CN101838300B

CN101838300B - 一种提取残留阿维菌素的方法

Info

Publication number: CN101838300B
Application number: CN 201010192026
Authority: CN
Inventors: 沈德堂; 储消和; 潘贞德; 吴雪萍
Original assignee: Zhejiang Shenghua Biok Biology Co ltd
Current assignee: Zhejiang biok Biology Technology Co. Ltd.
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2030-06-04
Also published as: CN101838300A

Abstract

本发明涉及一种从结晶母液中提取残留阿维菌素的方法，包括酯类杂质去除和利用C18柱或硅胶柱进一步分离各组份。本分离提取工艺简单，选用的溶剂价廉、安全、环保，符合产业化需求，有效成分B1收率高，达90%左右。

Description

一种提取残留阿维菌素的方法

技术领域

本发明涉及一种从抗生素废液中提取残留的有生物活性的抗生素组份的方法，尤其涉及一种从阿维菌素的结晶母液中分离提取有效组份B1和相关的生物活性组份的方法。

背景技术

阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物。阿维菌素自80年代初问世以来已广泛应用于动物寄生虫病防治和农作物害虫的防治。

阿维菌素共包括8个组分：A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b，主要有4种即A1a、A2a、B1a和B2a，其中avermectin B1a的生物活性最强。

阿维菌素的生产工艺过程如下：用经优选的高产斜面菌种制备液体菌种，然后发酵培养260小时左右，发酵结束，将发酵液经板框压滤，弃滤液，得菌丝体滤饼经干燥后用甲醇提取，之后脱溶剂并转相脱水溶性和部分醇溶性杂质，然后加入适量的甲醇或乙醇进行结晶，即可获得阿维菌素结晶(B1组份)和结晶母液。

在结晶母液中残留有阿维菌素(B1)和阿维菌素的同系物A1、A2、B2组份，母液中还含有8～18个碳的脂肪酸及其与甘油形成的酯类物质，以上组份在脱净溶剂后的母液中所占的百分比组成为：B1组份占5％左右；B2+A2+A1占40％左右；酯类杂质占50％左右。B1组份是现阶段广泛应用于动、植物以防治害虫和寄生虫的组份，A1、A2、B2组份同样具有杀虫活性，是有待于开发的组份。其中B2a组份是一种杀植物地下线虫活性较高的组份之一。然而，从母液中进一步采用结晶的方法直接分离其中残留的活性组份，几乎是不可能，这是因为大量的酯类杂质的存在和A组份不易结晶所致。

我国自1993年开始生产阿维菌素至今年产量已达2000吨左右，但是在结晶母液中残留有15％左右的阿维菌素(占总量的百分比)由于提取不出来而被弃之或非法出售，尚有阿维菌素B2a、A2a、A1a等活性成份均残留在母液中而未被合理应用，造成环境污染和资源浪费。

发明内容

本发明的目的是针对目前阿维菌素结晶母液活性成分难以提取的问题，提供一种提取残留阿维菌素的方法，它通过柱层析法在适当的温度压力控制下，使有效组分结晶收率达90％以上，从而满足了产业部门的需要，解决了人们长期渴望解决而未能获得成功的技术难题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种提取残留阿维菌素的方法，包括以下步骤：

a、将结晶母液蒸馏脱除溶剂，获得脱溶剂后的第一油状液；

b、采用硅胶柱层析方法进一步分离第一油状液：柱层析用的固定相为硅胶，流动相为体积比为2/1的乙酸乙酯/石油醚，在柱温50℃～60℃、柱压大于0.5MPa的条件下进行洗脱，最先流出的组份为酯溶性杂质；在酯溶性杂质流出后改换单一溶剂乙酸乙酯为流动相，将阿维菌B1、A1、B2、A2四组份从柱子中洗脱出来，然后将洗脱液蒸馏脱除乙酸乙酯，获得含B1、A1、B2、A2四组份的第二油状液；

c、采用碳十八烷基硅烷柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：柱层析用的固定相为C18，流动相为体积比为(81～90)/(10～19)的甲醇/水，在柱温50℃～60℃、柱压大于0.5MPa的条件下洗脱，最先流出的组份为酯溶性杂质，其后依次为B2a、A2a、B1b、B1a、A1a，分别回收含B2a、B1b和B1a的洗脱液，最后减压蒸馏脱除溶剂获得B1a、B1b、B2a。

优选地，所述甲醇/水流动相的体积比为85/17。

本发明还提供了一种提取残留阿维菌素的方法，包括以下步骤：

a、将结晶母液蒸馏脱除溶剂，获得脱溶剂后的第一油状液；

c、采用硅胶柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：柱层析用的固定相为硅胶，流动相为体积比为9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/二氯甲烷/甲醇，柱温为50℃～60℃，柱压维持在0.5MPa～3MPa，最先流出的组份为含A组份的洗脱液，其后为含B组份的洗脱液，然后将含B组份的洗脱液用蒸馏法脱除溶剂后，用乙醇或甲醇在60℃～70℃回流溶解，最后在搅拌条件下降温至5℃～30℃，析出B1组分。

现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。层析法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。本发明选择价廉、安全、环保的流动相，配合固定相，在适当的温度和压力下，依据柱层析原理有效地从阿维菌素的结晶母液中分离提取出B1、A1、B2、A2组分。

本发明提供的提取残留阿维菌素的方法，在上述步骤b后，有两种可供选择的步骤即C1或C2可以分离出各组分。

步骤C1：

固定相：十八烷基硅烷(C18)；

流动相：甲醇/水＝(81～90)/(10～19)；

在50～60℃，大于5公斤压力条件下进行洗脱，采用紫外检测仪进行在线监测。其流出组份先后顺序为：B2a、A2a、B1b、B1a、A1a，分步将上述组份回收；回收液减压蒸馏除去部分甲醇后，活性组份即可析出。就B1a而言，浓缩到B1a浓度为5％～6％时，于15℃左右即可析出。

步骤C2：

固定相仍为硅胶，流动相为体积比为9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/二氯甲烷/甲醇，在50℃～60℃、大于5公斤压力下进行柱层析，可将A(A1+A2)与B(B1+B2)拆分开，即先流出柱的组份为A1a、A1b与A2a、A2b的混合物，之后流出的组份为B1a、B1b与B2a、B2b的混合物。后者经脱溶剂后，用乙醇或甲醇在在60℃～70℃回流溶解，然后降到5℃～30℃进行结晶，析出B1组分，B1a可大部分结晶出来，结晶收率达理论收率的90％左右。

由于A1a、A2a、B1a和B2a的结构非常近似，分离上述四种物质较为困难，常规柱层析提取物质成分的收率一般在理论收率的80％左右，而本发明提供的提取残留阿维菌素的方法收率可达90％以上，具有显著的进步，且操作简单，成本低。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、解决了现有技术阿维菌素结晶母液活性成分难以提取的问题，为今后从阿维菌素废液中有效分离提取活性组分开辟了方向；

2、分离提取工艺简单；

3、选用的溶剂价廉、安全、环保，符合产业化需求；

4、结晶收率高，浓缩后析出的有效组分收率达理论产量的90％左右。

具体实施方式

实施例一：

(1)取阿维菌素结晶母液14公斤，于70℃、真空度为0.08MPa条件下除净溶剂，得第一油状液10公斤。经高效液相色谱法HPLC分析，该油状液含B1a 5.5％、B2a 16.7％、A2a 14.2％、A1a 11.1％；

(2)向第一油状液中加入10升乙酸乙酯和5升石油醚作流动相，60℃回流溶解备用；

(3)将硅胶柱用流动相洗脱平衡后，使液面降至床体面备用；

(4)上样，将用流动相溶解后的第一油状液缓慢的加入到层析柱床体表面上，之后加压并打开下部洗脱液流出口，使样液完全进入床体后，关闭下部洗脱液流出口，向床体上面缓慢加满流动相，并与贮有流动相的贮罐密封连接；打开下流出口，常压洗脱约30分钟后逐渐加压到0.5Mpa、在50℃条件下洗脱，当检测出油酯类杂质完全流出后，换用乙酸乙酯为流动相于60℃、1.5MPa条件下继续洗脱，将A1a、A2a、B1a、B2a完全洗脱出来，回收洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，得含A1、A2、B1、B2四组份的第二油状物；

(5)采用碳十八烷基硅烷柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：具体操作如下：①将第二油状液用甲醇溶解，缓慢加入到十八烷基硅烷柱床表面；②打开下出口，使完全进入床体后，在50℃、0.5Mpa下开始用甲醇/水流动相进行洗脱：先用比例为90/10的甲醇/水洗脱10分钟，之后用比例为88/12的甲醇/水洗脱20分钟，之后用比例为85/15的甲醇/水进行洗脱15分钟，采用可自动进行波长扫描的紫外检测仪在线检测，最先流出的组份为少量的杂质，之后依次流出B2a、A2a、B1b、B1a、A1a等组份；③分别回收含各组份的洗脱液，将回收的洗脱液分别蒸馏除甲醇溶剂，即可获得B2a、A2a、B1b、B1a、A1a各组份，B1a收率为95.6％，纯度达80％；B2a收率为94.7％，纯度达80％。

实施例二：

(2)向第一油状液中加入14升乙酸乙酯和7升石油醚作流动相，50℃回流溶解备用；

(3)将硅胶柱用流动相洗脱平衡后，使液面降至床体面备用；

(4)上样，将用流动相溶解后的第一油状液缓慢的加入到层析柱床体表面上，之后加压并打开下部洗脱液流出口，使样液完全进入床体后，关闭下部洗脱液流出口，向床体上面缓慢加满流动相，并与贮有流动相的贮罐密封连接；打开下流出口，常压洗脱约30分钟后逐渐加压到1.5MPa，在60℃条件下洗脱，当检测出油酯类杂质完全流出后，换用乙酸乙酯为流动相于60℃、2MPa条件下继续洗脱，将A1a、A2a、B1a、B2a完全洗脱出来，回收洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，得含A1、A2、B1、B2四组份的油状物；

(5)采用碳十八烷基硅烷柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：具体操作如下：①将第二油状液用甲醇溶解，缓慢加入到十八烷基硅烷柱床表面；②打开下出口，使样品液完全进入床体后，在60℃、3Mpa下开始用体积比为85//17的甲醇/水流动相洗脱30分钟，采用可自动进行波长扫描的紫外检测仪在线检测，最先流出的组份为少量的杂质，之后依次流出B2a、A2a、B1b、B1a、A1a等组份；③分别回收含各组份的洗脱液将回收的洗脱液分别蒸馏除溶剂，即可获得B2a、A2a、B1b、B1a、A1a各组份，B1a收率为94％，纯度达92％；B2a收率为95％，纯度达92％。

实施例三：

(1)取实施例1中第(4)步获得的含A1、A2、B1、B2四组份的油状物，用体积比为2/1的乙酸乙酯/甲醇溶解，得样液；

(2)将硅胶柱用流动相平衡好后，将上述样液加入到平衡好的硅胶柱床表面，之后打开下出口，待样液完全进入柱床中后用流动相开始洗脱，柱温为60℃、柱压为3MPa，流动相为体积比为9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/二氯甲烷/甲醇；用紫外检测仪在线检测，先流出的组份为A组份(A1a+A2a+A1b+A2b)，之后为B组份(B1a+B2a+B1b+B2b)，分别回收，将含B组份的洗脱液减压蒸馏除净溶剂，之后加入乙醇于70℃回流溶解，然后在搅拌条件下降温到30℃左右，过夜，B1a+B1b即可结晶析出，B1a+B1b收率可达90％左右，纯度达90％(B1a+B1b)。

实施例四：

(1)取实施例2中第(4)步获得的含A1、A2、B1、B2四组份的油状物，用乙酸乙酯溶解，得样液；

(2)将硅胶柱用流动相平衡好后，将上述(1)中的样液加入到平衡好的硅胶柱床表面，之后打开下出口，待样液完全进入柱床中后用流动相开始洗脱，柱温为50℃、柱压为0.5MPa，流动相为体积比为9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/二氯甲烷/甲醇；用紫外检测仪在线检测，先流出的组份为A组份(A1a+A2a+A1b+A2b)，之后为B组份(B1a+B2a+B1b+B2b)，分别回收，将含B组份的洗脱液减压蒸馏除净溶剂，之后加入甲醇于60℃回流溶解，然后在搅拌条件下降温到5℃左右，过夜，B1a+B1b即可结晶析出，B1a+B1b收率可达91％，纯度达85％(B1a+B1b)。

Claims

1.一种提取残留阿维菌素的方法，包括以下步骤：

a、将结晶母液蒸馏脱除溶剂，获得脱溶剂后的第一油状液；

c、采用碳十八烷基硅烷柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：柱层析用的固定相为C18，流动相为体积比为(81～90)/(10～19)的甲醇/水，在柱温50℃～60℃、柱压大于0.5MPa的条件下洗脱，最先流出的组份为酯溶性杂质，其后依次为B2a、A2a、B1b、B1a、A1a，分别回收含B2a、B1b和B1a的洗脱液，最后减压蒸馏脱除溶剂后获得B1a、B1b、B2a。

2.一种如权利要求1所述的提取残留阿维菌素的方法，其特征在于所述甲醇/水流动相体积比为85/17。

3.一种提取残留阿维菌素的方法，包括以下步骤：

a、将结晶母液蒸馏脱除溶剂，获得脱溶剂后的第一油状液；

c、采用硅胶柱层析方法拆分所述第二油状液中的B1、A1、B2、A2四组份：柱层析用的固定相为硅胶，流动相为体积比为9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/二氯甲烷/甲醇，柱温为50℃～60℃，柱压维持在0.5～3MPa，最先流出的组份为含A组份的洗脱液，其后为含B组份的洗脱液，然后将含B组份的洗脱液用蒸馏法脱除溶剂后，用乙醇或甲醇在60℃～70℃回流溶解，最后在搅拌条件下降温至5℃～30℃，析出B1组分。