺寸正确的PCR产物。最后，第三对引物是GATCAGGTAGGTGTGCTCTA(SEQ ID NO：22)和GCATCAGAGAGCATACTGCT(SEQ ID NO：23)，如果在正确位点发生双交换事件的话，该引物对仅能生成尺寸正确的PCR产物。如果它们也以污染物形式存在的话，这对引物也能检测痕量未中断的himA基因拷贝和/或单交换事件。因为受检查的两种himA敲除突变体用三组不同引物产生期望的结果，并且结果是不能区分的，仅仅选择它们中的一组进行进一步表征。这一菌株下文称为“Z801-4::ΔhimA”。

实施例7

himA基因灭活单独导致AcR#3表型

图11示出了使用控制pH的生物反应器，在100％MH中进行的并列型ZW801-4和ZW801-4::ΔhimA的比较。种子培养物在30℃下在SM培养基中生长至OD₆₀₀为～4.4，并且用10％的种菌开启生物反应器。最终的150mL培养物包含100％MH加上110g/L葡萄糖和90g/L木糖。在150rpm下搅拌，分别将pH保持在5.8，将温度保持在33℃。在不同时间从生物反应器中取出等分试样用于发酵肉汤的HPLC分析，该分析使用的方法如实施例2所述。注意这些条件是与用于AcR#3和ZW801-4实验的确切相同的实验条件，如图8和表2所示(实施例4)。

图11给出的结果显示ZW801-4::ΔhimA(图11B)比ZW801-4(图11A)在100％MH中表现更好。经过48小时，它已经使用了生长培养基中的所有葡萄糖和木糖并生成～90g/L的乙醇。与之相反，亲本菌株ZW801-4未使用所有的糖，并且在实验末期的发酵肉汤中仍有～17g/L的残余木糖。ZW801-4的最终乙醇滴定量也显著较低(81g/L)。因此，在方法相关的条件下himA基因失活导致乙醇产量提高约10％，这实际上与使用相同实验条件的AcR#3获得的结果相同。虽然这些结果有力地证明AcR#3和ZW801-4::ΔhimA是等同的菌株，重要的是测试它们在并列型实验中的性能。100％MH也用于该比较，但是葡萄糖和木糖的初始浓度都提高了～10％，因为两种菌株都能使用在较早实验中的所有糖。

种子培养物在30℃下在SM培养基中生长至OD₆₀₀为～4.5，并且用10％的种菌开启生物反应器。最终的150mL培养物包含100％MH加上118g/L葡萄糖和98g/L木糖。在150rpm下搅拌，分别将pH保持在5.8，将温度保持在33℃。在不同时间从生物反应器中取出等分试样用于发酵肉汤的HPLC分析，该分析使用的方法如实施例2所述。表3示出了两种菌株的葡萄糖、木糖、乙酸盐、乙醇和生物质产量的最终值(OD₆₀₀)。

表3：在控制pH的发酵罐中的葡萄糖、木糖、乙醇、和乙酸盐的终点值，其中ZW801-4::ΔhimA和AcR#3菌株在具有高糖的100％模拟水解产物中生长。

菌株	小时数	OD₆₀₀	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇
菌株	小时数	OD₆₀₀	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇	ZW801-4::ΔhimA	0	0.48	118.2	98.4	10.0	3.9

菌株	小时数	OD₆₀₀	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇
菌株	小时数	OD₆₀₀	葡萄糖	木糖	乙酸盐	乙醇	ZW801-4::ΔhimA	70	6.3	0	14	10.5	90.7
AcR#3	0	0.48	118.0	98.2	10.0	4.0	ZW801-4::ΔhimA	70	6.3	0	14	10.5	90.7
AcR#3	0	0.48	118.0	98.2	10.0	4.0	AcR#3	70	6.2	0	14.1	10.4	90.6

这一实验的结果表明himA基因失活单独导致发酵性能改善，因为ZW801-4::ΔhimA和AcR#3在测试***中表现相同。当使用与图5所示实验相同的条件测试这两种菌株的乙酸盐抗性时，它们也是无法区别的(图12)。在AcR#3的himA基因中的整合Pgap启动子和菌株经受的延长的突变体富集过程明显地仅对所期望的himA表型具有较小效应或无效应。

序列表

<110>

<120>利用HIMA表达减少的重组发酵单胞菌属菌株从包含木糖的培养基生产乙醇的方法

<130>CL4041PCT

<160>26

<170>PatentIn 3.4版本

<210>1

<211>342

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌

<400>1

atgaataaac gctatgataa ccgcacaaac ggacagagca tgcaagctga tatcccaact 60

ttgacccgcg ccgatattac cgacatgctt taccatgaag taggtttgtc gcgggcagat 120

tccgccaaga tgatcgaaca aatgcttggt cacattacag atgccctgaa aaaaggtgaa 180

aatgtcaaaa tatctggttt tggcagcttt attctcaggg ataaaaatga acgtgttggc 240

cgtaatccta aaacagggat cgaggttcct atcgcaccaa ggcgggttct gactttccgt 300

gccagccagt tgatgcgcca gcggattatc aagggagcct aa 342

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtc 27

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ctacctctga tagttgagtc gatacttcgg 30

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ctactcattt cctgcaggtg gtaactcatt gcgcgctc 38

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CATCTTACTggcgcgccAAAAATCTGCGGCTGACATAC

<400>5

catcttactg gcgcgccaaa aatctgcggc tgacatac 38

<210>6

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

actcatttcc atggcgatcg cactatgcgg ccgcaatgta gcacctgaag tcagcc 56

<210>7

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

atctcactcc atggccggcc aactattaat taagaattga ttggctccaa ttcttg 56

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>8

cgcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgc 39

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>9

ggccgcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gcgat 45

<210>10

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>10

taaataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggc cgg 43

<210>11

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>11

ccataacttc gtatagcata cattatacga agttatttaa t 41

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ataaaagcgg ccgcagcaca ggatga 26

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ggcgttaatt aaggcaggtc agcaag 26

<210>14

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

ctactcatcc tgcaggttta atgaatgagc ggatgctg 38

<210>15

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

catcttactg cgatcgctga ctttccgtgc cagccag 37

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

tcactcatgg ccggccggga tatcagcttg catgctc 37

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

catcttactg gcgcgccgat atgctgcctt ccgaagtg 38

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

gttctgcgcc tgttattctg 20

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

ctacctctga tagttgagtc g 21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

gatattccag tgctgatcga c 21

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

ctacgtgaaa ggcgagatca c 21

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

gatcaggtag gtgtgctcta 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gcatcagaga gcatactgct 20

<210>24

<211>1302

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌

<400>24

atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac 60

aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg 120

gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc 180

caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa 240

gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta 300

ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa 360

aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc 420

aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac 480

tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540

aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600

aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgaaccg tgcagcggta 660

aaattgatcc gtgaaaacca gttgggtaaa ctgggcatgg ttaccaccga caactcagac 720

gttatggatc agaacgatcc tgcacagcag tggcgtctgc gtcgtgaact cgccggtggc 780

ggttctttga tggatatcgg tatttatggc ttgaacggta cccgttactt gctgggtgaa 840

gaaccgatcg aagtccgtgc ttacacctac agcgatccga atgatgaacg tttcgttgaa 900

gtcgaagatc gtattatttg gcagatgcgc ttcagaagcg gtgctctgtc tcatggtgca 960

tcttcttatt cgaccacgac gacttcacgt ttctcggtgc agggcgacaa agctgttctg 1020

ttgatggatc cggctaccgg atattatcag aatttgattt ctgtccagac cccaggccat 1080

gctaaccagt cgatgatgcc acagttcatc atgccagcga acaaccagtt ctctgcacag 1140

ttggatcatc tggctgaagc cgtcatcaat aacaaaccag ttcgtagccc gggtgaagaa 1200

ggtatgcagg atgtgcgcct gattcaggcc atttatgaag cagctcgtac cggtcgcccc 1260

gtcaacacgg attggggtta tgtccgtcag ggtggttatt ga 1302

<210>25

<211>1287

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有***序列和去除的GFOR编码区

<400>25

atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac 60

aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg 120

gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc 180

caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa 240

gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta 300

ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa 360

aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc 420

aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac 480

tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540

aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600

aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgcaccg tgcagcgatc 660

gcataacttc gtataatgta tgctatacga agttatggta ctcatggccg gcctcagaac 720

gatcctgcac agcagtggcg tctgcgtcgt gaactcgccg gtggcggttc tttgatggat 780

atcggtattt atggcttgaa cggtacccgt tacttgctgg gtgaagaacc gatcgaagtc 840

cgtgcttaca cctacagcga tccgaatgat gaacgtttcg ttgaagtcga agatcgtatt 900

atttggcaga tgcgcttcag aagcggtgct ctgtctcatg gtgcatcttc ttattcgacc 960

acgacgactt cacgtttctc ggtgcagggc gacaaagctg ttctgttgat ggatccggct 1020

accggatatt atcagaattt gatttctgtc cagaccccag gccatgctaa ccagtcgatg 1080

atgccacagt tcatcatgcc agcgaacaac cagttctctg cacagttgga tcatctggct 1140

gaagccgtca tcaataacaa accagttcgt agcccgggtg aagaaggtat gcaggatgtg 1200

cgcctgattc aggccattta tgaagcagct cgtaccggtc gccccgtcaa cacggattgg 1260

ggttatgtcc gtcagggtgg ttattga 1287

<210>26

<211>113

<212>PRT

<213>运动发酵单胞菌

<400>26

Met Asn Lys Arg Tyr Asp Asn Arg Thr Asn Gly Gln Ser Met Gln Ala

1 5 10 15

Asp Ile Pro Thr Leu Thr Arg Ala Asp Ile Thr Asp Met Leu Tyr His

20 25 30

Glu Val Gly Leu Ser Arg Ala Asp Ser Ala Lys Met Ile Glu Gln Met

35 40 45

Leu Gly His Ile Thr Asp Ala Leu Lys Lys Gly Glu Asn Val Lys Ile

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Ser Phe Ile Leu Arg Asp Lys Asn Glu Arg Val Gly

65 70 75 80

Arg Asn Pro Lys Thr Gly Ile Glu Val Pro Ile Ala Pro Arg Arg Val

85 90 95

Leu Thr Phe Arg Ala Ser Gln Leu Met Arg Gln Arg Ile Ile Lys Gly

100 105 110

Ala

Claims

1.从包含木糖的混合糖培养基生产乙醇的方法，所述方法包括：

(b)在包含木糖的混合糖培养基中培养所述(a)的菌株，由此所述菌株利用木糖作为碳源来生产乙醇。

2.根据权利要求1的方法，其中培养是在培养基中，在约25℃至约40℃的温度范围内进行的，pH范围介于约4.5和7.5之间。

3.根据权利要求2的方法，其中所述温度介于约30℃和37℃之间。

4.根据权利要求2的方法，其中所述pH介于约5.8和7.0之间。

5.根据权利要求1的方法，其中所述基因修饰是himA基因的修饰，所述修饰选自***、去除、突变、共抑制、和反义RNA表达。

6.根据权利要求5的方法，其中所述基因修饰使得所述himA基因不具备功能。

7.根据权利要求6的方法，其中所述基因修饰是通过同源重组导入所述himA基因中的***。

8.根据权利要求1的方法，其中所述重组发酵单胞菌属菌株是ZW801-4::ΔhimA或菌株AcR#3。

9.根据权利要求1的方法，其中所述培养基还包含乙酸盐，并且其中所述重组发酵单胞菌属菌株与其亲本发酵单胞菌属菌株相比生产的乙醇量提高，所述亲本发酵单胞菌属菌株不发生减少himA表达的基因修饰。

10.权利要求9的方法，其中所述乙醇产量提高是由于所述发酵单胞菌属菌株的乙酸盐抗性。

11.权利要求9的方法，其中所述培养基包含至少约120g/L的混合糖，所述混合糖包含木糖、糖醇、和至少约6g/L的乙酸盐，所述糖醇选自山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇、以及它们的混合物，其终浓度介于约2mM和约100mM之间。

12.权利要求11的方法，其中所述糖醇的浓度介于约5mM和约20mM之间。