CN101864002A - 一种肝素钠的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种肝素钠的提取方法,包括如下步骤:(1)常规法肠粘膜物的酶水解,水解采用的酶制剂是:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料;(2)常规法树脂吸附;(3)常规法树脂洗脱;(4)常规法肝素钠沉析;(5)常规法肝素钠纯化;(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。一种改进方案是前述方案步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂。本发明工艺简单,生产周期短,操作简便,投资少,适合规模工业生产,肝素纯度可达100-120IU/mg,提取效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠,提高20-30%,节省用盐30-50%,节省用水50-70%,节能30-40%,粗蛋白回收率可达60%。
Description
技术领域
本发明涉及肝素钠的提取方法,尤其是一种对酶盐结合法的改进方法。
背景技术
肝素钠是一种由动物***的肥大细胞产生的酸性粘多糖的硫酸酯类物质,因其具有强抗凝作用,是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物,随着研究的深入,人们发现肝素钠不仅有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用,还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。虽肝素钠用于临床已有60余年的历史,但迄今还没有一种能够完全代替它的产品,所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物,且目前只能从动物的部分组织中提取,不能人工合成。我国是生猪养殖、屠宰和消费大国,更是肠衣加工大国。肠粘膜是提取肝素钠的最佳原料,国内有大量致力于从肠粘膜中提取肝素钠的厂家,大部分企业用盐析法或酶盐结合法提取肝素钠。酶盐结合法的主要程序是:先对肠粘膜物进行酶解、过滤,然后用树脂吸附、洗脱,再用酒精沉淀,纯化后烘干即成。肝素钠提取率多在一亿IU/2300-2500根小肠之间(最好水平在一亿IU/2000根小肠,仅个别企业可达到此水平),所提肝素钠的纯度较低,常在70-90IU/mg,其中含有大量的蛋白质,色泽黑褐,给临床用药的制备增加难度。
有报道用超声波法辅助盐析法或酶法提取肝素钠,如宋大巍“肝素钠的高效提取和分离纯化技术研究,胰蛋白酶水解法提取肝素工艺参数的优化研究,黑龙江八一农垦大学学报,2008.3”,但其工艺繁琐,投入高、能耗大,未见工业应用报道。
采用酸碱法、化学氧化法或酸法-氧化法结合可将粗肝素钠纯化,但肝素钠在温热的稀酸中会失活,温度越高,pH值越低,失活越快。在碱性条件下,N-硫酸基相当稳定,但艾杜糖醛酸上的硫酸基可被水解,从而使其失去活性;肝素钠与氧化剂作用可被降解成酸性产物,故用氧化剂进行纯化时,会降低肝素钠的收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝素钠的提取方法,其产率高、效价高、能耗低、成本低。
本发明采用如下技术方案,其特征在于包括以下步骤:
(1)常规法肠粘膜物的酶水解,水解采用的酶制剂是:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料;(2)常规法树脂吸附;(3)常规法树脂洗脱;(4)常规法肝素钠沉析;(5)常规法肝素钠纯化;(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。这种技术方案改进了传统酶解工艺,在酶解前先将底物加热,再采用新的配方酶制剂,利用多种酶的协同作用使肝素钠与蛋白复合物解离,解离效果好,在较缓和的条件下使细胞壁变性完成酶水解过程,更加有利于蛋白酶发挥作用。
一种进一步改进的技术方案是,改进前述方案的步骤1,即:在步骤1过滤水解混合物之前添加沉淀剂,所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。加入沉淀剂可将水解液中的蛋白质、肠渣等有效分离、回收,可减少树脂吸附工序树脂对它们的吸附,提高树脂吸附的有效性,提高肝素钠产物的纯度。
本发明具有以下优点:
1.工艺简单,生产周期短,操作简便,投资少,适合规模工业生产。
2.肝素钠纯度高,产率高,质量稳定。生产的肝素钠纯度可达100-120IU/mg,提取肝素钠的效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠,较现有技术提高20-30%。
3.水耗、能耗低,生产成本低。本发明方法比常规酶解工艺节省用盐量约30-50%,耗水量和废水排放量较常规减少50-70%,酶解结束后无需再次升温至80-90℃后又降温,可降低能耗30-40%。
4.原料综合利用率高,废水污染负荷低、易处理。粗蛋白回收率达60%,废液C0D减少75-85%,污染负荷显著降低。
具体实施方式
实施例1
一种肝素钠的提取方法,包括以下步骤:
(1)肠粘膜物的酶水解:在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物,升温至70℃,保温15min,加水180份,加NaCl 7份,控制温度45℃,用碱液调pH为7.5,加酶制剂(酶制剂配方为:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.2的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是2709酶)0.04份,搅拌1.5h,加沉淀剂聚合氯化铝0.27份,搅拌10min,静置4h,将上层清液用120目滤布过滤,收集滤液;
(2)树脂吸附:在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液,加入ZGA 398树脂3份,搅拌4h,将树脂滤出,再加ZGA 398树脂3份,搅拌5h,将树脂滤出,将滤出的树脂合并用水清洗1-2次;
(3)树脂洗脱:将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.9倍树脂质量的3-4mol/L NaCl溶液中,搅拌2.5h,过滤、收集洗脱液;再添加质量为0.8倍树脂质量的2.5-3mol/LNaCl溶液,搅拌3h,过滤,收集洗脱液;然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次,收集洗液,用于下批树脂的洗脱;
(4)肝素钠的沉析:将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并,加入浓度为85-95%乙醇搅拌,使洗脱液乙醇浓度达到45-50度,静置6h,将沉析肝素钠的上清液回收,收集肝素钠沉淀;
(5)肝素钠的纯化:将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1%NaCl溶液溶解,过滤或离心分离除去不溶物,加入浓度为85-95%乙醇搅拌,使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度,静置7h,过滤、收集肝素钠沉淀,用浓度为85-95%乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次,过滤,收集肝素钠沉淀;
(6)干燥:将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干,或在真空条件下干燥,得纯品肝素钠。
实施例2
本实施例的步骤同实施例1,只是酶制剂配方与沉淀剂有变化,酶制剂配方比例改为:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以4∶3∶0.3的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是AS1.398酶与胰酶按1∶1质量比的混合物;沉淀剂改为碱式氯化铝。
实施例3
本实施例的步骤同实施例1,只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化,酶制剂配方改为:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以2∶2∶0.2的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是胰酶;沉淀剂改为硫酸铝。
实施例4
本实施例的步骤同实施例1,只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化,酶制剂配方改为:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.1的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是AS1.398酶;沉淀剂改为碱式氯化铝与硫酸铝按2∶1质量比的混合物。
本发明可用其它不违背本发明精神或主要特征的具体形式来概述,在不脱离本发明上述主题范围的情况下,根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种变更和替换,均落入本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种肝素钠的提取方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)常规法肠粘膜物的酶水解,水解采用的酶制剂是:蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物,其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料;(2)常规法树脂吸附;(3)常规法树脂洗脱;(4)常规法肝素钠沉析;(5)常规法肝素钠纯化;(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。
2.根据权利要求1所述的一种肝素钠的提取方法,其特征在于:所述步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂,所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。
3.根据权利要求2所述的一种肝素钠的提取方法,其特征在于包括如下步骤:各步骤所用材料除特别说明外,均按质量份计:
(1)肠粘膜物的酶水解:在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物,升温至60-75℃,保温10-30min,加水100-200份,加NaCl6-8份,控制温度40-55℃,用碱液调pH为7.0-9.0,加酶制剂0.02-0.05份,搅拌1.5-2.5h,加沉淀剂0.2-0.3份,搅拌10-15min,静置3-5h,将上层清液用100-150目滤布过滤,收集滤液;
(2)树脂吸附:在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液,加入ZGA 398树脂3-5份,搅拌3-6h,将树脂滤出,再加ZGA 398树脂1-4份,搅拌3-7h,将树脂滤出,将滤出的树脂合并用水清洗1-2次;
(3)树脂洗脱:将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.8-1.2倍树脂质量的3-4mol/LNaCl溶液中,搅拌2-3h,过滤、收集洗脱液;再添加质量为0.7-0.9倍树脂质量的2.5-3mo1/L NaCl溶液,搅拌2-3h,过滤,收集洗脱液;然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次,收集洗液,用于下批树脂的洗脱;
(4)肝素钠的沉析:将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并,加入浓度为85-95%乙醇搅拌,使洗脱液乙醇浓度达到45-50度,静置6-8h,将沉析肝素钠的上清液回收,收集肝素钠沉淀;
(5)肝素钠的纯化:将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1%NaCl溶液溶解,过滤或离心分离除去不溶物,加入浓度为85-95%乙醇搅拌,使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度,静置5-7h,过滤、收集肝素钠沉淀,用浓度为85-95%乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次,过滤,收集肝素钠沉淀;
(6)干燥:将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干,或在真空条件下干燥,得纯品肝素钠。
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Denomination of invention: Method for extracting sodium heparin Effective date of registration: 20160215 Granted publication date: 20120704 Pledgee: Agricultural Bank of China branch in Guangyuan, Limited by Share Ltd Pledgor: Guangyuan Haitian Industrial Co., Ltd. Registration number: 2016510000005 |
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