CN101824421A - 一个棉花体细胞胚发生受体类激酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个新棉花体细胞胚发生相关受体类激酶GhSERK1，及其编码基因与应用。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；其编码基因的基因组序列分别如SEQ ID NO：1所示；其编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；其开放读码框序列为序列表中SEQ ID NO：4所示。本发明还公开了该基因(GhSERK1)在棉花雄蕊发育中起重要作用的特性。该基因对培育雄性不育植物品种提供基因源，对培育植物雄性不育系具有重要的意义。

Description

一个棉花体细胞胚发生受体类激酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一个棉花的体细胞胚发生类受体激酶，命名为GhSERK1，及其编码基因序列。本发明还涉及含有该基因的表达载体，以及利用该基因培育的转基因植株。

背景技术

植物胚胎发育生物学的范畴广义地说包含着花的形成，雌雄配子体的发生，配子的形成，受精与亲和性，以及果实，种子等孢子体形成过程中结构与功能的关系，形态建成的生理与分子基础，以及遗传信息展现的时空顺序等生殖发育的多个方面(唐锡华等，2001)。

目前，已在植物的花萼、花瓣、花药、花柱和子房等生殖器官的细胞组织中检测到了一些特异蛋白质，这些蛋白质是植物细胞在不同的生殖发育时期特异基因的表达产物，被认为与各个时期细胞的功能或组织的形态建成密切相关。花粉发育是一个复杂交错的过程。在花粉粒释放时许多反应都达到最大量。影响花粉发育的不同阶段的突变体已研究了很多。许多已报道的花粉败育突变体都是由于孢子体突变，比如花药的药室内壁或绒毡层，因为花药中壁细胞和孢子细胞间的互作对于小孢子和花粉粒成熟都起着重要的作用。

Schmidt等在胡萝卜(Daucus carota)中寻找能够监测悬浮细胞培养体细胞向胚性细胞转变的标记基因时发现的一段cDNA克隆，氨基酸顺序以及激酶体外分析表明，该基因编码一种亮氨酸重复受体类激酶LRR-RLK(Schmidt等，2001)。随后体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶(SERK)基因相继地在拟南芥、水稻等多种植物中克隆和表达，并被证实是植物界中广泛存在的结构保守基因家族。SERK基因不仅在胚性组织中表达，还在非胚性组织中表达，参与了植物胚胎发育、雄性发育、病害防御和信号传导等活动。目前研究发现SERK基因的表达参与下列过程：首先，SERK可标记有胚胎发生能力的细胞：无论是DcSERK、AtSERK还是MtSERK，研究表明SERK是胚胎发生细胞的一个很好的标记。与其它标记如单克隆抗体JIM8、JIM13以及同功酶、酯酶等相比，SERK在培养条件下显得具有非常的独特性，能够显示其它标记所不能显示的被标记细胞与细胞成胚能力之间的关系(Schmidt ED，1997；Thomas TL，1993；Jianru Z，2002)。其次，SERK参与油菜素类固醇(brassinosteroid，BR)信号转导(Russinova E等，2004)：BR参与了包括植物生长发育、抵抗逆境等许多生理活动。目前已鉴定BR信号转导的部分组分，如BRI1(BR insensitive 1)、BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)、BIN2(BR-insensitive2)、BES1(BRI1-EMS-suppressor 1protein，即BIN2底物1蛋白)、BZR1(brassinazoleresistant1 protein，即BIN2底物2蛋白)等，各组分的功能和相互之间的关系也已有了解。BAK1是一种SERK蛋白，等同于AtSERK3。遗传和生化实验证明，BAK1/BRI1复合物引发BR信号。AtSERK3(BAK1)的一个作用可能是通过改变质膜与胞内体中BRI1的平衡介导BR信号(Rumyana K等，2006)。第三，SERK参与植物病害防御：LRR-RLKs参与植物抗病反应的报导较多，如Xa21基因参与了水稻抗白叶枯病反应。OsSERK1属于LRR-RLKs之一，不仅能被稻瘟菌侵染诱导表达，还参与了水稻抗稻瘟菌的反应。水稻受稻瘟菌侵染后，OsSERK1被诱导表达，且它的表达量与水稻的抗病性有定性关系(Song WY等，1995；Staskawicz BJ等，1995)。最后，SERK参与孢子体发育：目前，有报导称拟南芥serk1或serk2的单突变体不能引起孢子体发育的任何异常表型，但serk1serk2双突变体导致孢子体发育不完全或雄性不育。serk1serk2双突变体的造孢细胞产生小孢子母细胞只能进行减数***到四分体时期，随后母性细胞消失，导致雄性完全不育(Catherine A等，2005)。Tean等观察到serk1serk2双突变体的造孢细胞的外层细胞只能发育成3层细胞，缺乏野生型的绒毡层细胞，使孢子体不能正常发育成成熟的花粉粒，这与ems1/exs和tpd1突变体表型相似。serk1serk2双突变体的不育性可通过用野生型花粉粒恢复，且产生的种子可以正常发育。然而目前尚未见SERK基因在重要经济作物棉花中的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供棉花GhSERK1基因的基因组序列，全长cDNA序列与氨基酸序列，它们分别为序列表中SEQ ID NO：

1、2、3所示。

本发明的另一个目的是提供棉花GhSERK1基因的开放读码框序列，为序列表中SEQ ID NO：4所示。

本发明的再一个目的是提供棉花GhSERK1基因的表达载体pK7GGS11683(CGMCC No：3879)，以及这个表达载体上所含有的cDNA序列，它为序列表中SEQ ID NO：5所示。同时用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。含有该发明GhSERK1基因的表达载体和细胞系，以及含有该类基因的植物品系种均为本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是所述的表达载体可通过使用农杆菌侵染，花粉管通道，基因枪转化等导入植物细胞，可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：棉花、水稻、小麦、玉米、油菜、甘蔗、黄瓜、苜蓿等。

附图说明

图1表示利用简并引物扩增棉花基因组DNA获得的GhSERK1基因的DNA片段的电泳图。

图2表示含有GhSERK1基因组DNA的BAC克隆酶切图。

图3表示GhSERK1编码基因开放读码以cDNA为模板PCR扩增结果的琼脂糖电泳图。

图4为GhSERK1基因基因组结构(包含预测的转录起始位点)。

图5为GhSERK1基因外显子与内含子结构示意图。

图6为GhSERK1基因全长cDNA中5’UTR，开放读码框(CDS)与3’UTR结构示意图。

图7为GhSERK1蛋白跨膜结构域预测示意图。

图8为GhSERK1蛋白结构域示意图。

图9为在雄性不育系和可育系与生殖发育相关组织中，GhSERK1基因的表达差异。

图10为转GhSERK1基因表达载体(pK7GGS11683与pK7GGS17016)的构建过程示意图。

图11为转表达载体pK7GGS17016棉花的PCR鉴定。

图12为转表达载体pK7GGS11683棉花的PCR鉴定。

图13为转表达载体pK7GGS11683棉花的花器官表型图。

图14为转表达载体pK7GGS17016棉花的花器官表型图。

具体实施方式

实施例1棉花GhSERK1编码基因的克隆

材料与方法

1)棉花材料：棉花材料选用自选品种Y18R。

2)菌种：大肠杆菌E.coli DH5α。

3)载体：pMD18-T、pK7GWIWG2(I)。

4)工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自TaKaRa公司、NEB公司及Fermentas公司。

5)化学试剂：化学药品均为国内外分析纯。

6)引物合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

下述实施例中所有方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1，棉花GhSERK1基因的克隆

(1)棉花基因组的制备：采用改良CTAB法提取陆地棉品种Y18叶片部位的基因组，用于PCR；

1)提取液配制

1L提取液含：Tris-HCl(PH8.0)            0.1M

EDTA(PH8.0)                0.02M

NaCl                       1.5M

PVP40(w/v)                 2％

CTAB(w/v)                  2％

以上溶液各自溶解后混合，定容到1L；临用前加2％β-巯基乙醇。

2)称取0.3g幼嫩棉花叶片放入2mL离心管里，加入钢珠，液氮速冻后，放置于Genegrid研磨仪上振荡30s，加入1mL预热65℃提取缓冲液。颠倒混匀。

3)将溶液置于65℃水浴中40分钟；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)振荡混匀，4℃离心机12000rpm离心10分钟，将上清转移到另一离心管中，用氯仿∶异丙醇(24∶1，V/V)再抽提一次，离心收集上清；

4)加入0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀，室温静置30min。用毛细管将絮状DNA挑出，或者直接室温12000rpm离心10分钟，用70％的酒精洗涤1-2次，再用100％酒精洗涤1次，室温干燥DNA。

5)加200μL TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)或者纯水(ddH₂O)，室温放置1小时，或者65℃水浴使DNA完全溶解；

6)加入20ul无DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37℃保温1小时，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V/V)抽提1～2次，将上清转移到另一个离心管中；

7)加0.1倍体积的3M NaAc(PH5.2)，2倍体积的冰预冷的无水乙醇，混匀后放置5分钟。缓缓水平转离心管5分钟，此时将于界面处形成一团粘稠透明的絮状沉淀用毛细管轻轻钩出，转移到1.5ml的离心管中；或者直接12000rpm离心10分钟，沉淀DNA。

8)加1mL70％的酒精洗涤沉淀，10000g离心10分钟，去掉上清，再用70％、100％的酒精各洗沉淀一次，在空气中使核酸沉淀干燥；

9)用50ul的TE重新溶解沉淀，于-20℃或-70℃贮存。

结合生物信息学获取SERK基因保守片断EST序列：根据GenBank库SERK基因结构特点，结合保守结构域序列设计2条简并引物：

上游引物：5’CAGTTTCARACHGARGTDGAG 3’

下游引物：5’ATGTTTGCWGCTTTYACRTC 3’

(M：AorC；K：GorT；W：AorT；R：AorG；Y：CorT；S：CorG；D：AorGorT；H：AorCorT；N：AorCorGorT)

扩增获得一个目的扩增结果，大小为1500bp，回收后与pMD18-T载体连接、16℃过夜，转化受体菌DH5α，菌液PCR及酶切鉴定正确的菌株送测序。(图1中，M：Marker，1，，2，3，4，5分别是GhSERK1以棉花基因组DNA为模板PCR扩增获得1.5Kb片段)

在已知序列的基础上，设计特异引物：

上游引物：5′CAGTTTCAGACAGAAGTAGAG3′

下游引物：5′ATGTTTGCTGCTTTCACATC3′

筛选棉花Y18基因组BAC文库，获得阳性克隆后(图2中，1：Marker，2：箭头所指为阳性BAC克隆***片段大小)，测序获得GhSERK1的全长基因组序列，为序列表中SEQ ID NO：1(图4：为利用Softberry软件分析获得GhSERK1基因基因组结构，包含预测转录起始位点后GhSERK1基因全长为6920bp；其中CDS表示外显子，共11个外显子，10个内含子；TSS表示预测的转录起始位点，转录起始位点TSS至ATG为453bp；图5为GhSERK1基因中外显子与内含子的位置及相对片段长度，其中方框为外显子，直线为内含子，共6467bp；)。

3)GhSERK1全长cDNA序列的获得：

采用3’RACE和5’RACE的方法得到了GhSERK1全长cDNA序列，3’RACE和5’RACE按TaKaRa公司的3’RACE和5’RACE试剂盒说明操作。

具体方法包括以下步骤：

1、总RNA的提取：

1)将0.2g冷冻的材料放入预冷的研钵中，研磨成粉状，倒入2mL离心管中，加1mL预热至80℃的基本提取液，10μl DTT贮备液和25μl蛋白酶K贮备液，混匀；

2)42℃，100rpm，温和摇动90分钟；

3)每管加入80μl 2mol/L KCl溶液，调整KCl终浓度至160mmol/L，冰浴1小时；

4)12,000rpm离心20分钟，取900μl上清液，加入300μl 8mol/L LiCl，混匀，冰上过夜沉淀；

5)12,000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用2mol/L LiCl(冰预冷)洗2～3次，直至上清液无色；

6)悬浮LiCl-RNA沉淀于400μl 10mmol/L Tris-Cl(pH7.5)，混匀，12,000rpm离心10分钟，转移上清至新离心管中；

7)加入1/10体积的2mol/L KAc(pH5.5)，混匀，冰浴15分钟；

8)12,000rpm离心10分钟，除去盐不溶性物质，取上清；

9)用2.5倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀2～3小时；

10)用70％冷乙醇洗涤RNA沉淀，真空快速干燥，溶于DEPC水中；

11)加RNase-Free DNase，37℃，30分钟；

12)加等体积的氯仿：异戊醇抽提；

13)用2.5倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀2～3小时；

14)用70％乙醇洗涤沉淀，干燥；

15)将RNA溶于DEPC处理的水中备用。

2、第一链cNDA的合成：用东洋纺公司的ReverTra Ace-α-反转录酶试剂盒，按试剂盒说明书进行操作：反应体系：

RNA(1-5μg)                                 11.0μl

RNase Inhibitor(10U/μl)                    1.0μl

5×RT buffer                                4.0μl

dNTP Mixture(10mmol/L each)                 2.0μl

AMV Oligo(10pmol/μl)                       1.0μl

ReverTra Ace                                1.0μl

total                                       20.0μl

反应条件：42℃，20min；99℃，5min；4℃，5min；瞬间离心，-20℃保存。

3、设计引物进行3’RACE和5’RACE

用于3′RACE引物：

3’Primer：5‘GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3’

3’Nested Primer：5‘CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3’

3’RACE fp1：5′-CCTCCTTTTGTACCACCACCGCC-3′

3’RACE fp2：5′-CGCCAATTTCTTCTCCAAGTGGG-3′

用于5’RACE的特异引物：

5’Primer：5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′

5’Nested Primer：5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′

5’RACE rp1：5′-GTCCAAGATGAACTTCTGGGTCCTC-3′

5’RACE rp2：5′-AATTCTTGAGGTTTCCGCCGACGCC-3′

将扩增出的DNA片段用1％的琼脂糖胶分离、回收并连接到pMD18-T easy Vector，转化E.coli DH5α，酶切鉴定正确后送华大基因测序，利用生物软件Vector9.0、Conting对获得的序列进行拼接，获得基因的全长cDNA序列，为序列表中SEQ IDNO：2，根据BLAST的分析结果，因为与拟南芥的SERK1基因相似性最高，因此命名为GHSERK1。(图6为GhSERK1基因全长cDNA结构，其中5’UTR为424bp，开放读码框(CDS)为1884bp，3’UTR为194bp；)

根据获得的序列设计引物扩增其开放读码框cDNA序列，3′端引物为fp2，5′端引物为rp2，为方便鉴定，在其5′端引物加入HindIII酶切位点，在其3′端引物加入SalI酶切位点：

rp2：5′-CGCAAGCTTATGGAAGGAAGCAAAAAGG-3′

fp2：5′-CGCGTCGACCCTTGGACCGGATAACTCAAC-3′

PCR反应体系：

cDNA                           1.0μl

反应buffer(10X)                5.0μl

dNTP(2.5mmol/L each)           4.0μl

fp2(10μM)                     1.0μl

rp2(10μM)                     1.0μl

Taq酶(2.5U/μl)                1.25μl

ddH ₂ O                          36.75μl

total                          50.0μl

反应条件：95℃，5min；95℃，30秒；55℃，45秒；72℃，2min30s；35个循环；72℃，5min；4℃，pause。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为marker，泳道1为GhSERK1RT-PCR产物得到分子量约为1.8kb的条带)，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收该片段，然后将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega公司)载体进行连接。

连接体系：

PCR回收产物                    3.0μl

pMD18-T                        1.0μl

T4DNA Ligase                   1.0μl

反应buffer(10X)                1.0μl

ddH ₂ O                          4.0μl

total                          10.0μl

16℃保温过夜。

用上述连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态。将重组体系加入感受态细胞溶液中，轻轻混匀，置冰上30分钟。在42℃下热激处理90秒，立即置冰上，冰浴2分钟。加入500μl LB液体培养基，37℃摇床180rpm，培养45分钟，然后涂布在有氨苄青霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，倒置培养37℃过夜，筛选阳性克隆，得到重组质粒命名为pGEMTGS1CDS(CGMCC No：3878)。以该载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。最后获得GhSERK1基因的开放读码框序列，为序列表中SEQ ID NO：3，根据开放读码框序列推测出其蛋白序列为序列表中SEQ ID NO：4。(图7：为根据GhSERK1基因的氨基酸序列预测的跨膜结构域，其中胞外结构域：1-241位氨基酸；跨膜结构域：242-264位氨基酸；胞内结构域：265-627位氨基酸；图8为GhSERK1蛋白结构域示意图，其中外显子1编码信号肽(signal peptide，SP)；外显子2编码亮氨酸拉链结构(leu zipper，ZIP)；外显子3～6编码5个富亮氨酸重复序列(leu-rich repeat，LRR)，其中除外显子4编码LRR2和LRR3外，其他每一个外显子编码一个LRR；外显子7编码含SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富脯氨酸结构域；外显子8编码跨膜结构域(transmembrane region，TM)；外显子9～11编码胞内激酶活性结构域。)

实施例2GhSERK1基因在棉花中的表达特性分析

1，模板制备：采用改良的热硼酸法(上文已述)，从棉花两个雄性可育系(Y18与P30B)和一个雄性不育系(P30A)的与生殖发育相关的组织：花蕾(6个发育时期：2-day-old，5-day-old，7-day-old，11-day-old，14-day-old，18-day-old，以直径3mm的花蕾作为现蕾第一天)，花萼，花瓣，花药，胚珠中提取总RNA，其中与可育系Y18与P30B相比，雄性不育系P30A的表型雌蕊正常发育，而花粉完全败育。提取的RNA质量由OD₂₆₀/OD₂₈₀比值和0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以其为模板按下列方案进行逆转录反应：在一个PCR小管中加入2μg总RNA和1μL Oligo(dT)₁₀，65℃温育10min，然后迅速置于冰上2min，再加入5×MMLV(RNase H free)Buffter 5μL，dNTP(25mmol/L)5μL，Ribonuclease Inhibitor 20U，MMLV 200U，最后用Nuclease free水补充至总体积25μL，42℃温育90min，72℃10min，95℃水浴5min灭活MMLV，得到的cDNA-20℃保存备用。

2，模板cDNA的相对定量及内标引物的设计：根据棉花延伸因子基因EF1α的序列信息，内参引物设计如下：

GhEF1αfp：5′-GCGATCTGGTAAGGAGCTTG 3′

GhEF1αrp：5′-GGAGAAGGTTTCCACAACC-3′

以棉花cDNA做模板，用该引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，GhEF1αfp 1μl，GhEF1αrp 1μl，Taq 1U，ddH₂O 8μl。

PCR条件：94℃，2min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，30Sec；30cycle；72℃，10min。

根据PCR产物的电泳结果对模板cDNA进行稀释，调整模板cDNA的用量，直到GhEF1αfp和GhEF1αrp引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。

3)荧光定量PCR分析

根据内参基因EF1α所设计的引物GhEF1αfp和GhEF1αrp，以及GhSERK1基因的特异引物

SP1：5′-GTTGGCCGAGAGATGGGATG-3′

SP2：5′-ATGCGGACTGGGCTTACAGG 3′

以棉花两可育系(Y18与P30B)和一个不育系(P30A)上述与生殖发育相关的组织cDNA为模板PCR扩增，每个样品设置3次重复。实时定量PCR扩增体系反应体系如下：cDNA模板0.2μL、10μL 2×SYBR Green I MIX、10μmol L^-1正向引物0.4μL、10μmol L^-1反向引物0.4μL，加水到总体积20μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，44个循环；72℃5min，4℃保存。SYBR Green I染料购买于Toyobo公司，实时荧光定量PCR仪选用MJ公司的PTC-200，BIO-RAD公司的chromo4软件收集数据。参考Jiang等(2007年)所描述的方法用2^-ΔΔCT法处理GhPG2基因在各个组织之间相对表达的CT值。(图9中，FB：Flower Bub(花蕾)；Sepals(花萼)；Petal(花瓣)；Anther(花药)；Ovule(胚珠))3，结合棉花发育特点，荧光定量结果表明：

1)在花蕾发育的前三个时期，P30A的花萼与花瓣原基正常分化，此时P30A中GhSERK1基因表达与可育系相同，呈递增趋势；

2)在花蕾发育的第四期至第五期，此时正值棉花雄蕊分化与发育。根据细胞学形态观察，P30A雄蕊中绒毡层发育异常，而此时GhSERK1基因表达下降；

3)到第六期，花蕾已进入雌蕊分化与发育阶段，此时GhSERK1基因表达上升。

4)P30A成熟花药中GhSERK1基因的表达明显低于P30B。其成熟花萼，花瓣和胚珠与P30B的相近。

结论：GhSERK1与棉花的生殖发育相关，而且可能参与花粉的绒毡层发育。

实施例3、棉花GhSERK1植物表达载体的构建

利用Invitrogen公司的GATEWAY***构建植物表达载体，选择GhSERK1中两个cDNA片段，它们分别为序列表中SEQ IDNO：5、6。分别命名为1683和7016，其中片段1683和7016是SERK基因保守结构域的两个部分。将它们分别与pMD18-T连接，命名为pMDGS11683与pMDGS17016，分别与入门载体pDONR211进行BP重组反应，将它们重组到pDONR211上。

BP重组体系：

pMDGS11683orpMDGS17016                 1.0μl

(50～100ng)

pDONOR221(30～50ng)                    0.5μl

BP enzyme Mix                         1.0μl

ddH2O                                 2.5μl

total                                 5.0μl

25℃保温1小时，加1μl Proteinase K，37℃，10min终止反应。

将重组产物转化大肠杆菌TOP10感受态，经卡那筛选得到阳性克隆，将重组子命名为pDONR211-1683与pDONR211-7016。

提取阳性克隆质粒pDONR211-1683与pDONR211-7016(统称pDONOR221-GhSERK)，利用LR重组反应将它们分别重组到植物表达载体pK7GWIWG2(I)上。

LR重组体系：

pDONOR221-GhSERK质粒(50～100ng)       1.0μl

pK7GWIWG2(I)(30～50ng)                0.5μl

LR enzyme Mix                         0.5μl

ddH ₂ O                                 0.5μl

total                                 2.5μl

25℃保温1小时，加1μl Proteinase K，37℃，10min终止反应。

用上述重组体系转化大肠杆菌TOP10感受态，经壮观霉素筛选得到阳性克隆，将重组子命名为pK7GGS11683(CGMCC No：3879)与pK7GGS17016。(图10Entry Clone(入门载体)：pDONR211-1683，pDONR211-7016；Destination Vector(表达载体)：pK7GWIWG2(I)；Gene：GhSERK1中两个cDNA片段，分别命名为1683和7016；Binary Vector(双元载体)：pK7GGS11683，pK7GGS17016。)

实施例4、棉花GhSERK1转基因棉花的筛选与获得

1、棉花GhSERK1植物表达载体转化棉花

用gene pulser Xcell电转仪(美国Bio Rad公司)并参照说明书进行操作，将质粒pK7GGS11683与pK7GGS17016用电击转化法转化农杆菌LBA4404，经含利福平和壮观霉素的抗性平板进行筛选得到农杆菌阳性克隆，再利用喷施农杆菌法，在上述阳性克隆农杆菌的介导下将pK7GGS11683与pK7GGS17016转化棉花。

2、抗性筛选转基因植株

喷施农杆菌法转化后收到的种子，播种于大田中，培养到幼苗长出8-10片真叶且较粗壮时喷施卡那霉素，可发生显色反应的为阳性植株。同时剪取叶片，提基因组DNA鉴定是否为转基因株系，鉴定正确的转基因株系记为T1代转基因材料。

3、转基因棉花的PCR鉴定

1)棉花基因组DNA的提取

上文已详述。

2)转基因植株的PCR鉴定

以步骤1基因组DNA为模板，

上游引物

1683-sp：5’-GAATGCTGGAAGGTGATGGG-3’；

7016-sp：5’-TTGCGTTGGGATCTGCTAGG-3’；

下游引物：5’-CCATAGGGGTTTAGATGCAACTG-3’；

用PCR的方法对转基因植株进行鉴定，其中上游引物根据所选择的棉花SERK1 cDNA片段序列设计，下游引物根据植物表达载体pK7GWIWG2(I)载体序列设计。

PCR反应体系：

基因组DNA                             1.0μl

反应buffer(10X)                       2.0μl

dNTP(2.5mmol/L each)                  1.6μl

上游引物(10μM)                       0.5μl

下游引物(10μM)            0.5μl

Taq酶(2.5U/μl)            0.5μl

dd H ₂ O                     13.9μl

total                      20.0μl

反应条件：95℃，5min；95℃，30秒；58℃，45秒；72℃，2min30s；35个循环；72℃，5min；4℃，pause。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11，12所示(图11：泳道1-9为转质粒pK7GGS17016的株系，10为阳性质粒pK7GGS17016，11为野生型，M为marker；图12：泳道1-8为转pK7GGS11683的株系，9为阳性质粒pK7GGS11683，M为Marker，10为野生型植株，11为无模板对照)所有转基因株系的扩增条带与阳性质粒扩增条带大小一致，与预期大小相符，而野生型则没有扩增条带，表明目的基因成功转入棉花中。

4、转表达载体pK7GGS11683与pK7GGS17016棉花的花器官表型

分别含有干扰载体pK7GGS11683与pK7GGS17016的转基因棉花花器官的表型为：雌蕊发育正常，但雄蕊中无花粉粒，即出现雄性完全败育的现象(图13：左面为野生型的花器官，右面为转表达载体pK7GGS11683棉花的花器官；图14：左面为野生型的花器官，右面为转表达载体pK7GGS17016棉花的花器官)。

结合实施例2的结果，说明：GhSERK1基因与棉花生殖发育相关，而且在雄蕊发育中起重要作用。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>GhSERK1基因的全长基因组序列(包括预测的启动子序列)

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>6920

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

atataaaaat ttatttttcc cttttctctc tcaaaatcac tccatcactt gacttacaaa    60

gagaaagttt tgagaaacgc aaaaaggaaa gttcatttct tttttatttt gttttttaaa    120

acttgctaaa agaaagggtt taaaaaaaag agtaattttt ggcttggttt ttttctgttc    180

tttttctttg tatatatgtt tttgttggct gccttttttg ggcgtgcttt tgaatggagg    240

ggagtgggat caaagggaag gatttgattg aggagatttt tgggcggtaa tggtgggatt    300

tgagagctag ggtttttggt tttttggttt tttgctgtaa tgttgtgctg ttggggtttc    360

tgtattgttt ggatctaagg atatttagat tgagagctta aaaaaattta aattaaaaag    420

ttgcagcttt tagtttcccc tttcttttgt caaatggaag gaagcaaaaa ggttaaatct    480

ttggttttgg tttgtttgat ctcggtgcta ctgcatccat tctggcttat ttctgctaat    540

gtggaaggtg aacatgtctt actttttttt tctctaccgg caactccttt ttgttatttg    600

cattcaatta tttttggagt ttgatccctg atatttgtaa cttcgctgaa tggggctttt    660

gatatttctt cttataattt ggttttgagt ttgaaaatgt gtgtgcttta tacttgttta    720

ctgatggttg gaagtttcat tttttgtgtg ttctgctttt gggagattac tctagaagtg    780

tttaatttga ttgtacggat tctgatcctt gttgtcaatc aaatgttagt attatgcaat    840

atggttgtac aatttgtgac ttttgttata ttgggtatct tagaacatgt ctcagaaaaa    900

tgctttttct agaatggctt tgtaataatt tcagattgtg acattttatt gttcacagta    960

gttgcgtact ttagacatta aatgttggtg atactgtaga agtcatggct tcatcgcaca    1020

attgaaattg tttttcacac cccttgctgg tttgatagca gatctattat gctcatgagg    1080

tcattaaact cgcgctgttt aatattaaag aattttgtat tgcttctttt ctgttggtta    1140

actactggtt caatgtatgt tatagttaca tttgacttcc agaactgcaa aatttagaag    1200

attttgttgc tgtaactgtt gaagtatgat agtactgttt caaactgttt aagcttcttc    1260

aagtagctgc tttctgcttg ttgatagacg ttctaatgct ttgtgagtgt tgatgaatat    1320

gctttctaga tatagttcgg tagcaggttg gctgtgctat atatttttaa catttgcatt    1380

gttttttagt gctattctct tacaatcttt acttgcttct tgaaacaggt gatgcattgc    1440

acagcctaag gaccaacttg aatgatccta acaatgtacc gcagagttgg gatcctaccc    1500

ttgttaaccc ctgcacatgg gttccacgtt acatgtaaca atgataatag tgttattaga    1560

gtgtaaggtt ttttgctctt tgatgttttc tgagtacatg gttgcaactt aagaaaattg    1620

tgctttactg aattcgcgaa gggttacttg tgtaatgtct acccctgcat caatttttca    1680

gtgatcttgg aaatgcagct ttatctggtc agcttgtacc gcagcgtggc ttgcttaaga    1740

atttgcagta cttgtaagtc atgcttcacc ttaataattc tagctgattg atgtgattgt    1800

gtccgagtaa aataggccat tgcggacatt ctttatattt gtaacaggag gaaatatttc    1860

acgacaatta tttttgcatt aactaagctt ctttagccgc atggccagtg ggaagtagtt    1920

gagggtccca cgtacttcat tattttttat caaactttta catactcaat tcatagttct    1980

gagaaaaggc aaacctgtaa ttcttctctt catggttcag tggcagtctt tgccagtgga    2040

ataaagagta tcaaatgtaa aaaaaaaaaa aaaaaaattc tgttggcagt ctggctgctg    2100

aaatccatct atgaataact gtaataagga cctatttctt tcatatagtg ttggtcatgt    2160

tggccacgtc tagattgagg caccattttt taatgaacta aaatatctcc tctcctgtta    2220

gaatctgatt gctatgatct tcatgtttat ggtatggtaa agttttttaa gatgctttct    2280

taaacaaggg tttacttcta tatggaccat catctaggaa taaatatatg tttactagga    2340

tcaggaaaca catgttacta actgcaacca tcccttctct aaatgtgtgg tccatgttac    2400

gagatcctag agatgaagat gcatgaagga attaataagc attatggagc tgccatacat    2460

tcattctttc ataactagtc cttgagctgg tctttcagga ctttgtggga ggatggatgg    2520

tactatatat tctattgtat ttcttccttt tacttatggt ttgtttccct tgaacatgac    2580

aagaggacat ctttttccca ttatatgatg gcttacggga cagttctttt agacattgcg    2640

aacaatataa taacccaaaa cttttttttt gagggtatta taacccaaaa cttagtattc    2700

agttgctagt gcacagtttg cttgccttag tatttcatta ctattatgcc ttttgagacc    2760

tatcttttta tgccagggaa ctttacagta ataacataag tggaccaatt cctagtgatc    2820

ttgggaatct gactagcttg gtgagcttgg atctctattt gaatagtttc agtggtccta    2880

ttcctgaatc tttggggagg ctgtcgaaat tgcgattcct gtgagtatat ttgttttgaa    2940

gctatccctg cccccctctt tatttttgtt tattacatgt tgagttgcat gtaatgctga    3000

gatctaagtc attacttttg gaatcatgtt attggtaaaa cagaagtata cttgatttga    3060

agttaacaaa gaaacagaaa taagttattt attaaccagt atttgtttta ttaagataaa    3120

atcaagtata agacatttcc ccacccccac cccaccccac ctcattccac ccacagatac    3180

acaagctttc aacgtcatct tcagtatcag aaagaatact ttcactaagt atacaccatt    3240

agcatatgca agttcacagc attgaatttc ttcatcaact acaactgtct ggtaaaattt    3300

tttatgcaag ttgtttggtt gattttttgt ttactaaaaa actccaggaa tgattgaaac    3360

tttgacattt aaaagctaaa taaaatttaa atggtttact cccaccagta aacatgagta    3420

agctggttct gcattggtag atgtcattca ctcactcaca tcaaccagga ggatattgat    3480

tgggcatgaa ccttaagaca aagagctttt ctaagtctga ttgtttatgg ctgttgtagg    3540

ttaaagtttg cttgatataa aatctcttga ttcatttaga tcttgaactt ctaatgtttt    3600

gaaacttgtg cgaggatagc cggctcaaca acaacacctt gatgggtcct atccctatgt    3660

cattaacgaa tatcacatca cttcaagtcc tgtgagtgcc aaacttatcg tctcatttca    3720

agatctatca ctcttttccc ttttctgaga tatgattata tatccttaaa ttgcactgtg    3780

taatgtaggg atctatcaaa taaccatctt tctggggagg ttccagataa tggctccttc    3840

tcactattca ctcctatcag gttagttttc tgcaatctgc aatctgcttt tcctgcctga    3900

caattttggg tgccttaggt ggttgttgtt cctcatgcag ttttgctaac aacttagatc    3960

tatgtggccc ggttactgga cgcccatgcc ccggatctcc tcctttctct cctcctcctc    4020

cttttgtacc accaccgcca atttcttctc caagtaatat tcttttgatg tcttgtattt    4080

cagatctatt gagttgcctt tacagtatct atgtgcagta attttgctac tcttgctgtc    4140

gattagactg ttttagttta atttaacatt gtataatatg ccaaacttat cattttaacc    4200

ccctacattc tggaaattgt ggcatgcata aatcatcagt taacaaaagt gatgcctctg    4260

cccttttccc tgggtgagtc tcatctcagt ttgcacatcc agtcctttag ttctgtaact    4320

tcaaaagaac tgtattattg tgaacattga ttgtggtgag atgtaattaa caatagtgcc    4380

ttctagtgaa gggttgtgtt tgtaagtttc gtatgatgtg atgcattatc tcagttctag    4440

tgcagaagaa gtggctgcta tgttttgcat tggatgttct aaattctgat cttatcacat    4500

tctaggtggg aatagtgtca ctggtgcaat agctggagga gttgcagcag gtgctgcctt    4560

actgtttgct gctcctgcaa ttgcatttgc gtggtggcgt cggcggaaac ctcaagaatt    4620

tttctttgat gtacctggtt agtgccataa atgaaaaatt actgggttgg agggttcaag    4680

atttggtgac agttacaata ttcttctgtt tcratatttt tgcagcggaa gaggacccag    4740

aagttcatct tggacagctg aagaggtttt cattacgaga actacaagtt gccactgaca    4800

gttttagcca taaaaatatt ctgggtagag gtggatttgg taaggtttac aaaggaaggt    4860

tagctgacgg ttcactggtg gctgttaaaa gattgaaaga agagcgtaca cctggtgggg    4920

agttacagtt tcaaacagag gtagagatga tcagcatggc tgttcatcga aatctcctca    4980

ggctgcgtgg gttttgtatg acaccgactg agcgattgct tgtttacccc tacatggcta    5040

atggaagtgt tgcatcatgt ctcagaggta aagcggacaa gcatttatgg ttgaattccc    5100

ctgcgtgggt ggagtttcat aacttccatt tgttgaaatt gcaaccaatt gacttttaat    5160

cagtgaacat ttagccttgc tttccatctg gattacattt tcttgttttc ttgcattctt    5220

atagaacgcc ctccgtcaca acctccactt gattggccaa cacggaagag aattgcgttg    5280

ggatctgcta ggggtctttc ttatttgcat gatcactgtg acccaaagat cattcatcgt    5340

gatgtaaaag ctgcaaacat tttgttggat gaggaatttg aagctgttgt tggtgacttt    5400

gggttggcta aacttatgga ctacaaggat acccatgtaa cractgctgt acgtggcaca    5460

attggacata ttgctcctga gtatctctct actggaaaat cttcagagaa aactgatgtt    5520

tttgggtatg gtatcatgct tttggagctt ataactggac agcgggcctt tgatcttgct    5580

cgtcttgcaa atgatgatga tgtcatgttg cttgattggg tatgcatatg ttcttttttt    5640

tttttttttc ggatatctta gtcttcactt aattgatttg cttactactg gattgcttcc    5700

taratggctg cctgattctc attattacta aacacccttt taataaattt gcttactact    5760

ctattctcgg ttctctcatc ttaaatgcta atccacccac agatcaattg ctttcttgat    5820

aactgtcatt agttatgatg ccatgtagtg acataaaaga aactaggttg tatcctatag    5880

aaattaatct cagaaagaga tgagaaagca atgggagctt tatgttgctt gtgttacaat    5940

gcaccagcta tggaaaggaa gtgaagttgc taaggatggc aagaactagt tctacctata    6000

gatgccaaaa tgaagtgttg attttggaga aataatgcaa ttagtggtct gtttcacatt    6060

ggctgagtca gtttgtcctt tttctctttt ccaggtcaaa ggacttctga aggagaagaa    6120

gctggaattg ctagttgatc ctgatctgca aaccaattat gtagaaactg aggtagagca    6180

gttaatccag gttgctctgc tatgcacaca aggttcccca atggaccggc caaagatgtc    6240

agaagtggtt agaatgctgg aaaggtgatg ggtttggccg agagatggga tgagtggcag    6300

aaagttgaag ttcracggca gaggttgaac ttgcccctca tcctaattct gatggattgt    6360

gactcaactg acatctgcat gctgtgagta tccgtccaag tgactacgca taattacagt    6420

aaaggaaagt ttttactagt tattttttaa ggtaactttt ttttttgtta atttgatgac    6480

catatcctga tttatgtctc ctcctgtaag cccagtccgc attgtattca ttacattttg    6540

tgcatgttta tgtgagtcag cttcgttgag gtgcaatttg tgttgtatct ttcccctgca    6600

gtttgattga gccatgatgc ttacatgtag ctccagccgt ggcaatcagt ataaccccta    6660

tgcgcacttg atcttctcct agtttaattc ttcttatacg gtttgtgaaa catgccaaat    6720

gccgtgcatg gaatttttct aggggatttt taatcttttg aatggcagta caagtttata    6780

gcttccacgt tttaaacttg tgcactcttc tgaaatcaca agggctttcc tttcgtactt    6840

agttgacatg cgttaattca aaagtcccga acagcaaaat tcagtgttta ttcttttttc    6900

cccattattt tcctcctaaa                                                6920

<120>GhSERKI基因的全长cDNA序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>2

<211>2502

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

gaaaaaaatc actccatcac ttgacttaca aagagaaagt tttgagaaac gcaaaaagga    60

aagttcattt cttttttatt ttgtttttta aaacttgcta aaagaaaggg tttaaaaaaa    120

gagtaatttt tggcttggtt tttttctgtt ctttttcttt gtatatatgt ttttgttggc    180

tgcctttttt gggcgtgctt ttgaatggag gggagtggga tcaaagggaa ggatttgatt    240

gaggagattt ttgggcggta atggtgggat ttgagagcta gggtttttgg ttttttggtt    300

ttttgctgta atgttgtgct gttggggttt ctgtattgtt tggatctaag gatatttaga    360

ttgagagctt aaaaaaattt aaattaaaaa gttgcagctt ttagtttccc ctttcttttg    420

tcaaatggaa ggaagcaaaa aggttaaatc tttggttttg gtttgtttga tctcggtgct    480

actgcatcca ttctggctta tttctgctaa tgtggaaggt gatgcattgc acagcctaag    540

gaccaacttg aatgatccta acaatgtact gcagagttgg gatcctaccc ttgttaaccc    600

ctgcacatgg tttcacgtta catgtaacaa tgataatagt gttattagag ttgatcttgg    660

aaatgcagct ttatctggtc agcttgtacc gcagcttggc ttgcttaaga atttgcagta    720

cttggaactt tacagtaata acataagtgg accaattcct agtgatcttg ggaatctgac    780

tagcttggtg agcttggatc tctatttgaa tagtttcagt ggtcctattc ctgaatcttt    840

ggggaggctg tcgaaattgc gattcctccg gctcaacaac aacaccttga tgggtcctat    900

ccctatgtca ttaacgaata tcacatcact tcaagtcctg gatctatcaa ataaccatct    960

ttctggggag gttccagata atggctcctt ctcactattc actcctatca gttttgctaa    1020

caacttagat ctatgtggcc cggttactgg acgcccatgc cccggatctc ctcctttctc    1080

tcctcctcct cctttcgtac caccaccgcc aatttcttct ccaagtggga atagtgtcac    1140

tggtgcaata gctggaggag ttgcagcagg tgctgcctta ctgtttgctg ctcctgcaat    1200

tgcatttgcg tggtggcgtc ggcggaaacc tcaagaattt ttcttggatg tacctgcgga    1260

agaggaccca gaagttcatc ttggacagct gaagaggttt tcattacgag aactacaagt    1320

tgccactgac agttttagcc ataaaaatat tctgggtaga ggtggatttg gtaaggttta    1380

caaaggaagg ttagctgacg gttcactggt ggctgttaaa agattgaaag aagagcgtac    1440

acctggtggg gagttacagt ttcaaacaga ggtagagatg atcagcatgg ctgttcatcg    1500

aaatctcctc aggctgcgtg ggttttgtat gacaccgact gagcgattgc ttgtttaccc    1560

ctacatggct aatggaagtg ttgcatcatg tctcagagaa cgccctccgt cacaacctcc    1620

acttgattgg ccaacacgga agagaattgc attgggatct gctaggggtc tttcttattt    1680

gcatgatcac tgtgacccaa agatcattca tcgtgatgta aaagctgcaa acattttgtt    1740

ggatgaggag tttgaagctg ttgttggtga ctttgggttg gctaaactta tggactacaa    1800

ggatacccat gtaactactg ctgtacgtgg cacaattgga catattgctc ctgagtatct    1860

ctctactgga aaatcttcag agaaaactga tgtttttggg tatggtatca tgcttttgga    1920

gcttataact ggacagcggg cctttgatct tgctcgtctt gcaaatgatg atgatgtcat    1980

gttgcttgat tgggtcaaag gacttctgaa ggagaagaag ctggaattgc tagttgatcc    2040

tgatctgcaa accaattatg tagaaactga ggtagagcag ttaatccagg ttgctctgct    2100

atgcacacaa ggttccccaa tggaccggcc aaagatgtcg gaagtggtta gaatgctgga    2160

aggtgatggg ttggccgaga gatgggatga gtggcagaaa gttgaagttc tacggcagga    2220

ggttgaactt gcccctcatc ctaattctga ttggatcgtg gactcaactg acaatctgca    2280

tgctgttgag ttatccggtc caaggtgact acggcataat tacagtaaag gaaagttttt    2340

actagttatt ttttaagatt aacttctttt ttttttgtta atttgatgac catatcctga    2400

tttatgtctc ctcctgtaag cccagtccgc attgtattca ttacattttg tgcatgttta    2460

tgtgagtcag cttcgttgag gtgcaaaaaa aaaaaaaaaa aa                       2502

 

<120>GhSERK1基因的氨基酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>3

<211>627

<212>Protein

<213>G.hirsutum

<400>1

Met Glu Gly Ser Lys Lys Val Lys Ser Leu Val Leu Val Cys Leu 15

Ile Ser Val Leu Leu His Pro Phe Trp Leu Ile Ser Ala Asn Val 30

Glu Gly Asp Ala Leu His Ser Leu Arg Thr Asn Leu Asn Asp Pro 45

Asn Asn Val Leu Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys 60

Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn Asn Asp Asn Ser Val Ile Arg 75

Val Asp Leu Gly Asn Ala Ala Leu Ser Gly Gln Leu Val Pro Gln 90

Leu Gly Leu Leu Lys Asn Leu Gln Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Asn 105

Asn Ile Ser Gly Pro Ile Pro Ser Asp Leu Gly Asn Leu Thr Ser 120

Leu Val Ser Leu Asp Leu Tyr Leu Ash Ser Phe Ser Gly Pro lle 135

Pro Glu Ser Leu Gly Arg Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Arg Leu 150

Ash Asn Asn Thr Leu Met Gly Pro Ile Pro Met Ser Leu Thr Asn 165

Ile Thr Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Asn Asn His Leu Ser 180

Gly Glu Val Pro Asp Asn Gly Ser Phe Ser Leu Phe Thr Pro lle 195

Ser Phe Ala Ash Ash Leu Asp Leu Cys Gly Pro Val Thr Gly Arg Pro 210

Cys Pro Gly Ser Pro Pro Phe Ser Pro Pro Pro Pro Phe Val Pro Pro 225

Pro Pro Ile Ser Ser Pro Ser Gly Asn Ser Val Thr Gly Ala Ile 240

Ala Gly Gly Val Ala Ala Gly Ala Ala Leu Leu Phe Ala Ala Pro 255

Ala Ile Ala Phe Ala Trp Trp Arg Arg Arg Lys Pro Gln Glu Phe 270

Phe Leu Asp Val Pro Ala Glu Glu Asp Pro Glu Val His Leu Gly 285

Gln Leu Lys Arg Phe Ser Leu Arg Glu Leu Gln Val Ala Thr Asp 300

Ser Phe Ser His Lys Asn Ile Leu Gly Arg Gly Gly Phe Gly Lys 315

Val Tyr Lys Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val Ala Val Lys 330

Arg Leu Lys Glu Glu Arg Thr Pro Gly Gly Glu Leu Gln Phe Gln 345

Thr Glu Val Glu Met Ile Ser Met Ala Val His Arg Asn Leu Leu 360

Arg Leu Arg Gly Phe Cys Met Thr Pro Thr Glu Arg Leu Leu Val 375

Tyr Pro Tyr Met Ala Asn Gly Ser Val Ala Set Cys Leu Arg Glu 390

Arg Pro Pro Ser Gln Pro Pro Leu Asp Trp Pro Thr Arg Lys Arg 405

Ile Ala Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Asp His 420

Cys Asp Pro Lys Ile Ile His Arg Asp Val Lys Ala Ala Asn Ile 435

Leu Leu Asp Glu Glu Phe Glu Ala Val Val Gly Asp Phe Gly Leu 450

Ala Lys Leu Met Asp Tyr Lys Asp Thr His Val Thr Thr Ala Val 465

Arg Gly Thr Ile Gly His Ile Ala Pro Glu Tyr Leu Ser Thr Gly 480

Lys Ser Ser Glu Lys Thr Asp Val Phe Gly Tyr Gly Ile Met Leu 495

Leu Glu Leu Ile Thr Gly Gln Arg Ala Phe Asp Leu Ala Arg Leu 510

Ala Asn Asp Asp Asp Val Met Leu Leu Asp Trp Val Lys Gly Leu 525

Leu Lys Glu Lys Lys Leu Glu Leu Leu Val Asp Pro Asp Leu Gln 540

Thr Asn Tyr Val Glu Thr Glu Val Glu Gln Leu Ile Gln Val Ala 555

Leu Leu Cys Thr Gln Gly Ser Pro Met Asp Arg Pro Lys Met Ser 570

Glu Val Val Arg Met Leu Glu Gly Asp Gly Leu Ala Glu Arg Trp 585

Asp Glu Trp Gln Lys Val Glu Val Leu Arg Gln Glu Val Glu Leu 600

Ala Pro His Pro Asn Ser Asp Trp Ile Val Asp Ser Thr Asp Ash 615

Leu His Ala Val Glu Leu Ser Gly Pro Arg                     627

 

<120>GhSERK1基因开放读码框对应的cDNA序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>4

<211>1884

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

atggaaggaa gcaaaaaggt taaatctttg gttttggttt gtttgatctc ggtgctactg    60

catccattct ggcttatttc tgctaatgtg gaaggtgatg cattgcacag cctaaggacc    120

aacttgaatg atcctaacaa tgtactgcag agttgggatc ctacccttgt taacccctgc    180

acatggtttc acgttacatg taacaatgat aatagtgtta ttagagttga tcttggaaat    240

gcagctttat ctggtcagct tgtaccgcag cttggcttgc ttaagaattt gcagtacttg    300

gaactttaca gtaataacat aagtggacca attcctagtg atcttgggaa tctgactagc    360

ttggtgagct tggatctcta tttgaatagt ttcagtggtc ctattcctga atctttgggg    420

aggctgtcga aattgcgatt cctccggctc aacaacaaca ccttgatggg tcctatccct    480

atgtcattaa cgaatatcac atcacttcaa gtcctggatc tatcaaataa ccatctttct    540

ggggaggttc cagataatgg ctccttctca ctattcactc ctatcagttt tgctaacaac    600

ttagatctat gtggcccggt tactggacgc ccatgccccg gatctcctcc tttctctcct    660

cctcctcctt tcgtaccacc accgccaatt tcttctccaa gtgggaatag tgtcactggt    720

gcaatagctg gaggagttgc agcaggtgct gccttactgt ttgctgctcc tgcaattgca    780

tttgcgtggt ggcgtcggcg gaaacctcaa gaatttttct tggatgtacc tgcggaagag    840

gacccagaag ttcatcttgg acagctgaag aggttttcat tacgagaact acaagttgcc    900

actgacagtt ttagccataa aaatattctg ggtagaggtg gatttggtaa ggtttacaaa    960

ggaaggttag ctgacggttc actggtggct gttaaaagat tgaaagaaga gcgtacacct    1020

ggtggggagt tacagtttca aacagaggta gagatgatca gcatggctgt tcatcgaaat    1080

ctcctcaggc tgcgtgggtt ttgtatgaca ccgactgagc gattgcttgt ttacccctac    1140

atggctaatg gaagtgttgc atcatgtctc agagaacgcc ctccgtcaca acctccactt    1200

gattggccaa cacggaagag aattgcattg ggatctgcta ggggtctttc ttatttgcat    1260

gatcactgtg acccaaagat cattcatcgt gatgtaaaag ctgcaaacat tttgttggat    1320

gaggagtttg aagctgttgt tggtgacttt gggttggcta aacttatgga ctacaaggat    1380

acccatgtaa ctactgctgt acgtggcaca attggacata ttgctcctga gtatctctct    1440

actggaaaat cttcagagaa aactgatgtt tttgggtatg gtatcatgct tttggagctt    1500

ataactggac agcgggcctt tgatcttgct cgtcttgcaa atgatgatga tgtcatgttg    1560

cttgattggg tcaaaggact tctgaaggag aagaagctgg aattgctagt tgatcctgat    1620

ctgcaaacca attatgtaga aactgaggta gagcagttaa tccaggttgc tctgctatgc    1680

acacaaggtt ccccaatgga ccggccaaag atgtcggaag tggttagaat gctggaaggt    1740

gatgggttgg ccgagagatg ggatgagtgg cagaaagttg aagttctacg gcaggaggtt    1800

gaacttgccc ctcatcctaa ttctgattgg atcgtggact caactgacaa tctgcatgct    1860

gttgagttat ccggtccaag gtga                                           1884

 

<120>GhSERK1其干扰载体pK7GGS11683上对应的cDNA碱基序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>5

<211>169

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

atgcagattg tcagttgagt ccacaatcca atcagaatta ggatgagggg caagttcaac    60

ctcctgccgt agaacttcaa ctttctgcca ctcatcccat ctctcggcca acccatcacc    120

ttccagcatt ctaaccactt ctgacatctt tggccggtcc attggggag                169

<120>GhSERK1其干扰载体pK7GGS17016上对应的cDNA碱基序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>6

<211>403

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaacacgga agagaattgc gttgggatct    60

gctaggggtc tttcttattt gcatgatcac tgtgacccaa agatcattca tcgtgatgta    120

aaagctgcaa acattttgtt ggatgaggaa tttgaagctg ttgttggtga ctttgggttg    180

gctaaactta tggactacaa ggatacccat gtaactactg ctgtacgtgg cacaattgga    240

catattgctc ctgagtatct ctctactgga aaatcttcag agaaaactga tgtttttggg    300

tatggtatca tgcttttgga gcttataact ggacagcggg cctttgatct tgctcgtctt    360

gcaaatgatg atggacccag ctttcttgta caaagtggtc ccc                      403

Claims (9)

1.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERK1，它的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。

2.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERK1，其基因组碱基序列如SEQ IDNO：1所示。

3.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERK1，其开放读码框(CDS)碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERK1，其干扰载体pK7GGS11683上含有的GhSERK1序列如SEQ ID NO：5所示。

5.根据权利要求2或3提供的核苷酸序列片段所构建的表达载体，其特征在于：含有任选权利要求2或3所述的其中之一核苷酸片段的表达载体。

6.根据权力要求5所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为植物表达载体pK7GGS11683(CGMCC No：3879)。

7.含有权利要求5、6所述表达载体的转基因细胞系。

8.一种培育转基因植株的方法，其特征在于：将权利要求5、6所述的植物表达载体导入植物细胞，获得的转基因植株。

9.根据权力要求8所述的方法，其特征在于：所述被转化的目的植物为单子叶植物或双子叶植物，如水稻、小麦、棉花、玉米、拟南芥、油菜或大豆等。

Images