CN101822838B

CN101822838B - 靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备和应用

Info

Publication number: CN101822838B
Application number: CN2009100964326A
Authority: CN
Inventors: 亓立峰
Original assignee: WUXI NAAO BIO-PHARM Co Ltd
Current assignee: Shanghai Nao Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2029-03-05
Also published as: CN101822838A

Abstract

本发明公开了一类基于核苷酸序列靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备方法与应用。本发明以疏水性纳米粒子为核心结构，采用质子海绵体聚合物包被制备水溶性纳米粒子，进而通过化学偶联和互补交联核苷酸序列构建靶向识别肿瘤细胞表面抗原的纳米药物载体材料***。该新型纳米载体材料粒径为5～100nm，能够应用于肿瘤细胞分离、肿瘤细胞抗原检测以及靶向传输抗肿瘤药物和基因转导等生物及医药领域。本发明根据国内外研究进展和自身研究基础，设计合成新型基于DNA/RNA序列靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料，在肿瘤组织生物医学成像、分子诊断和靶向药物治疗方面具有广泛应用前景。

Description

靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备和应用

(一)技术领域

本发明涉及一种基于RNA序列靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料，及其制备方法和应用。

(二)背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的特异性基因沉默现象。RNAi存在于多个生物种类，包括线虫、果蝇、植物、真菌、哺乳动物等。双链的dsRNA在DICER家族核酸酶作用下，产生21-25bp的siRNA(short interference RNA)。siRNA分子随后解链，以单链形式与其他核酸酶和相关蛋白蛋白分子形成RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导得沉默复合体)，进而诱导与单链siRNA序列互补的靶mRNA的降解，达到“基因沉默”的效果。RNAi在基因治疗领域具有广阔应用前景，但是当前限制其生物学活性和临床应用的瓶颈仍然是其缺乏体内有效细胞转导材料。目前处于临床研发阶段的载体材料主要以脂质体为主要成分，而其已经在动物实验中表现出的毒性和引发的免疫反应限制了其应用前景。纳米技术已快速进入药物制剂领域，纯药物纳米粒子(即裸体的纳米药物粒子)的制造技术在各类文献中已报道了十多种方法，但是，纯粹的药物纳米粒子(即裸体的纳米药物粒子)与现有的分子型药物相比，并没有十分明显的优越性，其主要缺陷有三点：一是纯药物纳米粒子进入机体后溶解速度仍然很快，缓释特性和靶向性不明显，药物在血管内冲击强度仍较大、消失快、药效短、不能平稳释放；二是由于纯药物纳米粒子在体内靶向性不明显，所以仍然对非治疗组织和器官产生较大的毒副作用；三是纯药物纳米粒子尚不能防止胃肠道内消化酶或消化液对药物的破坏失效和对胃肠道的刺激性。当前靶向制剂载体材料主要包括传统脂质体(细胞毒性大)、磁性微球、白蛋白和抗体制剂。多数仍然在临床前和临床期研究阶段。而且绝大多数用于负载化疗药物，如阿霉素、氟尿嘧啶等。药物毒性大是其最大弱点。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一类靶向识别肿瘤细胞纳米药物载体材料及其制备方法和应用。

本发明采用的技术方案是：

一种靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料，为疏水性纳米粒子表面包被两亲性聚合物PMAT得到的纳米颗粒，所述纳米颗粒表面还联接有靶向识别肿瘤细胞表面抗原的互补RNA或DNA核苷酸序列。

所述疏水性纳米粒子为本领域常规疏水性纳米粒子，优选为下列之一：量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸或脂质体。

所述纳米颗粒粒径为5～100nm，能够作为分子荧光探针、药物载体应用于生物医学成像、肿瘤分子诊断和基因治疗、靶向药物制剂等领域。

本发明还涉及制备所述的纳米药物载体材料的方法，所述方法包括：

(1)将疏水性纳米粒子溶解于有机溶剂中得到纳米粒子溶液，所述疏水性纳米粒子为下列之一：量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸或脂质体；量子点，又可称为纳米晶，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。(2)按照两亲性聚合物PMAT与纳米粒子物质按10～100mg∶1nmol的比例将两亲性聚合物PMAT加入纳米粒子溶液中，搅拌使聚合物完全溶解，蒸发有机溶剂，干燥得到固体颗粒；(3)将固体颗粒溶解于缓冲液中，通过化学偶联或互补交联反应联接可靶向识别肿瘤表面抗原的互补RNA或DNA核苷酸序列，分离纯化得到所述纳米药物载体材料。

步骤(1)所述有机溶剂为本领域常规可溶解疏水性纳米粒子的有机溶剂，本发明中优选为氯仿、乙醇或者己烷等有机溶剂。

具体的，所述方法如下：

(1)将所述疏水性纳米粒子溶解于所述有机溶剂中得到纳米粒子溶液；

(2)按照两亲性聚合物PMAT与纳米粒子为10～100mg∶1nmol的比例将两亲性聚合物PMAT加入纳米粒子溶液中，搅拌使聚合物完全溶解，真空干燥得到固体颗粒；

(3)将固体颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，离心纯化后，将固体颗粒重新分散于磷酸盐缓冲液中得到纳米颗粒溶液，以化学键偶联方法联接单链RNA序列1，除去未偶联的RNA序列，将纳米颗粒溶液加热至60～80℃，加入等量含有RNA序列1互补序列且能够靶向识别肿瘤细胞的单链或双链RNA序列2，冷却至室温，分离纯化得到所述纳米药物载体材料；所述RNA序列1长度为3～15个核苷酸、3’或5’短修饰有氨基或者羧基；所述RNA序列2长度为20～80个核苷酸、3’或5’短修饰有氨基或者羧基。

或者，所述方法如下：

(3)将固体颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，离心纯化后，将固体颗粒重新分散于磷酸盐缓冲液中得到纳米颗粒溶液，以化学键偶联方法联接特异识别肿瘤细胞的单链或双链DNA序列，分离纯化得到所述纳米药物载体材料；所述DNA序列长度为20～80个脱氧核苷酸、3’或5’端修饰有氨基或者羧基。

本发明还涉及所述纳米药物载体材料在制备靶向治疗药物中的应用。

具体的，所述的应用为：以所述纳米药物载体材料为载体，通过静电吸附或者共价偶联方法负载药物分子，制备所述靶向治疗药物。所述药物分子为DNA、siRNA、mRNA或者多肽分子等。

本发明原理如下：

首先，通过包含疏水性和亲水性化学基团的两亲性聚合物包被疏水性纳米粒子，使其成为亲水性纳米粒子。其中两亲性聚合物为本领域常规含有碳链、巯基等疏水性化学基团和羧基、羟基、氨基等亲水性基团的一类高分子聚合物材料。

其次，在形成的亲水性纳米粒子表面链接能够特异性识别肿瘤细胞表面抗原的RNA/DNA核苷酸序列。具体步骤包括：(1)化学键偶联方法链接由3～15个A、G、U、C、T组成的3’或者5’末端修饰有氨基、巯基或者羧基的单链核苷酸序列1；(2)通过互补交联方法链接末端包含与RNA/DNA核苷酸序列1互补序列的由20～80个A、G、U、C、T组成的5’或者3’末端修饰有氨基或者羧基的单链或者双链核苷酸序列。也可直接通过化学键偶联方法链接可靶向识别肿瘤细胞的RNA/DNA核苷酸序列。本发明关键是纳米药物载体材料的结构形式，对于不同的肿瘤细胞，如何选择能够特异性识别肿瘤细胞表面抗原的RNA/DNA核苷酸序列，对于本领域技术人员来说属于公知常识，并不是本发明所要保护的内容。

由上述方法合成的纳米药物靶向载体材料能够通过静电吸附或者共价偶联方法负载DNA、siRNA、mRNA、多肽或者其它药物分子，从而应用于生物医学成像、分子诊断、基因治疗和药物靶向制剂等领域。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明通过两亲性聚合物包被疏水性纳米粒子制备亲水性纳米粒子，使其具备吸附siRNA、DNA、mRNA、多肽及生物药物分子的表面化学结构，该纳米粒子表面结构由于两亲性聚合物具备结合质子的能力，在纳米粒子进入细胞内被细胞内涵体摄取后，由于细胞内涵体偏酸性环境，使纳米粒子表面聚合物质子化，导致内涵体外质子和氯离子进入内涵体，使内涵体内渗透压升高致使内涵体膜肿胀破裂，从而达到纳米粒子负载药物分子细胞质内有效释放。本发明所采用的两亲性聚合物能够实现纳米载药粒子从内涵体的脱离和药物细胞质内的有效释放，有利于细胞质内靶向药物及siRNA等分子实现药物活性的作用机制。

(2)本发明通过共价和互补偶联特异性识别肿瘤细胞表面抗原分子的DNA/RNA核苷酸序列，达到纳米粒子特异性结合肿瘤细胞、靶向药物传输至肿瘤细胞的功能，在肿瘤早期诊断、生物医学成像、以及靶向药物治疗方面具有广阔应用前景。

(四)附图说明

图1为本发明靶向纳米药物载体材料示意图。

图2为本发明靶向纳米药物载体材料透视电镜图。

图3为实施例1合成的量子点纳米材料加入乳腺癌细胞培养液后的显微镜成像，亮色环状部分为携带荧光染料的纳米粒子量子点，均匀分布于细胞内亮色部分为成功转染的siRNA。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

将1nmol量子点(发射波长620nm，Ocean Nanotech.，USA，或者按照现已经公开发表的方法自行制备)溶解于3mL氯仿中，加入50mg两亲性聚合物PMAT[poly(maleic anhydride alt-1-tetradecene)，452513，Sigma，USA]，搅拌均匀，待聚合物完全溶解后，真空干燥纳米粒子溶液。纳米粒子完全干燥后，溶解于pH8.5、0.01M磷酸盐缓冲溶液通过超速离心纯化后，将纳米粒子重新分散于前述磷酸盐缓冲溶液中。通过偶联活性剂乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)化学键偶联PMAT聚合物连接单链RNA核苷酸序列1(NH₂-GGGAAAGGG)，通过透析或者离心等方法去除未偶联的RNA序列，加入等量的含有RNA序列1互补序列并能够靶向识别肿瘤细胞的RNA序列2(NH₂-CCCUUUCCCGGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUiT)(iT代表inverted T：反转T碱基)，充分反应后，分离纯化(5000rpm超速离心纯化)即得基于RNA核苷酸序列靶向识别***肿瘤细胞的量子点纳米药物载体材料。所得靶向纳米药物载体材料示意图见图1，透视电镜图见图2。该纳米材料可以进一步通过化学偶联交联多肽分子或者siRNA分子，从而应用于肿瘤分子成像诊断和siRNA干扰治疗研究。

将前述制得的量子点纳米药物载体材料，以1nmoL浓度加入有乳腺癌细胞贴壁生长的培养液中，共培养1～4小时后，将培养板置于共聚焦显微镜下观察，成像显示本发明靶向纳米药物载体材料特异识别乳腺癌细胞表面抗原HER2，结合于乳腺癌细胞表面，并能将荧光标记的siRNA转导入细胞(参见图3，亮色环状部分为携带荧光染料的纳米粒子量子点，均匀分布于细胞内亮色部分为成功转染的siRNA)。

实施例2：

[0036] 将1nmol金纳米粒子溶解于5mL氯仿中，加入60mg两亲性聚合物PMAT[poly(maleic anhydride alt-1-tetradecene)，452513，Sigma，USA]，搅拌均匀，待聚合物完全溶解后，室温干燥纳米粒子溶液。纳米粒子完全干燥后，溶解于pH100.01M柠檬酸盐缓冲溶液。偶联活性剂乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)化学键偶联PMAT聚合物连接单链DNA核苷酸序列(NH2-TAAGAACAGGGCGTCGTGTTACGAG)，离心或透析纯化纳米粒子。分离纯化(5000rpm超速离心纯化)即得基于RNA核苷酸序列靶向识别乳腺肿瘤细胞的金纳米粒子载体材料。该纳米材料可以进一步通过化学偶联交联多肽分子或者siRNA分子，从而应用于肿瘤分子成像诊断和siRNA干扰治疗研究。

序列表_ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>亓，立峰

<120>靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>45

<212>RNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

cccuuucccg ggaggacgau gcggaucagc cauguuuacg ucacu 45

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

taagaacagg gcgtcgtgtt acgag 25

Claims

1.一种靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料，为疏水性纳米粒子表面包被两亲性聚合物PMAT得到的纳米颗粒，所述纳米颗粒表面还联接有靶向识别肿瘤细胞表面抗原的互补RNA或DNA核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的纳米药物载体材料，其特征在于所述疏水性纳米粒子为下列之一：量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸或脂质体。

3.如权利要求1所述的纳米药物载体材料，其特征在于所述纳米颗粒粒径为5～100nm。

4.制备如权利要求1所述的纳米药物载体材料的方法，其特征在于所述方法包括：(1)将疏水性纳米粒子溶解于有机溶剂中得到纳米粒子溶液，所述疏水性纳米粒子为下列之一：量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸或脂质体；(2)按照两亲性聚合物PMAT与纳米粒子物质按10～100mg∶1nmol的比例将两亲性聚合物PMAT加入纳米粒子溶液中，搅拌使聚合物完全溶解，蒸发有机溶剂，干燥得到固体颗粒；(3)将固体颗粒溶解于缓冲液中，通过化学偶联或互补交联反应联接可靶向识别肿瘤表面抗原的互补RNA或DNA核苷酸序列，分离纯化得到所述纳米药物载体材料。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述有机溶剂为氯仿、乙醇或己烷。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(3)将固体颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，离心纯化后，将固体颗粒重新分散于磷酸盐缓冲液中得到纳米颗粒溶液，以化学键偶联方法联接单链RNA序列1，除去未偶联的RNA序列，将纳米颗粒溶液加热至60～80℃，加入等量含有RNA序列1互补序列且能够靶向识别肿瘤细胞的单链或双链RNA序列2，冷却至室温，分离纯化得到所述纳米药物载体材料；所述RNA序列1长度为3～15个核苷酸、3’或5’端修饰有氨基或者羧基；所述RNA序列2长度为20～80个核苷酸、3’或5’端修饰有氨基或者羧基。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(3)将固体颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中，离心纯化后，将固体颗粒重新分散于磷酸盐缓冲液中得到纳米颗粒溶液，以化学键偶联方法联接单链或双连DNA序列，分离纯化得到所述纳米药物载体材料；所述DNA序列长度为20～80个脱氧核苷酸、3’或5’端修饰有氨基或者羧基。

8.如权利要求1所述纳米药物载体材料在制备靶向药物制剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：以所述纳米药物载体材料为载体，通过静电吸附或者共价偶联方法负载药物分子，制备所述靶向药物制剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述药物分子为DNA、siRNA、mRNA或多肽分子。