CN101869184A - 一种微生物饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物饲料添加剂制备方法，是利用羽毛粉、甘露醇、葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠等原料，接种枯草芽孢杆菌(Bacullus subtilis)YYW-1，编号CGMCC NO.2396，通过液体深层发酵和旋转闪蒸干燥技术来制备微生物饲料添加剂。本产品的活性成分为枯草芽孢杆菌活菌及其培养物，培养物中含有高效降解羽毛的角蛋白酶等代谢产物。所得产品可在养殖业和饲料工业中使用，具有改善肠道菌群、提高动物消化吸收能力、提高饲料转化利用率，特别是促进了对羽毛粉等蛋白原料消化吸收利用，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物饲料添加剂及其制备方法，属于农业生物技术领域。
背景技术
微生物饲料添加剂是一种安全、绿色的新型饲料添加剂，具有促进生长、防病抗病、改善产品质量、有益于环境等作用，已作为生产安全畜产品重要的保障技术和抗生素添加剂替代产品应用于现代畜牧业。
我国目前已是畜产品生产和出口大国，但是近年来畜产品特别是肉类的出口屡屡受限，主要就是抗生素和药物残留、疫病防治体系不完善等原因。畜禽饲养中使用抗生素作生长促进剂和防治疾病已有半个多世纪的历史，近30年来，对长期应用抗生素引起动物内源性感染或二重感染、耐药菌株的产生，使畜禽细胞免疫、体液免疫功能下降以及抗生素在畜产品肉、蛋、奶中的残留，直接威胁着人类身体健康等副作用有了深刻的认识。各国政府给予高度重视，许多发达国家颁布法令，限制或禁止使用抗生素作为饲料添加剂。欧盟立法已从2006年1月1日禁止所有抗生素作为饲料添加剂使用。与此同时，对能克服抗生素种种弊端，无毒、无副作用、无残留的微生物添加剂日益受重视，一些发达国家已实现产业化。
我国对微生物饲料添加剂的研究和产业化开发相对较晚，20世纪80年代开始动物微生态学研究，90年代末微生物饲料添加剂进入产业化开发与应用，目前产品产量、质量、产业化水平等方面和国际先进水平相比还有较大差距。主要原因是由于缺乏高效菌株和相应的生产工艺制备方法。CN1682599(200410031196.7)公开了一种微生物饲料添加剂，具体地说是涉及一种由多种有益微生物和其代谢产物(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)组成的微生物饲料添加剂，该微生物饲料添加剂为将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸杆菌和酿酒酵母菌分别进行液体深层高密度发酵培养的发酵液或干粉的混合物。CN 101638627A(200910034843)公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用，所涉及的枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo3241)是从采自健康乳猪的胃肠道靠近粘膜处的内容物中筛选得到的；该饲料添加剂含有枯草芽孢杆菌(HF-A1)、乳酸菌和酿酒酵母。CN1934989(200610037429.3)公开了一种微生物饲料添加剂，是用木霉菌、曲霉菌、放线菌、芽孢杆菌、酿酒酵母菌Li 1012(Saccharomyces cerevisiae Li1012)为菌种经纯种扩大培养、液体发酵培养、固体二级发酵培养等制备步骤得到的含细菌数5.0～6.0×107cfu/g、酵母菌数4.0～5.0×104cfu/g、霉菌数2.0～3.0×104cfu/g的添加剂，添加剂的含水量≤10％；产品质量高，混入饲料后的稳定性好。以上专利文件有的利用芽孢杆菌产酶性能，如蛋白酶、脂肪酶等，或利用枯草芽孢杆菌与其它菌的复配生产饲料添加剂，发酵培养基原料及干燥方式均是常规生产中广泛应用的，不是针对特殊功能菌种(如分解羽毛角蛋白质功能)和特殊干燥方式(既保证高的活菌数量也能保持代谢产物活性)的制备方法。
羽毛已成为我国重要的饲料蛋白原料资源，我国每年的废弃羽毛资源已超过100万吨(我国每年饲料蛋白原料缺口超过1000万吨)，主要以羽毛粉添加于饲料中，由于其结构复杂极难降解，消化利用率低，提高羽毛粉原料的消化利用率是我国畜牧业亟需解决的难题之一。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种微生物饲料添加剂及其制备方法。
本发明的微生物饲料添加剂是利用羽毛粉、甘露醇、葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠等原料，接种微生物菌种枯草芽孢杆菌Bacullus subtilis YYW-1，菌种编号CGMCC NO.2396，(参见CN101240302A，200810014395.5)，通过液体深层发酵和旋转闪蒸干燥技术来制备微生物饲料添加剂产品。本产品的活性成分为上述枯草芽孢杆菌活菌及其培养物，培养物中含有高效降解羽毛的角蛋白酶等代谢产物。
本发明的微生物饲料添加剂制备方法，步骤如下：
(1)种子发酵液的制备
菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YYW-1，CGMCC NO.2396；在无菌条件下将斜面试管菌种接种于羽毛发酵种子培养基中，500mL三角瓶培养基装量为100～150mL，35～40℃震荡培养16～24小时，得摇瓶种子液；
种子罐培养：以2～5％的体积比的接种量，将摇瓶种子液接种于装有罐体积65～70％羽毛发酵种子培养基的种子发酵罐中，35～40℃进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为220～260r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶1.1～1.2，罐内压力0.1～0.02MPa，发酵12～16小时，得种子罐发酵液；
上述摇瓶和种子罐所用的培养基相同，所述的羽毛发酵种子培养基为：按重量份，羽毛粉0.1～5.0份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.005～0.2份、氯化钙0.001～0.2份、磷酸二氢钾0.01～0.2份、磷酸氢二钾0.02～0.5份、硫酸锰0.01～0.5份、酵母粉0.01～0.5份，溶于99～93份纯净水中，调节pH值至6～8，蒸汽灭菌后备用；
(2)发酵罐培养
以7～10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有罐体积60％～70％羽毛发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶1.1～1.2，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵32～48小时，发酵结束；
上述羽毛发酵培养基为：按重量份，将羽毛粉1～10份、甘露醇0.5～5份、葡萄糖0.5～5份、柠檬酸钠0.5～5份、氯化钠0.01～0.5份、硫酸镁0.01～0.5份、氯化钙0.01～0.5份和磷酸氢二钾0.01～1份溶于97.5～74.5份水中，调节pH至6～8，热处理方法灭菌。
(3)微生物饲料添加剂制备
向步骤(2)所得发酵液中加入玉米芯粉至含水量为70-80wt％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度110-125℃，排风温度65-75℃；得微生物饲料添加剂。
按现有技术对步骤(3)所得产品进行无菌分装。
本发明上述方法，所述的培养基中使用羽毛粉作为培养基氮源，羽毛粉包括各种废弃羽毛制成的粉状产品，可通过市场购得。
优选的，所述的羽毛粉是粉碎粒径平均为1mm脱脂鸡毛粉。
优选的，步骤(2)所述的培养基热处理灭菌是在116-121℃的温度下进行的，灭菌时间为30-60分钟。
优选的，步骤(2)所述的培养温度为38℃±1℃，通气量为1∶1.1。
优选的，步骤(3)所述的旋转闪蒸干燥机给风温度115℃，排风温度70℃。
优选的，步骤(3)所得干燥的产品含水量≤10wt％。
本发明所制得的微生物饲料添加剂的活菌数量为8.0×109CFU/克～1.5×1010CFU/克，属于高菌活产品。在应用时可通过添加过80目筛的玉米芯粉配制成活菌含量为1×109CFU/克～4×109CFU/克的制品使用。
本发明首次利用废弃资源羽毛为发酵原料，以产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌YYW-1(菌编号CGMCC No.2396)，通过液体深层发酵，利用旋转闪蒸干燥技术，制备活菌以及代谢产物角蛋白酶为主要成分的新型微生物饲料添加剂。所生产的产品可在养殖业和饲料工业中使用，具有改善肠道菌群、提高动物消化吸收能力、提高饲料转化利用率，特别是促进了对羽毛粉等蛋白原料消化吸收利用，降低成本、提高经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例中的通气量单位均为：发酵液体积m3/空气体积m3·分钟。实施例中使用的闪蒸干燥机是江苏一步干燥设备有限公司产品，型号为XSG-12。实施例中所说的含水量％、产品水分含量％均为质量百分比。实施例中的羽毛粉为山东六和集团平邑羽毛粉厂生产的脱脂型羽毛粉(鸡毛粉)，粉碎粒径平均为1mm。
实施例1：微生物饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
(1)种子发酵液的制备
菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YYW-1，CGMCC NO.2396；在无菌条件下将斜面试管菌种接种液体羽毛发酵种子培养基中，500mL三角瓶培养基装量为100～150mL，37℃震荡培养18小时，得摇瓶种子液；
以3％的体积比的接种量，将摇瓶种子液接种于装有1.3吨羽毛发酵培养基的2吨发酵罐中，培养温度37℃，进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为220r/加in，通气量1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵13小时，得种子罐发酵液；培养，搅拌转速为250r/min，通气量为1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵12小时得种子罐发酵液；
上述羽毛发酵种子培养基为：按重量份，羽毛粉1份、氯化钠0.1份、氯化镁0.1份、氯化钙0.06份、磷酸二氢钾0.02份、磷酸氢二钾0.02份、硫酸锰0.05份、酵母粉0.02份，逐一加于97份纯净水中溶解，调节pH值至7.2，蒸汽灭菌后备用；
(2)发酵罐培养
以10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有13吨羽毛发酵培养基的20吨发酵罐中，培养温度38℃，通气搅拌培养，其中搅拌转速为220r/min，通气量为1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，待菌体产芽孢率达90％时停止培养，发酵周期38小时；
上述羽毛发酵培养基及制备方法为：以重量份，羽毛粉3份、甘露醇1份、葡萄糖1份、柠檬酸钠2份、氯化钠0.3份、硫酸镁0.02份、氯化钙0.02份、磷酸氢二钾0.03份，逐一或混合溶于91份水中，调节pH至7.2，121℃灭菌50分钟备用。
(3)干燥与微生物饲料添加剂制备
待步骤(2)所述发酵结束后，将发酵液中加入过80目筛的玉米芯粉至含水量为75％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度115℃，排风温度70℃，使产品水分含量为10％，得微生物饲料添加剂，然后进行无菌分装；产品中枯草芽孢杆菌YYW-1活菌数量为1.05×1010CFU/克。
实施例2：微生物饲料添加剂的制备方法：种子发酵液的制备同实施例1。所不同的是：
(2)发酵罐培养：
以10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有13吨羽毛发酵培养基的20吨发酵罐中，培养温度38℃，通气搅拌培养，其中搅拌转速为220r/min，通气量为1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，待菌体产芽孢率达90％时停止培养，发酵周期33小时；
上述羽毛发酵培养基及制备方法为：以重量份，羽毛粉1份、甘露醇1份、葡萄糖1份、柠檬酸钠1份、氯化钠0.2份、硫酸镁0.01份、氯化钙0.01份、磷酸氢二钾0.02份，溶于95.8份水中，调节pH至7.2，116℃灭菌60分钟备用。
(3)干燥与微生物饲料添加剂制备
待步骤(2)所述发酵结束后，向发酵液中加入过80目筛的玉米芯粉至含水量为75wt％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度110℃，排风温度70℃；产品水分含量为11wt％，枯草芽孢杆菌YYW-1活菌数量为9.3×109CFU/克。
实施例3：微生物饲料添加剂的制备，种子发酵液的制备同实施例1。所不同的是：
(2)发酵罐培养：
以10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有13吨羽毛发酵培养基的20吨发酵罐中，培养温度38℃，通气搅拌培养，其中搅拌转速为220r/min，通气量为1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，待菌体产芽孢率达90％时停止培养，发酵周期44小时；
发酵罐用培养基及制备方法为：以重量份，羽毛粉5份、甘露醇2份、葡萄糖2份、柠檬酸钠3份、氯化钠0.3份、硫酸镁0.04份、氯化钙0.04份、磷酸氢二钾0.04份，逐一溶于(或混合于)87.7份水中，调节pH至7.2，116℃灭菌60分钟备用。
(3)待步骤(2)所述发酵结束后，将发酵液中加入过80目筛的玉米芯粉至含水量为80wt％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度115℃，排风温度70℃；产品水分含量为10wt％，枯草芽孢杆菌YYW-1活菌数量为1.2×1010CFU/克。
实施例4：微生物饲料添加剂的制备方法
(1)种子发酵液的制备
菌种选择与摇瓶种子培养方法同实施例1。所不同的是：
以3％的体积比的接种量，将摇瓶种子液接种于装有0.7吨羽毛发酵培养基的1吨发酵罐中，37℃进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为220r/min，通气量1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵10小时，得种子罐发酵液；
上述羽毛发酵种子培养基及制备方法同实施例1。
(2)发酵罐培养
以10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有3.2吨羽毛发酵培养基的5吨发酵罐中，培养温度38℃，通气搅拌培养，其中搅拌转速为250r/min，通气量为1∶1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，待菌体产芽孢率达90％时停止培养，发酵周期40小时；
上述羽毛发酵培养基及制备方法同实施例1。
(3)干燥与微生物饲料添加剂制备
待步骤(2)所述发酵结束后，将发酵液中加入过80目筛的玉米芯粉至含水量为75wt％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度115℃，排风温度70℃；产品水分含量为9wt％，枯草芽孢杆菌YYW-1活菌数量为9.5×109CFU/克。
实施例5：枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)经口急性毒性试验。
本试验由山东医科大学公共卫生学院毒理学研究室进行。
用实施例1步骤(1)培养的枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)的发酵罐放罐前的培养液饲喂昆明种小鼠60只，体重18-22g，雌雄各半。将小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，禁食12h后，经口灌胃，剂量分别为40mL/kg，32mL/kg，25.6mL/kg，20.5mL/kg，16.4mL/kg，13.1mL/kg(r＝0.8)。小鼠给药后连续观察14天，记录小鼠中毒症状和死亡数，根据各组小鼠死亡率，用Bliss法计算LD50和95％可信限。结果见表2。
表2枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)小鼠急性毒性试验结果
结果表明，经口给受试动物后小鼠无异常现象。小鼠一次经口给予乳酸菌口服液半数致死剂量LD50大于40mL/kg，按急性毒性分级标准属无毒物质。
实施例6：本发明微生物饲料添加剂养殖试验
用实施例3所制得的微生物饲料添加剂进行养殖试验。将实施例3的活菌数量为1.2×1010CFU/克的产品通过添加过80目筛的玉米芯粉配制成活菌含量为3×109CFU/克的枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)制品，使用剂量为每吨全价料添加1000克。试验在山东六和饲料集团肉鸡养殖场进行。玉米-豆粕型典型肉鸡日粮(组分中含有2％羽毛粉)，基础日粮配制标准参照中华人民共和国农业部2004年发布的鸡饲养标准(NY/T 33-2004)。试验日粮均为颗粒饲料，A组为正对照组；B组为负对照组：即在A组正对照日粮基础上降30kcal/kg代谢能；C组在B组(负对照组)日粮基础上添加1000g/T的枯草芽孢杆菌制剂。单因子随机试验设计，432只1日龄AA肉鸡，按照公母各半、体重一致的原则随机分为3个日粮处理组，每个处理设6个重复，每个重复12只鸡。试验期间记录每日耗料量，按照测定1～3周龄、4～5周龄及1～5周龄的各阶段平均个体日增重、个体日耗料量、料肉比。试验鸡只采用立体重叠式笼养，人工控制光照、温度和湿度，自由采食和饮水，自然通风，其他饲养管理和免疫按常规肉鸡饲养办法和免疫程序进行。
试验结果：
1.枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对1～21日龄肉鸡生产性能的影响
1～21日龄阶段的生产性能试验结果表明，添加枯草芽孢杆菌试验组21日龄平均个体重提高8.2％(P＜0.05)，试验组日增重提高7.4％(P＜0.05)；料肉比降低0.08(P＜0.05)，表1。
表1、枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对1～21日龄肉鸡生产性能的影响
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)；肩标无字母或字母相同者表示差异不显著(P＞0.05)，下同。
2.枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对22～35日龄肉鸡生产性能的影响
22～35日龄阶段生产性能试验结果表明，添加枯草芽孢杆菌试验组35日龄平均个体重提高11.0％(P＜0.05)，日增重提高10.1％(P＜0.05)；料肉比降低0.13(P＜0.05)，表2。
表2、枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对22～35日龄肉鸡生产性能的影响
3.枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对1～35日龄肉鸡生产性能的影响
1～35日龄试验全期的生产性能试验结果表明，添加枯草芽孢杆菌试验组的个体日增重提高12.2％(P＜0.05)；料肉比降低了0.10(P＜0.05)，表3。
表3、枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)对1～35日龄肉鸡生产性能的影响
结论：全生长期的生产性能结果表明，肉鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCCNO.2396)，试验组日增重比正、负对照组分别提高11.7％、12.2％(P＜0.05)，料肉比比正、负对照组分别降低0.10、0.13(P＜0.05)，均达到差异显著水平，表明添加枯草芽孢杆菌YYW-1(CGMCC NO.2396)可以提高肉鸡对日粮的利用效率和肉鸡生长性能。
Claims (4)
1.本发明的微生物饲料添加剂制备方法，步骤如下：
(1)种子发酵液的制备
菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YYW-1，CGMCC NO.2396；在无菌条件下将斜面试管菌种接种于羽毛发酵种子培养基中，500mL三角瓶培养基装量为100～150mL，35～40℃震荡培养16～24小时，得摇瓶种子液；
种子罐培养：以2～5％的体积比的接种量，将摇瓶种子液接种于装有罐体积65～70％羽毛发酵种子培养基的种子发酵罐中，35～40℃进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为220～260r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶1.1～1.2，罐内压力0.1～0.02MPa，发酵12～16小时，得种子罐发酵液；
上述摇瓶和种子罐用羽毛发酵种子培养基为：按重量份，羽毛粉0.1～5.0份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.005～0.2份、氯化钙0.001～0.2份、磷酸二氢钾0.01～0.2份、磷酸氢二钾0.02～0.5份、硫酸锰0.01～0.5份、酵母粉0.01～0.5份，溶于99～93份纯净水中，调节pH值至6～8，蒸汽灭菌后备用；
(2)发酵罐培养
以7～10％的体积比的接种量，将种子罐发酵液接种于装有罐体积60％～70％羽毛发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通气搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶1.1～1.2，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵32～48小时，发酵结束；
上述羽毛发酵培养基为：按重量份，将羽毛粉1～10份、甘露醇0.5～5份、葡萄糖0.5～5份、柠檬酸钠0.5～5份、氯化钠0.01～0.5份、硫酸镁0.01～0.5份、氯化钙0.01～0.5份和磷酸氢二钾0.01～1份溶于97.5～74.5份水中，调节pH至6～8，热处理方法灭菌；
(3)向步骤(2)所得发酵液中加入玉米芯粉至含水量为70-80wt％，利用旋转闪蒸干燥机干燥，干燥机给风温度110-125℃，排风温度65-75℃；得微生物饲料添加剂。
2.如权利要求1所述的微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的培养基热处理灭菌是在116-121℃的温度下进行的，灭菌时间为30-60分钟。
3.如权利要求1所述的微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的培养温度为38℃±1℃，通气量为1∶1.1。
4.如权利要求1所述的微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的旋转闪蒸干燥机给风温度115℃，排风温度70℃。
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