CN101845085B - 一种野生大豆ap1类蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种野生大豆AP1类蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该野生大豆AP1类蛋白，命名为GsAP1蛋白，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GsAP1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明野生大豆AP1类蛋白及其编码基因可用于培育早花植物品种特别是早花早熟大豆品种。GsAP1主要在花中表达，在根、茎及种子中表达量极低，在其他组织中则不表达。过量表达GsAP1的烟草植株与转入空载体的烟草相比，其开花期大大提前，约65.7天。说明GsAP1基因能使植物开花期提前，促使植物提前开花。

Description

一种野生大豆AP1类蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及与早花相关的野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白及其编码基因与应用，并涉及来源于野生大豆的与早花相关的MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白及其编码基因与其在培育早花植物品种中的应用。

背景技术

大豆(Glycine max L.)起源于中国，栽培历史最为悠久，是重要的农作物和经济作物，又是工业原料和牲畜家禽的重要饲料，还是重要的出口物资。中国作为大豆的故乡，不仅有丰富的栽培大豆资源，野生大豆种质资源亦十分丰富。野生大豆作为一个古老的物种，是植物种质资源的总要组成部分。其遗传多样性范围广，秆蔓生、多花多荚分枝，具有较大的丰产潜力；具有蛋白含量高、脂肪含量低及抗病虫、耐逆境等多种重要的优良性状，是大豆种质改良的重要基因来源。因此，其杂交利用越来越为育种家所重视，成为改良大豆品质、提高大豆产量的重要种质资源。

在南方，夏大豆生产后期往往遭遇雨季，大豆来不及收获就在植株上开始发芽。有些品种由于营养生长期过长，使成熟处于高温，籽粒中的蛋白质发生变质，籽粒成褐色并产生有毒物质。因此，通过育种。应用基因工程技术进行育种，适当改变大豆的生育期，使南方的大豆生长避开高温和雨季，对提高南方大豆的产量和品质，有着重要的意义。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白及其编码基因与应用。

技术方案

本发明所提供的野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白，名称为GsAP1类蛋白，来源于大豆属野生大豆(Glycine soja Sled.et Zucc.)，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

上述的野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白的编码基因，其cDNA基因具有序列表中GsAP1基因SEQ ID NO.1的DNA序列；其中，序列表中的GsAP1基因SEQ ID NO.1由711个碱基组成，本序列为GsAP1基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO.2的236个氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明GsAP1基因SEQ ID NO.1的表达载体是指pMDC83-GsAP1植物过量表达载体，宿主菌是指将GsAP1基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

扩增GsAP1基因的引物是：

GsAP1-ORF sense：5’ATGGGAAGGGGTAGGGTT 3’，

GsAP1-ORF antisense：5’TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3’

实时荧光定量PCR分析中涉及的GsAP1基因的qPCR引物为：

GsAP1-qPCR sense：5’GGAGAAAGTGATACAGGAGCAGAAT 3’，

GsAP1-qPCR antisense：5’GCTGCGGTAGCAAGAAAGATG 3’。

上述野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白及其编码基因GsAP1基因可在培育早花植物中得到应用。

有益效果

GsAP1能够使花期提前，GsAP1在野生大豆的花组织中强烈诱导，在根、茎及种子中有微弱的表达。导入过量表达GsAP1的烟草与转入空载体的烟草相比，其开花期显著提前，说明GsAP1基因在促使植物的开花期提前方面起着重要作用。

本发明的GsAP1对培育早花植物品种特别是早花早熟大豆，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义。

利用植物表达载体，将本发明的GsAP1的编码基因导入植物细胞，可获得提前开花的转基因细胞系及转基因植株。

使用GsAP1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GsAP1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GsAP1在野生大豆不同组织或器官中的表达特性图

Rt，幼根；St，幼茎；Lf，叶片；Sa，茎尖；In，盛花；Sd，开花后21天的种子。B.GsAP1在野生大豆四轮花器官中的表达。Se，花萼；Pe，花瓣；St，雄蕊；Ca，心皮。C.GsAP1在野生大豆不同花发育时期的表达。Bd，花芽；Fd，花蕾；In，盛花。D.GsAP1在野生大豆不同种子发育时期中的表达。

图2为含有GsAP1的植物表达载体的部分结构示意图

注：野生大豆GsAP1植物转化载体，在大肠杆菌DH5α中为卡那霉素抗性和潮霉素抗性，根癌农杆菌所用菌株为EHA105。

图3为转基因烟草植株Line4、Line15、Line25、Line27、Line28、Line30和转空载体的烟草植株WT-1和WT-2的cDNA作为模板，以烟草的actin作为内标，进行实时荧光定量PCR分析。

注：所用模板为烟草叶片的RNA。

图4为转基因烟草和转入空载体的烟草植株的开花期比较(**，P≤0.01)，转GsAP1基因的平均开花期为105.05天，比对照提前开花大约65.7天。

注：转GsAP1基因的平均开花期为105.05天，比对照提前开花大约65.7天。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

(一)野生大豆GsAP1及其编码基因的cDNA克隆与鉴定

以野生大豆江浦野生豆-5(何慧等，2009，大豆科学，28(5)：784-790)为材料，通过生物信息学的方法，以已报道的拟南芥AP1蛋白序列(AP1，登陆号AAM65504.1)为种子序列，搜索大豆的EST数据库，找到一条高度同源的EST片段，基因命名为GsAP1。以野生大豆花的cDNA为模板进行PCR扩增，结果扩增出与预期大小一致的条带，随后进行PCR产物的割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性克隆测序。测序结果显示已经克隆到野生大豆GsAP1基因的序列，开放阅读框完整，野生大豆GsAP1基因的ORF全长为711bp，编码236个氨基酸。

扩增GsAP1基因的引物是：

GsAP1-ORF sense：5’ATGGGAAGGGGTAGGGTT 3’，

GsAP1-ORF antisense：5’TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3’。

应用实时荧光定量PCR的方法，从野生大豆花的总RNA中扩增GsAP1基因。取野生大豆的花，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(TOYOBO公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、上下游引物各1μl(10μM)、2μl 10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，共32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

(二)野生大豆GsAP1基因在不同组织或器官中的表达特征

对野生大豆品种--江浦野生豆-5进行实时荧光定量PCR分析，分析GsAP1基因在野生大豆各个组织或器官中的表达情况。野生大豆材料经过种脐背部切口处理后，于六月初播种于南京农业大学网室，苗期搭架。田间管理同常规。出苗后4周取根、茎、叶、茎尖；初花期取花芽；盛花期取花苞和盛花；取开花后10D、15D、20D、21D、25D、30D、35D、40D、45D、50D的种子。盛花取下后无菌条件下迅速分离各轮花器官：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，分别液氮速冻后-80℃保存备用。

总RNA的提取同步骤(一)。以大豆组成型表达的Actin基因(GenBank accession No.V00450)为内部参照，以来自野生大豆不同组织或器官的总RNA为模板，进行qPCR(实时荧光定量PCR)分析。GsAP1基因的qPCR引物为：GsAP1-qPCR sense：5’GGAGAAAGTGATACAGGAGCAGAAT 3’，GsAP1qPCR antisense：5’GCTGCGGTAGCAAGAAAGATG 3’。

结果分析表明(图1)，GsAP1在花中强烈表达，在根、茎及种子中有微弱的表达，GsAP1主要在四轮花器官中的花萼和花瓣中表达。GsAP1属于经典ABC模型中的A类基因，A类基因在花萼和花瓣中表达，在雄蕊和雌蕊中不表达。

(三)GsAP1编码蛋白的功能鉴定

利用Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TM II试剂盒，将GsAP1正向***到表达载体pMDC83(Sokolov et al，2005，PNAS，103；9732-9737)(图2)中，得到pMDC83-GsAP1植物过量表达载体，用冻融法将pMDC83-GsAP1转入根癌农杆菌菌株EHA105(Avsian-Kretchmer et al，2004，PlantPhysiology，135：1685-1696)中。pMDC83-GsAP1通过农杆菌EHA105的介导转化烟草，PCR检测结果表明获得45株阳性植株。结合qPCR分析结果选择了6个阳性转基因株系(Line4、Line15、Line25、Line27、Line28、Line30)和转入空载体的烟草WT-1和WT-2的叶片RNA作模板，结果显示GsAP1在转基因烟草中显著表达。统计开花期的结果分析显示，说明过量表达GsAP1基因能够使转基因烟草的开花期提前大约65.7天。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种野生大豆AP1类蛋白及其编码基因与应用

<130>说明书

<160>6

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>711

<212>DNA

<213>大豆属野生大豆(Glycine soja Sled.et Zucc.)

<220>

<221>GsAP1基因读码框(ORF)

<222>(1)..(711)

<223>

<400>1

atgggaaggg gtagggttca gctgaagagg atagagaaca agatcaatcg gcaggtaact    60

ttctccaaaa ggagagctgg gttactcaag aaagcacacg agatctctgt gctctgtgac    120

gctgaggtcg ctttgattgt cttctcccac aaaggaaagc tctttgaata tgccaccgat    180

tcttgcatgg agaagatact ggaacgctat gaaaggtatg cctatgcaga gagacaactt    240

gttgcaaatg attccgagtc acagggaaat tggaccattg agtatactag actcaaggca    300

aagattgacc ttttgcagag aaaccatagg cactatatgg gagaagattt aggttcaatg    360

agcctcaaag agcttcagag tctggagcag cagttagata ctgctctcaa gcaaattcgt    420

acccgcagaa accaactcat gtacgagtcc atttcggagc ttcaaaagaa ggagaaagtg    480

atacaggagc agaataacat gcttgcaaag aagatcaagg agaaagaaaa ggttgcagcg    540

cagcaagcac aatgggagca tccaaaccac ggagttaatg catctttctt gctaccgcag    600

ccacttttga acatgggtgg caattaccgt gaggaagcat cagaagtagg gaggaatgaa    660

cttgacctga ctctggaacc attatattcc tgtcaccttg gatgcttttg a             711

<210>2

<211>236

<212>PRO

<213>大豆属野生大豆(Glycine soja Sled.et Zucc.)

<220>

<221>GsAP1蛋白序列

<222>(1)..(236)

<223>

<400>2

Met  Gly  Arg  Gly  Arg  Val  Gln  Leu  Lys  Arg  Ile  Glu  Asn  Lys  Ile  Asn

1                    5                       10                       15

Arg  Gln  Val  Thr  Phe  Ser  Lys  Arg  Arg  Ala  Gly  Leu  Leu  Lys  Lys  Ala

               20                       25                       30

His  Glu  Ile  Ser  Val  Leu  Cys  Asp  Ala  Glu  Val  Ala  Leu  Ile  Val  Phe

          35                       40                       45

Ser  His  Lys  Gly  Lys  Leu  Phe  Glu  Tyr  Ala  Thr  Asp  Ser  Cys  Met  Glu

     50                       55                       60

Lys  Ile  Leu  Glu  Arg  Tyr  Glu  Arg  Tyr  Ala  Tyr  Ala  Glu  Arg  Gln  Leu

65                       70                       75                       80

Val  Ala  Asn  Asp  Ser  Glu  Ser  Gln  Gly  Asn  Trp  Thr  Ile  Glu  Tyr  Thr

                    85                       90                       95

Arg  Leu  Lys  Ala  Lys  Ile  Asp  Leu  Leu  Gln  Arg  Asn  His  Arg  His  Tyr

               100                      105                      110

Met  Gly  Glu  Asp  Leu  Gly  Ser  Met  Ser  Leu  Lys  Glu  Leu  Gln  Ser  Met

          115                      120                      125

Glu  Gln  Gln  Leu  Asp  Thr  Ala  Leu  Lys  Gln  Ile  Arg  Thr  Arg  Arg  Asn

     130                      135                      140

Gln  Leu  Met  Tyr  Glu  Ser  Ile  Ser  Glu  Leu  Gln  Lys  Lys  Glu  Lys  Val

145                      150                      155                      160

Ile  Gln  Glu  Gln  Asn  Asn  Met  Leu  Ala  Lys  Lys  Ile  Lys  Glu  Lys  Glu

                    165                      170                      175

Lys  Val  Ala  Ala  Gln  Gln  Ala  Gln  Trp  Glu  His  Pro  Asn  His  Gly  Val

               180                      185                      190

Asn  Ala  Ser  Phe  Leu  Leu  Pro  Gln  Pro  Leu  Leu  Asn  Met  Gly  Gly  Asn

          195                      200                      205

Tyr  Arg  Glu  Glu  Ala  Ser  Glu  Val  Gly  Arg  Asn  Glu  Leu  Asp  Leu  Thr

     210                      215                      220

Leu  Glu  Pro  Leu  Tyr  Ser  Cys  His  Leu  Gly  Cys  Phe

225                      230                      235

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GsAP1-ORF sense

<222>(1)..(18)

<223>

<400>3

atgggaaggg gtagggtt                                                               18

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GsAP1-ORF antisense

<222>(1)..(21)

<223>

<400>4

tgtcaaatgc cataccaaag c                                                21

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GsAP1-qPCR sense

<222>(1)..(25)

<223>

<400>5

ggagaaagtg atacaggagc agaat                                            25

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GsAP1-qPCR antisense

<222>(1)..(21)

<223>

<400>6

gctgcggtag caagaaagat g                                                21

Claims (10)

1.一种野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白，命名为GsAP1蛋白，是序列表中的SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：野生大豆MADS-box基因家族SQUA亚家族AP1类蛋白的cDNA基因，是序列表中GsAP1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-GsAP1植物过量表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7.根据权利要求5所述的宿主菌，是指将GsAP1基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

8.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是：

扩增GsAP1基因的引物是：

GsAP1-ORF sense：5’ATGGGAAGGGGTAGGGTT 3’，

GsAP1-ORF antisense：5’TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3’；

实时荧光定量PCR分析中涉及的GsAP1基因的qPCR引物为：

GsAP1-qPCR sense：5’GGAGAAAGTGATACAGGAGCAGAAT 3’，

GsAP1-qPCR antisense：5’GCTGCGGTAGCAAGAAAGATG 3’。

9.权利要求1所述的AP1类蛋白在培育早花植物中的应用。

10.权利要求2或3所述的基因在培育早花植物中的应用。

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