CN101838661B - 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法，属于分子生物学技术领域。包括以下步骤：1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白。本发明有以下优点：1.提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性；2.缩短生产周期，节约能源，利用率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域，具体涉及一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法。
技术背景
藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrrophyta)中。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：即藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，PEC)，藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有α和β亚基。藻胆蛋白中的色基称为藻胆素(phycobilin)，藻胆素的A或D环，或A、D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得不同种类的藻胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射光约580nm的荧光；藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射光约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光，发射光约640nm的荧光；别藻蓝蛋白吸收约650～660nm的可见光，发射光约660～670nm的荧光。
藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物细胞再生的功能；可以抑制癌细胞生长，减轻肿瘤化疗的副作用；同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂；藻胆蛋白作为一种天然色素，也可以应用于食品和化妆品中。由于有强烈的荧光特性，藻胆蛋白还可以制备成荧光探针，在免疫学、细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。
目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002.04.17；一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)；由于天然的蓝藻和红藻亚基存在着单聚体、三聚体和六聚体等多种形式，不利于对其功能的研究和利用。专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法，200710029673.X，2007.8.9，提供了一种利用基因工程方法生产重组藻蓝蛋白的方法，得到的荧光类蛋白质具有结构单一的特点，但是利用此种方法表达的重组荧光类藻蓝蛋白，易形成大量包涵体，得率低；更重要的是得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定 性差，不利于进一步的开发研究。
发明内容
为了解决上述不足，本发明通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合，提高了重组蛋白的稳定性和水溶性。
所采用技术路线为：
1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；
2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白；
所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合，提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性；在大肠杆菌中表达时包涵体少，目的蛋白表达量高，有利于纯化，目的蛋白得率高。
2.不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产新型重组光活性蛋白，大肠杆菌易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁易于破碎，纯化过程可以节约能源，利用率高。
3.只使用一种抗生素的选择压力，菌种较稳定。得到的重组蛋白含有His-tag标记，体系中没有类似蛋白，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。
4.本发明简化了质粒构建过程，构建单一质粒，菌种较稳定，可以规模化发酵生产一种新型重组光活性蛋白，最大吸收波长为621nm，最大激发光波长650nm，具有优良的荧光性质用于新型荧光探针领域；具有生物学活性，主要体现在抗氧化方面，为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方法。
附图说明
图1重组质粒的构建示意图
图2重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳
图3重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳
图4重组蛋白溶解性比较SDS-PAGE电泳图
图5重组蛋白和天然藻蓝蛋白的吸收光谱
图6重组蛋白和天然藻蓝蛋白的激发光谱
具体实施方式：
下面通过实施例具体说明本发明：
a.基因的克隆
从美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取Synechocystis sp.PCC6803的cpcA、cpcE、cpcF、ho1、pcyA基因的序列，序列长分别为0.49kb、0.88kb、0.62kb、0.72kb和0.75kb由此设计引物，所用的引物和反应条件如表1，以Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA为模板，PCR克隆对应的基因。
b.重组质粒的构建
将Synechocystis sp.PCC6803中脱辅基藻蓝蛋白cpcA基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet载体中，基因***载体的步骤为：把上一步经过PCR扩增得到的cpcA基因片段进行电泳(120V，40分钟)，回收cpcA的PCR产物片段；所得片段用设计的限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，同时把载体pCDFDuet用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收酶切后cpcAPCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet；酶切后的cpcA PCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet按3μl∶1μl混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(16℃下16小时)，即得到质粒pCDFDuet-cpcA；把质粒pCDFDuet-cpcA转化进入大肠杆菌，利用含有抗生素的平板筛选出圆形单菌落，挑取单克隆，SDS-PAGE电泳和测序验证。
将克隆的色基裂合酶(cpcE和cpcF)按上述程序依次连接于pCDFDuet-cpcA载体的第一个表达框中，并将麦芽糖结合蛋白基因(mbp)连接于cpcA基因的5′-端；将藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)依次连接于pCDFDuet-cpcA-cpcE-cpcF载体的第二个表达框中，所得质粒叫做pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，ho1-pcyA，如图1所示。
c.重组质粒的转化与重组菌的筛选
将质粒pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，ho1-pcyA转化大肠杆菌BL21，质粒转化入大肠杆菌的转化方式如下：从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21的单菌落，接种于5ml LB液体培养基，37℃震荡培养过夜；取100μl饱和培养物，无菌转接至5ml LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600为0.6左右，冰上放置10min；，离心5min(5000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；用1ml1mol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g，4℃)弃去上清，菌体沉淀用100μl预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，加入步骤2)所得质粒，混匀后冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min后加入400μl LB液体培养基，37℃低速震荡培养1h，转速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相应抗生素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。挑取单克隆，经测序验证即得到大肠杆菌工程菌。
挑取20个菌落，分别接种于5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，震荡培养至饱和；分别从中取出100μl转接至5ml含有相应抗生素的液体培养基中；37℃震荡培养至OD600为0.8-1.0，加入IPTG诱导表达，避光28℃120转/分，表达8-10小时。离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测定荧光量(参见图5)，选取荧光量较高的菌株保种。
d.重组菌的5L规模发酵
5L发酵罐表达别藻蛋白类新型重组光活性蛋白的程序如下：取保存的菌种100μl无菌接种于5ml液体LB培养基，37℃震荡培养12小时，然后转接于含200ml液体LB培养基的三角瓶，37℃震荡培养6小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行，体积比5％的接种量，诱导前培养温度设为37℃，转速随发酵时间由300-500rpm递增，pH均自动控制；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，原培养基中的碳源接近耗尽时，以0.08g/(L·min)葡萄糖的速率进行补料。发酵开始约7h时，先将罐内温度缓慢降至25℃，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养10h以上。
e.重组蛋白的分离纯化
按照每升结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH7.4)加入湿菌体50g的比例将菌体重悬，超声破碎细胞30min，12000rpm，4℃条件下离心，收集上清液，上样于Ni2+亲和色谱柱，用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，500mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脱，洗脱液经G-25脱盐柱脱盐后即得到目的蛋白。
表1
重组蛋白的表达形式分析
图2为重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳；
图3为重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳；
如图4所示，重组蛋白菌体加入适量破碎缓冲液，经超声波破碎后，取50μl破碎液加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，离心后取上清为总蛋白(T)；另取破碎液离心，取上清加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，离心后取上清为可溶性蛋白(S)。每样上样15μl。电泳采用12％分离胶。箭头所示为目的蛋白条带。M为蛋白Marker，左边数字为蛋白分子量。T为总蛋白条带；M为可溶性蛋白条带。总蛋白与可溶性蛋白亮度基本一致(图4)，证明重组蛋白是以可溶性蛋白形式表达，而非包涵体形式表达。
重组蛋白与天然藻蓝蛋白的光谱学性质比较
如图5所示，重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在500-800nm波长的吸收图谱。两者的最大吸收波长一致，为623nm。
如图6所示，重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在400-800nm波长的荧光发射图谱，激发波长为620nm。两者的最大发射波长一致，为650nm。
如图5和6所示，光谱学试验结果表明，重组蛋白与天然蛋白有相似的光谱学特征。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法
<130>
<140>200910019914.1
<141>2009-03-14
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<170>PatentIn version 3.1
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Claims (2)
1.一种荧光类融合藻蓝蛋白的生物合成方法，其特征包括以下步骤：
1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因hox1和pcyA克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；
2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白；
所述工程菌发酵为：将筛选得到菌种于液体LB培养基中，以37℃震荡培养12小时，再以体积比5％的接种量转入发酵罐中发酵培养，诱导前培养温度设为37℃，转速随发酵时间由300-500rpm递增；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，以0.08g/(L·min)速率进行补料葡萄糖；发酵7h时将罐内温度缓慢降至25℃，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养10h。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803。
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