CN101875944A - 副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法”，属于动物疫病防控领域，一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因***在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述***载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中***了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。本发明提供的***载体能够用于选择aroA基因突变的弱毒副猪嗜血杆菌菌株。

Description

副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法

技术领域

本发明涉及动物疫病防控领域，特别是涉及一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是巴氏杆菌科成员，革兰氏阴性小杆菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎；出现以发热、咳嗽和呼吸障碍等为特征的呼吸道疾病症候群。可以并发或继发于蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。Glasser(1910)首次报道了该菌与猪的纤维素性浆膜炎和多发性关节之间的联系，故该病也称Glasser’s病，Kilian1976证明了该菌生长时不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)，将该菌命名为副猪嗜血杆菌(Bouchet B，Vanier G，Jacques M，et al.Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells：Limitedrole of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release[J].Microbial Pathogenesis.2009，46(2)：108-113)。

芳香族氨基酸在细菌中只有一条通过分枝酸的合成途径，打断这一途径中的任何一个关键基因，如aroA，axoD，aroC等，都能阻断细菌芳香族氨基酸的合成，而芳香族氨基酸在哺乳动物细胞内不是一种代谢产物，含量甚微，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，因此这些基因发生突变的细菌在宿主体内只能有限生长繁殖从而导致减毒效应(刘英杰，芮贤良，徐永强，等.志贺氏菌芳香族氨基酸缺陷减毒株的构建[J].武警医学.1999(02)：68-70.)。

***质粒是指那些在某些特定的细菌中自主复制而在其它细菌中不能自主复制的质粒，它的复制需要一种特殊蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合到染色体上和染色体一起复制，利用***质粒的这一特点，将基因工程技术构建的基因突变DNA片段，克隆入***质粒，利用突变基因两端的同源片段与基因组发生同源交换重组构建精确的基因缺失株(***主编.分子医学细菌学[M].北京：科学出版社，2000：296)，基因缺失株可作为动物疫病防治的疫苗。

徐引弟等构建了重组***性质粒，获得了猪霍乱沙门氏菌突变株(徐引弟，郭爱珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp～-/gfp～+缺失株的构建及鉴定[J].农业生物技术学报.2008(02)：196-201.)。罗晓松等通过***质粒构建了嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株(罗晓松，尚书，侯化鹏，等.鱼源嗜水气单胞菌aopB～-/aoopD～-/aroA～-缺失株的构建及鉴定[J].农业生物技术学报.2009(01)：440-442.)。胡奕等利用***性载体和同源重组的原理构建了O45的ler基因缺失突变菌株PEPEC O45(Δler)，并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠和乳猪的被动免疫保护作用进行了研究，并证明所构建的O45(Δler)基因缺失突变弱毒菌株可作为预防PEPEC O45感染的疫苗候选株(胡奕，宋杰，赵宝华.肠致病性大肠杆菌O45基因缺失疫苗菌株的构建及其免疫原性分析[J].生物工程学报.2009(02)：181-188.)。

发明内容

本发明针对防治副猪嗜血杆菌所致动物疫病的需要，提供一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法，该载体可用于构建筛选的副猪嗜血杆菌的弱毒力突变菌株，以作为防治疫病的疫苗候选株。

一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因***在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述***载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中***了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。

所述骨架载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI，。

所述抗生素表达盒为具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。

所述副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>转座子为模板，PCR扩增得到如Seq ID No.1所示的核苷酸序列，酶切连接环化为骨架质粒pSD；

(2)以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，PCR扩增aroA基因，如SEQ ID NO4所示，并连接到质粒pGM-T上得到重组质粒pT-aroA；

(3)以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，

(4)使用cm的引物中酶切位点的限制性内切酶酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA，连接获得重组质粒pT-aroA-cm；

(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组***载体pSD-aroA-cm。

所述扩增骨架载体的引物含有Nolt位点，序列如下：

SD-F：5ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG3

SD-R：5TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC3。

所述扩增aroA基因的引物如下：

aroA-F：5TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG3，

aroA-R：5TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC3，

所述酶切pt-aroA-cm和pSD的限制性内切酶为BamHI、SalI。

所述扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有HindIII酶切位点，序列如下：

ChlF：5TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC3，

ChlR：5AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA3；所述酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA的限制性内切酶为HindIII。

筛选aroA基因***突变的副猪嗜血杆菌突变菌株的方法，将所述副猪嗜血杆菌aroA基因***载体转化到副猪嗜血杆菌中进行共培养发生同源单交换，通过所述抗生素表达盒所对应的抗生素筛选阳性克隆获得突变菌株。

本发明提供一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，该载体的骨架载体包含一个条件复制起点、抗生素抗性标记位点和多克隆位点，本发明将突变的aroA基因***到骨架载体的多克隆位点后获得***载体。突变的aroA基因为在aroA基因的***一段抗生素表达盒，一方面作为筛选阳性突变菌株的抗性标记位点，另一方面可以作为aroA基因突变***序列，该抗生素表达盒中断了aroA基因的表达，从而打断了副猪嗜血杆菌自身芳香族氨基酸的合成，而哺乳动物不具备芳香族氨基酸的合成途径，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，因此在宿主体内只能有限生长繁殖，从而导致其对寄主细胞的毒力大大减弱；该***载体环化连接后得到***质粒，其中条件复制起点限制其只能在表达π蛋白的细菌中自主复制，而副猪嗜血杆菌不表达π蛋白，因此转入副猪嗜血杆菌后，超螺旋的***质粒便会被线性化，因***质粒上含有受体菌副猪嗜血杆菌的基因同源序列--突变的aroA基因中抗生素表达盒的两侧序列，线性化的***质粒便会杂交到受菌体的染色体上，随着副猪嗜血杆菌基因组的复制，***质粒与受体菌的aroA基因发生置换，即同源单交换，随着受体菌的***和染色体的复制，产生含有突变的aroA基因的副猪嗜血杆菌突变菌株，***质粒的aroA基因中***的抗生素表达盒为作为筛选阳性突变菌株的标记位点，因此可加入该抗生素选出副猪嗜血杆菌aroA基因突变株。

本发明进一步提供具体的骨架载体如Seq ID No.1所示，带有一个R6K条件复制起点R6K，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI。该骨架载体只能在表达π蛋白的细菌中增殖，副猪嗜血杆菌不表达π蛋白，因此限制该***载体在副猪嗜血杆菌中的自主复制。

本发明的***载体中，突变的aroA基因***序列为氯霉素表达盒，氯霉素是一种常用抗性筛选物，并与卡那霉素相区别，共同用于筛选本发明的所要获得的阳性重组***载体，其中氯霉素用于筛选本发明所要获得的阳性突变菌株。

所述氯霉素表达盒***在aroA基因的HindIII位点，该位点处于aroA基因的中上游位置，如Seq ID No.4的aroA基因起始密码子后第170bp位置，有利于及时阻断aroA基因表达。

本发明获得的***载体转入副猪嗜血杆菌中，由于不能自主复制，因此只能整合到副猪嗜血杆菌得基因组DNA中，因发生同源重组单交换而将副猪嗜血杆菌中的aroA基因置换成突变的aroA基因，通过抗生素筛选获得aroA基因突变株。将基因突变株接种到哺乳动物细胞后，由于宿主细胞不产生芳香族氨基酸，因此接种的突变株细菌的增殖受到严重减弱甚至不能复制繁殖，因此对宿主的毒力大大减弱，但能够使宿主对副猪嗜血杆菌产生抗体，因此这样的突变株可作为预防副猪嗜血杆菌感染所致疫病的疫苗候选株。

根据本发明的提供的***载体的结构，构建该***载体的方法是本领域常用的实验方法，其中主要涉及到限制性酶切、连接，及在扩增各段序列的引物中设置酶切位点，以便于下一步与载体或其他片段连接。

本发明进一步提供构建该***载体的方法。以EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>转座子为模板，PCR扩增得到2000bp的如Seq ID No.1所示的骨架载体片段，扩增引物5’端含有NotI位点，用NotI内切酶酶切后，连接得到环化的骨架质粒pSD，其中顺次包括条件复制起点R6K，卡那抗性选择标记和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI。以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，上下游扩增引物5’端分别设计有BamHI和SalI位点，以便于连接到骨架载体的多克隆位点上，PCR扩增含有aroA基因的片段，如SEQ ID NO4所示，克隆到质粒pGM-T上得到重组质粒pT-aroA；以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，如SEQ ID NO2所示，扩增cm的引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，本发明优选HindIII酶切位点，cm***到pT-aroA的aroA基因中HindIII酶切位点使aroA基因突变，并获得含突变的aroA基因的重组质粒pT-aroA-cm；以BamHI和SalI双酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组***载体pSD-aroA-cm，如SEQ ID NO.3所示。

综上所述，本发明构建的***载体，可转化到副猪嗜血杆菌中，用于筛选基因突变株，基因突变株不能自身合成芳香族氨基酸，也不能从宿主细胞获得足够的芳香族氨基酸，只能有限繁殖，因此对宿主毒力非常弱，但能像野生菌株一样对宿主的免疫***能产生诱导，可作为预防副猪嗜血杆菌所致疫病的疫苗候选株。

附图说明：

图1.***载体质粒pSD的构建及鉴定

1.载体骨架PCR扩增(2000bp)；2.Marker DL15000；3-5.BamHI\SalI\NotI单酶切鉴定pSD载体

图2.aroA基因的扩增

1.Marker DL15000，2-3.aroA基因PCR产物2304bp

图3.图3氯霉素基因的扩增

1.Marker DL2000；2-3.氯霉素基因PCR产物，906bp

图4.pT-aroA的鉴定

1.Marker DL15000；2.载体骨架PCR扩增2001bp；3.pT-aroA的EcoRI酶切鉴定，三条带(3.0kb+1.4kb+0.9kb)；4.pT-aroA的NotI酶切鉴定，两条带(3.0kb+2.3kb)；5.pT-aroA的HindIII酶切鉴定，一条带(5.3kb)

图5.重组质粒pT-aroA-cm的酶切鉴定

1.Marker DL15000bp；2.pT-aroA-cm的BamHI+SalI双酶切鉴定，两条带(3.0kb+3.2kb)；3.pT-aroA-cm的EcoRI鉴定，四条带(3.0kb+1.7kb+0.9kb+0.6kb)；4.pT-aroA-cm的HindIII单酶切鉴定，两条带(5.3kb+0.9kb)；5.pT-aroA-cm的NotI酶切鉴定，两条带(3.0kb+3.2kb)图6.重组***质粒pSD-aroA-cm的构建及鉴定

1.Marker DL15000bp；2.pSD-aroA-cm的BamHI单酶切鉴定，一条带(5.2kb)；3.pSD-aroA-cm的BamHI+SalI双酶切鉴定，两条带(2.0kb+3.2kb)

图7重组***质粒pSD-aroA-cm的分子构成示意图

具体实施方式

1材料与方法

1.1.菌株和质粒

副猪嗜血杆菌5型标准菌株HS80，本实验室有保存，可向公众发放(实现本发明的目的，也可以用任何别的副猪嗜血杆菌菌株)

质粒pGM-T和大肠杆菌TOP10购自天根生物技术有限公司；

EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>转座子和表达π蛋白的感受态大肠杆菌EC100D pir-116购于EPICENTRE公司；

pACYC184质粒，本实验室有保存可向公众发放，也可购买到。

1.2主要试剂PCR预混体系2×PCR superMix、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，细菌基因组提取试剂盒购自QIAGEN公司，引物(表1)合成及测序由Invitrogen公司完成。核酸限制性内切酶BamH I、SalI和Hind III均为TaKaRa(大连)公司产品。

1.3PCR引物设计本发明使用引物(表1)由Invitrogen公司合成。

表1本研究中所用引物

Table 1primers used in this paper

注：下划线为酶切位点序列

实施例1.骨架载体pSD的构建

以EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>为模板，扩增长度2000bp载体骨架，带有一个R6K条件复制起点R6K，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI，用于扩增的上下游引物SD-F/SD-R的5’端设计NotI限制性内切酶位点(见表1)，PCR体系及条件：PCR预混体系2×PCR superMix 25μL，H₂O 22μL，上下游引物SD-F/SD-R各1μL，模板1μL。95℃变性5min；94℃30s，56℃45s，72℃30s，30个循环；72℃10min。PCR验证扩增片段大小约2000bp，大小与预期相符，如图1第2泳道，测序结果正确；PCR产物通过引物上的NotI位点进行酶切、连接环化得到质粒pSD，酶切鉴定质粒pSD，结果如图1；pSD转化感受态大肠杆菌EC100D pir-116。

实施例2.突变的aroA基因的制备

步骤1.使用细菌基因组提取试剂盒提取Hps基因组为模板，使用表1中的引物aroA-F/aroA-R扩增aroA基因，引物5’端分别设入了BamHI、SalI位点，PCR扩增片段序列如Seq ID NO.4所示，包括整个aroA基因(1314bp)及其上游约952bp片段和下游部分片段，与引物设计所预期的大小相符约2300bp(见图2)，扩增片段与质粒pGM-T连接，得到重组质粒pT-aroA，并转化到感受态大肠杆菌Top10中，增菌后提取质粒pT-aroA，pT-aroA的EcoRI酶切鉴定，得到三条带3.0kb、1.4kb、0.9kb；NotI酶切鉴定得到两条带3.0kb+2.3kb；HindIII酶切鉴定，一条带(5.3kb)酶切结果与预期相符，如图4所示。

步骤2.以pACYC184质粒为模板，使用表1中的引物ChlF/ChlR扩增氯霉素表达盒片段cm，氯霉素基因片段长约906bp，扩增大小与预期相符(见图3)。

步骤3.如Seq ID NO.4所示，在Seq ID NO.4所示核苷酸序列的第1124bp位点即在aroA基因起始密码子后第173bp位点处有一个HindIII位点，可以用来制备aroA***突变载体。cm和质粒pT-aroA经HindIII酶切消化，连接后筛选阳性重组质粒pT-aroA-cm，酶切鉴定pT-aroA-cm，见图5，鉴定结果与预期相符合。

实施例3.含突变aroA基因的***质粒的构建

pT-aroA-cm重组质粒和pSD都经过限制性内切酶BamHI与SalI的消化后，回收aroA-cm片段，核苷酸序列如Seq ID NO.5所示，经连接反应***到骨架载体pSD上，构建成pSD-aroA-cm重组***载体，结构如图7所示，转化感受态大肠杆菌EC100D pir-116，用氯霉素和卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒pSD-aroA-cm，用PCR、酶切进行鉴定，如图6所示BamHI单酶切鉴定，一条带(约5.2kb)；3.pSD-aroA-cm的BamHI+SalI双酶切鉴定，两条带(约2.0kb+3.2kb)，证明构建获得***载体。

SEQUENCE LISTING

<110>北京市农林科学院

<120>副猪嗜血杆菌aroA基因***载体及构建方法

<130>P09528/NLK

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2000

<212>DNA

<213>骨架载体

<400>1

ggtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat    60

aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga    120

aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa    180

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cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga    300

tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt    360

tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggaa aaacagcatt    420

ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt    480

cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt    540

tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga    600

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<210>2

<211>906

<212>DNA

<213>氯霉素表达盒

<400>2

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<210>3

<211>5189

<212>DNA

<213>***载体pSD-aroA-cm的序列

<400>3

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cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca    780

ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct    840

ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct    900

cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct    960

gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag    1020

atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc    1080

aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggcg gggatcccgt tactttcaca    1140

accgcctcgc tcactcaaaa atggcttgcg tgtcacagaa caaggggaaa tgatccgcty    1200

taaactgggt ttacctgccg ttgctgtatc aagtctagac ttatacgcta gtgcgatttt    1260

agaagccaac ctttgcccgc cgccagaacc taaacaagaa tggcgagatg taatgaataa    1320

aggctcggaa atttcttgtg acatttatcg tggcattgtg cgtggcgaac ctgactttgt    1380

gccgtatttc cgtgcagcaa cgcctgaaca agagctttca aaattaccac taggctcacg    1440

ccctgcaaaa cgtaatccaa atggtggcgt agaaagtttg cgtgcaattc cgtggatctt    1500

tgcgtggatg caaaaccgct tgatgttgcc tgcgtggttg ggagctggtc aagccttaca    1560

acagttgatc gaacaaggta atgaagcact attaaaagaa atgtgtaccg aatggccgct    1620

cttctcaacc cgtatcggaa tgttagagat ggtctttagt aaagcggatt tatggcttgc    1680

agaacattac gatcagcgcc ttgtaccaca acatttacac cgtttaggaa ataccttacg    1740

caatcagctt gcagcggaca tcaacagcgt tctctctctt gctcacgaag ggcaattaat    1800

ggcggattta ccttgggtag cagaatctat tgctctgcgt aacgtttaca ccgatccact    1860

taacttactt caagttgagc tgcttcaccg cttacgtgct gagggagaaa atccaaatcc    1920

agccttagag caagcgttga tgattactat cacaggtatt gcggcaggta tgcgtaatac    1980

ggggtagggg agtatattct ggattacaac ctcttaatga attctaagag gttgtttttt    2040

tagatattat aaaaactatt taattattag gatttcatta tggaaaaatt aacactaaat    2100

cctatcgctc gtgttgaggg cgaaattaat ttaccgggtt caaaaagcct ttcaaaccgt    2160

gcgttgttgt tagcagcctt ggcacagggg acaacgcaag taacgaattt attggatagc    2220

gatgatattc gccatatgct caatgccttg aaagcttaaa tacctgtgac ggaagatcac    2280

ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg ggaagccctg ggccaacttt    2340

tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca actttcacca taatgaaata    2400

agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa    2460

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa    2520

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat    2580

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt    2640

cacattcttg cccgcctgatgaatgctcat  ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt    2700

gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa    2760

acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat    2820

tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag    2880

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg    2940

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc    3000

gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat    3060

gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa    3120

tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa aaagctttgg gggtgaatta tcagctttct    3180

gataataaaa ccgtttgtac cgttgagggc gtgggcggtg cgtttcagtg gcaaaatggt    3240

ttgtcgctgt ttttaggtaa tgccggcacc gcaatgcgtc ctttaacagc ggcactttgt    3300

ttgaaaggtg agcaagaggc tgaggtgatt ttaacgggcg agccgcgtat gaaagagcgt    3360

ccgattaaac atttggttga tgcgttattg caagcggggg cttccgtgca atatcttgaa    3420

aatgaaggct atccgccgat tgctattcgt aatttgggta ttcaaggcgg caaaattcag    3480

attgatggtt cgatttcttc gcaatttttg accgcacttt tgatgtccgc accccttgcc    3540

tctggcgata tggaaattga gattgtcggt gagttggtct ccaagcctta tattgatatt    3600

acccttgcga tgatgaagga ttttggcgtg acagtgtcgc ataataatta ccaaactttc    3660

tttgttaaag gtaatcagca ttatgtttct ccgcaaaaat atttggttga gggcgatgcg    3720

tcctctgcct cttatttctt agccgcaggg gcaattaagg ggaaagtgaa agtgacgggg    3780

attggtaaaa attccattca aggcgaccgc ttgtttgctg atgtgcttga gaaaatgggc    3840

gccaaaatca cttggggcga agattttatc caagcagagc agggggagct taaaggtatt    3900

gatatggata tgaaccatat tcctgatgcg gcaatgacga ttgcaactac cgctcttttt    3960

gctgagggtg aaaccgttat tcgtaatatt tataactggc gtgtgaagga aacagatcgc    4020

ttgacagcaa tggcaacaga gttgcgtaaa gttggggcgg aagtggagga aggcgaagat    4080

tttatccgta ttcaaccgct tgcgttagat aagttccagc acgctgagat cgaaacctac    4140

aacgatcacc gtatggcgat gtgtttccct ttggtggcgt tgtcaaatac gtcggtgacg    4200

attttagatc cgaaatgtac ggcaaaaact ttcccgacgt attttgatga atttggtaag    4260

atgtattgta attttagtag ggaagaaaaa taatcttatt gggattgagg ctattttaaa    4320

cagtcgacct gcaggcatgc aagcttcagg gttgagatgt gtataagaga cagggttgag    4380

atgtataaga gacagcggcc gcgatgaatt gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac    4440

agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggatgcc atttcattac ctctttctcc    4500

gcacccgaca tagatccgaa gatcagcagt tcaacctgtt gatagtacgt actaagctct    4560

catgtttcac gtactaagct ctcatgttta acgtactaag ctctcatgtt taacgaacta    4620

aaccctcatg gctaacgtac taagctctca tggctaacgt actaagctct catgtttcac    4680

gtactaagct ctcatgtttg aacaataaaa ttaatataaa tcagcaactt aaatagcctc    4740

taaggtttta agttttataa gaaaaaaaag aatatataag gcttttaaag cttttaaggt    4800

ttaacggttg tggacaacaa gccagggatc tgccatttca ttacctcttt ctccgcaccc    4860

gacatagatc cggaacataa tggtgcaggg cgctgacttc cgcgtttcca gactttacga    4920

aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc gcagacgttt tgcagcagca    4980

gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc taaccagtaa ggcaaccccg    5040

ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg cgcacccgtg gccaggaccc    5100

aacgctgccc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg gcggacgcga tggatatgtt    5160

ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacag                                      5189

<400>4

<211>2295

<212>DNA

<213>含有aroA基因的核苷酸序列

<400>4

cgttactttc acaaccgcct cgctcactca aaaatggctt gcgtgtcaca gaacaagggg    60

aaatgatccg ctttaaactg ggtttacctg ccgttgctgt atcaagtcta gacttatacg    120

ctagtgcgat tttagaagcc aacctttgcc cgccgccaga acctaaacaa gaatggcgag    180

atgtaatgaa taaaggctcg gaaatttctt gtgacattta tcgtggcatt gtgcgtggcg    240

aacctgactt tgtgccgtat ttccgtgcag caacgcctga acaagagctt tcaaaattac    300

cactaggctc acgccctgca aaacgtaatc caaatggtgg cgtagaaagt ttgcgtgcaa    360

ttccgtggat ctttgcgtgg atgcaaaacc gcttgatgtt gcctgcgtgg ttgggagctg    420

gtcaagcctt acaacagttg atcgaacaag gtaatgaagc actattaaaa gaaatgtgta    480

ccgaatggcc gctcttctca acccgtatcg gaatgttaga gatggtcttt agtaaagcgg    540

atttatggct tgcagaacat tacgatcagc gccttgtacc acaacattta caccgtttag    600

gaaatacctt acgcaatcag cttgcagcgg acatcaacag cgttctctct cttgctcacg    660

aagggcaatt aatggcggat ttaccttggg tagcagaatc tattgctctg cgtaacgttt    720

acaccgatcc acttaactta cttcaagttg agctgcttca ccgcttacgt gctgagggag    780

aaaatccaaa tccagcctta gagcaagcgt tgatgattac tatcacaggt attgcggcag    840

gtatgcgtaa tacggggtag gggagtatat tctggattac aacctcttaa tgaattctaa    900

gaggttgttt ttttagatat tataaaaact atttaattat taggatttca ttatggaaaa    960

attaacacta aatcctatcg ctcgtgttga gggcgaaatt aatttaccgg gttcaaaaag    1020

cctttcaaac cgtgcgttgt tgttagcagc cttggcacag gggacaacgc aagtaacgaa    1080

tttattggat agcgatgata ttcgccatat gctcaatgcc ttgaaagctt tgggggtgaa    1140

ttatcagctt tctgataata aaaccgtttg taccgttgag ggcgtgggcg gtgcgtttca    1200

gtggcaaaat ggtttgtcgc tgtttttagg taatgccggc accgcaatgc gtcctttaac    1260

agcggcactt tgtttgaaag gtgagcaaga ggctgaggtg attttaacgg gcgagccgcg    1320

tatgaaagag cgtccgatta aacatttggt tgatgcgtta ttgcaagcgg gggcttccgt    1380

gcaatatctt gaaaatgaag gctatccgcc gattgctatt cgtaatttgg gtattcaagg    1440

cggcaaaatt cagattgatg gttcgatttc ttcgcaattt ttgaccgcac ttttgatgtc    1500

cgcacccctt gcctctggcg atatggaaat tgagattgtc ggtgagttgg tctccaagcc    1560

ttatattgat attacccttg cgatgatgaa ggattttggc gtgacagtgt cgcataataa    1620

ttaccaaact ttctttgtta aaggtaatca gcattatgtt tctccgcaaa aatatttggt    1680

tgagggcgat gcgtcctctg cctcttattt cttagccgca ggggcaatta aggggaaagt    1740

gaaagtgacg gggattggta aaaattccat tcaaggcgac cgcttgtttg ctgatgtgct    1800

tgagaaaatg ggcgccaaaa tcacttgggg cgaagatttt atccaagcag agcaggggga    1860

gcttaaaggt attgatatgg atatgaacca tattcctgat gcggcaatga cgattgcaac    1920

taccgctctt tttgctgagg gtgaaaccgt tattcgtaat atttataact ggcgtgtgaa    1980

ggaaacagat cgcttgacag caatggcaac agagttgcgt aaagttgggg cggaagtgga    2040

ggaaggcgaa gattttatcc gtattcaacc gcttgcgtta gataagttcc agcacgctga    2100

gatcgaaacc tacaacgatc accgtatggc gatgtgtttc cctttggtgg cgttgtcaaa    2160

tacgtcggtg acgattttag atccgaaatg tacggcaaaa actttcccga cgtattttga    2220

tgaatttggt aagatgtatt gtaattttag tagggaagaa aaataatctt attgggattg    2280

aggctatttt aaaca                                                     2295

<210>5

<211>3195

<212>DNA

<213>重组质粒pT-aroA-cm的序列

<400>5

cgttactttc acaaccgcct cgctcactca aaaatggctt gcgtgtcaca gaacaagggg    60

aaatgatccg ctttaaactg ggtttacctg ccgttgctgt atcaagtcta gacttatacg    120

ctagtgcgat tttagaagcc aacctttgcc cgccgccaga acctaaacaa gaatggcgag    180

atgtaatgaa taaaggctcg gaaatttctt gtgacattta tcgtggcatt gtgcgtggcg    240

aacctgactt tgtgccgtat ttccgtgcag caacgcctga acaagagctt tcaaaattac    300

cactaggctc acgccctgca aaacgtaatc caaatggtgg cgtagaaagt ttgcgtgcaa    360

ttccgtggat ctttgcgtgg atgcaaaacc gcttgatgtt gcctgcgtgg ttgggagctg    420

gtcaagcctt acaacagttg atcgaacaag gtaatgaagc actattaaaa gaaatgtgta    480

ccgaatggcc gctcttctca acccgtatcg gaatgttaga gatggtcttt agtaaagcgg    540

atttatggct tgcagaacat tacgatcagc gccttgtacc acaacattta caccgtttag    600

gaaatacctt acgcaatcag cttgcagcgg acatcaacag cgttctctct cttgctcacg    660

aagggcaatt aatggcggat ttaccttggg tagcagaatc tattgctctg cgtaacgttt    720

acaccgatcc acttaactta cttcaagttg agctgcttca ccgcttacgt gctgagggag    780

aaaatccaaa tccagcctta gagcaagcgt tgatgattac tatcacaggt attgcggcag    840

gtatgcgtaa tacggggtag gggagtatat tctggattac aacctcttaa tgaattctaa    900

gaggttgttt ttttagatat tataaaaact atttaattat taggatttca ttatggaaaa    960

attaacacta aatcctatcg ctcgtgttga gggcgaaatt aatttaccgg gttcaaaaag    1020

cctttcaaac cgtgcgttgt tgttagcagc cttggcacag gggacaacgc aagtaacgaa    1080

tttattggat agcgatgata ttcgccatat gctcaatgcc ttgaaagctt aaatacctgt    1140

gacggaagat cacttcgcag aataaataaa tcctggtgtc cctgttgata ccgggaagcc    1200

ctgggccaac ttttggcgaa aatgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca    1260

ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc    1320

taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg    1380

gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac    1440

cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta    1500

tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc    1560

aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca    1620

tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt    1680

tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa    1740

agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt    1800

tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata    1860

ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtctg    1920

tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca    1980

gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaaaagctt tgggggtgaa    2040

ttatcagctt tctgataata aaaccgtttg taccgttgag ggcgtgggcg gtgcgtttca    2100

gtggcaaaat ggtttgtcgc tgtttttagg taatgccggc accgcaatgc gtcctttaac    2160

agcggcactt tgtttgaaag gtgagcaaga ggctgaggtg attttaacgg gcgagccgcg    2220

tatgaaagag cgtccgatta aacatttggt tgatgcgtta ttgcaagcgg gggcttccgt    2280

gcaatatctt gaaaatgaag gctatccgcc gattgctatt cgtaatttgg gtattcaagg    2340

cggcaaaatt cagattgatg gttcgatttc ttcgcaattt ttgaccgcac ttttgatgtc    2400

cgcacccctt gcctctggcg atatggaaat tgagattgtc ggtgagttgg tctccaagcc    2460

ttatattgat attacccttg cgatgatgaa ggattttggc gtgacagtgt cgcataataa    2520

ttaccaaact ttctttgtta aaggtaatca gcattatgtt tctccgcaaa aatatttggt    2580

tgagggcgat gcgtcctctg cctcttattt cttagccgca ggggcaatta aggggaaagt    2640

gaaagtgacg gggattggta aaaattccat tcaaggcgac cgcttgtttg ctgatgtgct    2700

tgagaaaatg ggcgccaaaa tcacttgggg cgaagatttt atccaagcag agcaggggga    2760

gcttaaaggt attgatatgg atatgaacca tattcctgat gcggcaatga cgattgcaac    2820

taccgctctt tttgctgagg gtgaaaccgt tattcgtaat atttataact ggcgtgtgaa    2880

ggaaacagat cgcttgacag caatggcaac agagttgcgt aaagttgggg cggaagtgga    2940

ggaaggcgaa gattttatcc gtattcaacc gcttgcgtta gataagttcc agcacgctga    3000

gatcgaaacc tacaacgatc accgtatggc gatgtgtttc cctttggtgg cgttgtcaaa    3060

tacgtcggtg acgattttag atccgaaatg tacggcaaaa actttcccga cgtattttga    3120

tgaatttggt aagatgtatt gtaattttag tagggaagaa aaataatctt attgggattg    3180

aggctatttt aaaca                                                     3195

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>扩增骨架载体的引物SD-F

<400>6

atagcggccg cgatgaattg cttcgttaat acag                                34

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>扩增骨架载体的引物sd-r

<400>7

tagcggccgc tgtctcttat acacatctca accc                                34

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>aroA基因的引物aroa-f

<400>8

tatggatccc gttactttca caaccgcctc g                                   31

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>aroa基因的引物

<400>9

tatgtcgact gtttaaaata gcctcaatcc c                                   31

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>扩增氯霉素表达盒的引物ChlF：

<400>10

tgaagctttt taagggcacc aataac                                         26

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>扩增氯霉素表达盒的引物ChlR

<400>11

agaagcttaa atacctgtga cggaaga                                        27

Claims (9)

1.一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因***在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述***载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中***了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，所述骨架载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI。

3.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，所述抗生素表达盒为具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。

4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌aroA基因***载体，其核苷酸序列如SEQ IDNO3所示。

5.一种副猪嗜血杆菌aroA基因***载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>转座子为模板，PCR扩增得到如Seq ID No.1所示的核苷酸序列，连接环化为骨架质粒pSD；

(2)以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，PCR扩增aroA基因，如SEQ ID NO4所示，并连接到质粒pGM-T上得到重组质粒pT-aroA；

(3)以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，

(4)使用cm的引物中酶切位点的限制性内切酶酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA，连接获得重组质粒pT-aroA-cm；

(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组***载体pSD-aroA-cm。

6.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增骨架载体的引物含有NotI位点，序列如下：

SD-F：5-ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG-3

SD-R：5-TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC-3。

7.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增aroA基因的引物如下：

aroA-F：5-TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG-3，

aroA-R：5-TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC-3，

所述酶切pT-aroA-cm和pSD的限制性内切酶为BamHI、SalI。

8.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有HindIII酶切位点，序列如下：

ChlF：5-TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC-3，

ChlR：5-AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA-3；所述酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA的限制性内切酶为HindIII。

9.筛选aroA基因***突变的副猪嗜血杆菌突变菌株的方法，指将权利要求1～4任一所述的副猪嗜血杆菌aroA基因***载体转化到副猪嗜血杆菌中进行共培养发生同源单交换，通过所述抗生素表达盒所对应的抗生素筛选阳性克隆获得突变菌株。

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