CN101864002A - 一种肝素钠的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种肝素钠的提取方法，包括如下步骤：(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。一种改进方案是前述方案步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂。本发明工艺简单，生产周期短，操作简便，投资少，适合规模工业生产，肝素纯度可达100-120IU/mg，提取效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠，提高20-30％，节省用盐30-50％，节省用水50-70％，节能30-40％，粗蛋白回收率可达60％。

Description

一种肝素钠的提取方法

技术领域

本发明涉及肝素钠的提取方法，尤其是一种对酶盐结合法的改进方法。

背景技术

肝素钠是一种由动物***的肥大细胞产生的酸性粘多糖的硫酸酯类物质，因其具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素钠不仅有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。虽肝素钠用于临床已有60余年的历史，但迄今还没有一种能够完全代替它的产品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物，且目前只能从动物的部分组织中提取，不能人工合成。我国是生猪养殖、屠宰和消费大国，更是肠衣加工大国。肠粘膜是提取肝素钠的最佳原料，国内有大量致力于从肠粘膜中提取肝素钠的厂家，大部分企业用盐析法或酶盐结合法提取肝素钠。酶盐结合法的主要程序是：先对肠粘膜物进行酶解、过滤，然后用树脂吸附、洗脱，再用酒精沉淀，纯化后烘干即成。肝素钠提取率多在一亿IU/2300-2500根小肠之间(最好水平在一亿IU/2000根小肠，仅个别企业可达到此水平)，所提肝素钠的纯度较低，常在70-90IU/mg，其中含有大量的蛋白质，色泽黑褐，给临床用药的制备增加难度。

有报道用超声波法辅助盐析法或酶法提取肝素钠，如宋大巍“肝素钠的高效提取和分离纯化技术研究，胰蛋白酶水解法提取肝素工艺参数的优化研究，黑龙江八一农垦大学学报，2008.3”，但其工艺繁琐，投入高、能耗大，未见工业应用报道。

采用酸碱法、化学氧化法或酸法-氧化法结合可将粗肝素钠纯化，但肝素钠在温热的稀酸中会失活，温度越高，pH值越低，失活越快。在碱性条件下，N-硫酸基相当稳定，但艾杜糖醛酸上的硫酸基可被水解，从而使其失去活性；肝素钠与氧化剂作用可被降解成酸性产物，故用氧化剂进行纯化时，会降低肝素钠的收率。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝素钠的提取方法，其产率高、效价高、能耗低、成本低。

本发明采用如下技术方案，其特征在于包括以下步骤：

(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。这种技术方案改进了传统酶解工艺，在酶解前先将底物加热，再采用新的配方酶制剂，利用多种酶的协同作用使肝素钠与蛋白复合物解离，解离效果好，在较缓和的条件下使细胞壁变性完成酶水解过程，更加有利于蛋白酶发挥作用。

一种进一步改进的技术方案是，改进前述方案的步骤1，即：在步骤1过滤水解混合物之前添加沉淀剂，所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。加入沉淀剂可将水解液中的蛋白质、肠渣等有效分离、回收，可减少树脂吸附工序树脂对它们的吸附，提高树脂吸附的有效性，提高肝素钠产物的纯度。

本发明具有以下优点：

1.工艺简单，生产周期短，操作简便，投资少，适合规模工业生产。

2.肝素钠纯度高，产率高，质量稳定。生产的肝素钠纯度可达100-120IU/mg，提取肝素钠的效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠，较现有技术提高20-30％。

3.水耗、能耗低，生产成本低。本发明方法比常规酶解工艺节省用盐量约30-50％，耗水量和废水排放量较常规减少50-70％，酶解结束后无需再次升温至80-90℃后又降温，可降低能耗30-40％。

4.原料综合利用率高，废水污染负荷低、易处理。粗蛋白回收率达60％，废液C0D减少75-85％，污染负荷显著降低。

具体实施方式

实施例1

一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：

(1)肠粘膜物的酶水解：在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物，升温至70℃，保温15min，加水180份，加NaCl 7份，控制温度45℃，用碱液调pH为7.5，加酶制剂(酶制剂配方为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.2的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是2709酶)0.04份，搅拌1.5h，加沉淀剂聚合氯化铝0.27份，搅拌10min，静置4h，将上层清液用120目滤布过滤，收集滤液；

(2)树脂吸附：在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液，加入ZGA 398树脂3份，搅拌4h，将树脂滤出，再加ZGA 398树脂3份，搅拌5h，将树脂滤出，将滤出的树脂合并用水清洗1-2次；

(3)树脂洗脱：将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.9倍树脂质量的3-4mol/L NaCl溶液中，搅拌2.5h，过滤、收集洗脱液；再添加质量为0.8倍树脂质量的2.5-3mol/LNaCl溶液，搅拌3h，过滤，收集洗脱液；然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次，收集洗液，用于下批树脂的洗脱；

(4)肝素钠的沉析：将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使洗脱液乙醇浓度达到45-50度，静置6h，将沉析肝素钠的上清液回收，收集肝素钠沉淀；

(5)肝素钠的纯化：将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1％NaCl溶液溶解，过滤或离心分离除去不溶物，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度，静置7h，过滤、收集肝素钠沉淀，用浓度为85-95％乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次，过滤，收集肝素钠沉淀；

(6)干燥：将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干，或在真空条件下干燥，得纯品肝素钠。

实施例2

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂配方与沉淀剂有变化，酶制剂配方比例改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以4∶3∶0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是AS1.398酶与胰酶按1∶1质量比的混合物；沉淀剂改为碱式氯化铝。

实施例3

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化，酶制剂配方改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以2∶2∶0.2的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是胰酶；沉淀剂改为硫酸铝。

实施例4

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化，酶制剂配方改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.1的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是AS1.398酶；沉淀剂改为碱式氯化铝与硫酸铝按2∶1质量比的混合物。

本发明可用其它不违背本发明精神或主要特征的具体形式来概述，在不脱离本发明上述主题范围的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种变更和替换，均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种肝素钠的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。

2.根据权利要求1所述的一种肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂，所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。

3.根据权利要求2所述的一种肝素钠的提取方法，其特征在于包括如下步骤：各步骤所用材料除特别说明外，均按质量份计：

(1)肠粘膜物的酶水解：在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物，升温至60-75℃，保温10-30min，加水100-200份，加NaCl6-8份，控制温度40-55℃，用碱液调pH为7.0-9.0，加酶制剂0.02-0.05份，搅拌1.5-2.5h，加沉淀剂0.2-0.3份，搅拌10-15min，静置3-5h，将上层清液用100-150目滤布过滤，收集滤液；

(2)树脂吸附：在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液，加入ZGA 398树脂3-5份，搅拌3-6h，将树脂滤出，再加ZGA 398树脂1-4份，搅拌3-7h，将树脂滤出，将滤出的树脂合并用水清洗1-2次；

(3)树脂洗脱：将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.8-1.2倍树脂质量的3-4mol/LNaCl溶液中，搅拌2-3h，过滤、收集洗脱液；再添加质量为0.7-0.9倍树脂质量的2.5-3mo1/L NaCl溶液，搅拌2-3h，过滤，收集洗脱液；然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次，收集洗液，用于下批树脂的洗脱；

(4)肝素钠的沉析：将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使洗脱液乙醇浓度达到45-50度，静置6-8h，将沉析肝素钠的上清液回收，收集肝素钠沉淀；

(5)肝素钠的纯化：将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1％NaCl溶液溶解，过滤或离心分离除去不溶物，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度，静置5-7h，过滤、收集肝素钠沉淀，用浓度为85-95％乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次，过滤，收集肝素钠沉淀；

(6)干燥：将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干，或在真空条件下干燥，得纯品肝素钠。