CN101838661A - 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法,属于分子生物学技术领域。包括以下步骤:1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合,并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框,藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框,得到一个含有多个相关基因的表达质粒;2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后,筛选得到高产菌,应用此工程菌发酵,经蛋白的分离纯化,得到荧光类融合藻蓝蛋白。本发明有以下优点:1.提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性;2.缩短生产周期,节约能源,利用率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域,具体涉及一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法。
技术背景
藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrrophyta)中。根据吸收光谱的不同,可将藻胆蛋白分为4大类:即藻红蛋白(phycoerythrin,PE),藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin,PEC),藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有α和β亚基。藻胆蛋白中的色基称为藻胆素(phycobilin),藻胆素的A或D环,或A、D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象,使得不同种类的藻胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光,发射光约580nm的荧光;藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光,发射光约630nm的荧光;藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光,发射光约640nm的荧光;别藻蓝蛋白吸收约650~660nm的可见光,发射光约660~670nm的荧光。藻胆蛋白具有提高人体免疫力,促进动物细胞再生的功能;可以抑制癌细胞生长,减轻肿瘤化疗的副作用;同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂;藻胆蛋白作为一种天然色素,也可以应用于食品和化妆品中。由于有强烈的荧光特性,藻胆蛋白还可以制备成荧光探针,在免疫学、细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。
目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法,CN1344723,2002.04.17;一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法,CN1563083,2005.01.12);由于天然的蓝藻和红藻亚基存在着单聚体、三聚体和六聚体等多种形式,不利于对其功能的研究和利用。专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法,200710029673.X,2007.8.9,提供了一种利用基因工程方法生产重组藻蓝蛋白的方法,得到的荧光类蛋白质具有结构单一的特点,但是利用此种方法表达的重组荧光类藻蓝蛋白,易形成大量包涵体,得率低;更重要的是得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定性差,不利于进一步的开发研究。
发明内容
为了解决上述不足,本发明通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合,提高了重组蛋白的稳定性和水溶性。
所采用技术路线为:
1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合,并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框,藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框,得到一个含有多个相关基因的表达质粒;
2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后,筛选得到高产菌,应用此工程菌发酵,经蛋白的分离纯化,得到荧光类融合藻蓝蛋白;
所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
1.通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合,提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性;在大肠杆菌中表达时包涵体少,目的蛋白表达量高,有利于纯化,目的蛋白得率高。
2.不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产新型重组光活性蛋白,大肠杆菌易于培养,生长快,可以大大缩短生产周期;与藻类相比,大肠杆菌细胞壁易于破碎,纯化过程可以节约能源,利用率高。
3.只使用一种抗生素的选择压力,菌种较稳定。得到的重组蛋白含有His-tag标记,体系中没有类似蛋白,通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白,且纯度较高。
4.本发明简化了质粒构建过程,构建单一质粒,菌种较稳定,可以规模化发酵生产一种新型重组光活性蛋白,最大吸收波长为621nm,最大激发光波长650nm,具有优良的荧光性质用于新型荧光探针领域;具有生物学活性,主要体现在抗氧化方面,为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方法。
附图说明
图1重组质粒的构建示意图
图2重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳
图3重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳
图4重组蛋白溶解性比较SDS-PAGE电泳图
图5重组蛋白和天然藻蓝蛋白的吸收光谱
图6重组蛋白和天然藻蓝蛋白的激发光谱
具体实施方式:
下面通过实施例具体说明本发明:
a.基因的克隆
从美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取Synechocystis sp.PCC6803的cpcA、cpcE、cpcF、hol、pcyA基因的序列,序列长分别为0.49kb、0.88kb、0.62kb、0.72kb和0.75kb由此设计引物,所用的引物和反应条件如表1,以Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA为模板,PCR克隆对应的基因。
b.重组质粒的构建
将Synechocystis sp.PCC6803中脱辅基藻蓝蛋白cpcA基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet载体中,基因***载体的步骤为:把上一步经过PCR扩增得到的cpcA基因片段进行电泳(120V,40分钟),回收cpcA的PCR产物片段;所得片段用设计的限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切,同时把载体pCDFDuet用同样的限制性内切酶进行酶切,分别回收酶切后cpcAPCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet;酶切后的cpcA PCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet按3μl∶1μl混合,在T4连接酶作用下连接一定时间(16℃下16小时),即得到质粒pCDFDuet-cpcA;把质粒pCDFDuet-cpcA转化进入大肠杆菌,利用含有抗生素的平板筛选出圆形单菌落,挑取单克隆,SDS-PAGE电泳和测序验证。
将克隆的色基裂合酶(cpcE和cpcF)按上述程序依次连接于pCDFDuet-cpcA载体的第一个表达框中,并将麦芽糖结合蛋白基因(mbp)连接于cpcA基因的5′-端;将藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)依次连接于pCDFDuet-cpcA-cpcE-cpcF载体的第二个表达框中,所得质粒叫做pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF,hol-pcyA,如图1所示。
c.重组质粒的转化与重组菌的筛选
将质粒pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF,hol-pcyA转化大肠杆菌BL21,质粒转化入大肠杆菌的转化方式如下:从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21的单菌落,接种于5mlLB液体培养基,37℃震荡培养过夜;取100μl饱和培养物,无菌转接至5ml LB液体培养基,37℃震荡培养至OD600为0.6左右,冰上放置10min;,离心5min(5000g,4℃)弃去上清,收集沉淀菌体;用1ml1mo l/L CaCl2无菌溶液重悬菌体,离心30s(10000g,4℃)弃去上清,菌体沉淀用100μl预冷的0.1mol/L CaCl2重悬,加入步骤2)所得质粒,混匀后冰浴30min,42℃热激90s,冰浴5min后加入400μl LB液体培养基,37℃低速震荡培养1h,转速梯度增加至正常,涂布菌液在含有相应抗生素的LB固体平板上,倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。挑取单克隆,经测序验证即得到大肠杆菌工程菌。
挑取20个菌落,分别接种于5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中,震荡培养至饱和;分别从中取出100μl转接至5ml含有相应抗生素的液体培养基中;37℃震荡培养至OD600为0.8-1.0,加入IPTG诱导表达,避光28℃120转/分,表达8-10小时。离心收集细胞,细胞加入缓冲液重悬;通过光谱仪测定荧光量(参见图5),选取荧光量较高的菌株保种。
d.重组菌的5L规模发酵
5L发酵罐表达别藻蛋白类新型重组光活性蛋白的程序如下:取保存的菌种100μl无菌接种于5ml液体LB培养基,37℃震荡培养12小时,然后转接于含200ml液体LB培养基的三角瓶,37℃震荡培养6小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行,体积比5%的接种量,诱导前培养温度设为37℃,转速随发酵时间由300-500rpm递增,pH均自动控制;发酵开始4h后,菌体生长至对数期,原培养基中的碳源接近耗尽时,以0.08g/(L·min)葡萄糖的速率进行补料。发酵开始约7h时,先将罐内温度缓慢降至25℃,然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L,降低转速至150rpm,诱导培养10h以上。
e.重组蛋白的分离纯化
按照每升结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠,0.5mol/L氯化钠,20mmol/L咪唑,pH7.4)加入湿菌体50g的比例将菌体重悬,超声破碎细胞30min,12000rpm,4℃条件下离心,收集上清液,上样于Ni2+亲和色谱柱,用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗色谱柱后,用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠,0.5mol/L氯化钠,500mmol/L咪唑,pH 7.4)洗脱,洗脱液经G-25脱盐柱脱盐后即得到目的蛋白。
表1
重组蛋白的表达形式分析
图2为重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳;
图3为重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳;
如图4所示,重组蛋白菌体加入适量破碎缓冲液,经超声波破碎后,取50μl破碎液加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸10min,离心后取上清为总蛋白(T);另取破碎液离心,取上清加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸10min,离心后取上清为可溶性蛋白(S)。每样上样15μl。电泳采用12%分离胶。箭头所示为目的蛋白条带。M为蛋白Marker,左边数字为蛋白分子量。T为总蛋白条带;M为可溶性蛋白条带。总蛋白与可溶性蛋白亮度基本一致(图4),证明重组蛋白是以可溶性蛋白形式表达,而非包涵体形式表达。
重组蛋白与天然藻蓝蛋白的光谱学性质比较
如图5所示,重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在500-800nm波长的吸收图谱。两者的最大吸收波长一致,为623nm。
如图6所示,重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在400-800nm波长的荧光发射图谱,激发波长为620nm。两者的最大发射波长一致,为650nm。
如图5和6所示,光谱学试验结果表明,重组蛋白与天然蛋白有相似的光谱学特征。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法
<130>
<140>200910019914.1
<141>2009-03-14
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<213>人工合成
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<223>
<400>12
attggatcct cgatcccgag gttgtt 26
Claims (2)
1.一种荧光类融合藻蓝蛋白的生物合成方法,其特征包括以下步骤:
1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合,并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框,藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框,得到一个含有多个相关基因的表达质粒;
2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后,筛选得到高产菌,应用此工程菌发酵,经蛋白的分离纯化,得到荧光类融合藻蓝蛋白。
2.按照权利要求1的方法,其特征在于:所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。
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