CN107693505B - 一种油水双溶性ros敏感纳米粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种油水双溶性ROS敏感纳米粒及其制备方法，本发明的纳米粒所用载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物(PPADT)，通过聚合物侧链亲水性聚乙二醇(PEG)修饰，提高了纳米粒的亲水性和载药量，利用空间阻碍效应适度降低纳米粒的ROS敏感性。本发明公布了所述纳米粒的构建原料及过程、纳米粒的性状表征、体内示踪情况和生物安全性。本发明所述纳米粒具有结构相对简单、包裹性能好、疏水性能好和ROS靶向敏感等特点。

Description

一种油水双溶性ROS敏感纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种油水双溶性ROS敏感纳米粒及其制备方法。
背景技术
近年来，随着医药技术的发展，蛋白质多肽类药物已成为生物技术新药的主要品种，蛋白质多肽类药物具有药物毒性小、药物作用强、靶向作用好等特点，但是考虑到其药物稳定性不理想、生物屏障通透性差等缺点，临床工作中一直不能广泛的应用。
近年来，随着医药技术中纳米粒研究的进展，将蛋白质多肽类药物包被在可生物降解的纳米粒中，不但可以将药物安全输送至机体目标区域，大大减少药物在机体的降解速度；并且还可以根据临床的具体要求，设计纳米粒的球径大小、生物成分等，可以使包被蛋白质多肽类药物的纳米粒一改被动靶向功能，进而具有主动靶向功能。ROS作为生物体内病理性存在的致病因子，在多种疾病部位包括外伤、炎症、缺血等的浓度异常升高，为纳米粒药物的靶向释放提供了新靶点。2015年，第二军医大学王光毅等报道了一种单纯活性氧靶向的智能纳米粒(参见中国发明专利申请“一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法”，公开号为CN104587449A)。该纳米粒一定程度上使纳米粒实现了智能化，可以携带SDF-1到目标创面，实现药物的治疗作用。但该种纳米粒还存在以下缺点：①PPADT为高度疏水的聚合分子，而SDF-1是水溶性蛋白，采用复乳法包药过程中，聚合物片段与蛋白分子相互排斥，载药量不高。所设计纳米粒具有强疏水特性，导致该纳米粒的载药量不理想；②PPADT的ROS反应部位为硫醇缩酮键，其与活性氧离子接触发生氧化反应从而断裂，聚合物解聚，释放所包封的药物。由于聚合物的长链状结构，硫醇键极易与ROS接触反应，导致药物释放过于敏感。2016年，上海交通大学崔大祥等报道了一种ROS响应的纳米药物递送***及其制备方法与应用(参见中国发明专利申请“一种ROS响应的纳米药物递送***及其制备方法与应用”，公开号为CN105617379A)，该纳米药物递送***采用UCNPs为基本纳米材料，外部连接的羧基化的PEG、光敏剂和ROS敏感的缩硫酮linker，主要解决的技术问题是通过光控产生的ROS刺激协助抗肿瘤化疗药物发挥药效和降低药物副作用，制作过程相对复杂，干扰条件较多，难于进行应用转化。
一定水平的载药量是载药纳米粒发挥药理效应的基础。采用复乳法制备蛋白质药物缓释纳米微球时，决定蛋白载药量的因素包括纳米粒制备工艺中内外水相性质、液滴分散程度、微球固化等步骤，及微球粒径、包封率、载药基质的分子大小及与药物蛋白的亲合力等。在纳米粒的基本性质确定和反应条件优化的前提下，决定蛋白载药量的因素主要取决于载药基质和蛋白分子的亲合程度，包括两者间的电荷是吸引或排斥、亲水特性等。
到目前为止，尚未有一种具有结构相对简单、性能稳定、包裹性能好、疏水性能好的针对ROS敏感的智能纳米粒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构相对简单、性能稳定、包裹性能好、疏水性能好的针对ROS敏感的智能纳米粒及构建方法，具体是以硫醇缩酮聚合物(PPADT)为基本结构材料，加以聚合物侧链亲水性PEG修饰。
PPADT聚合物的侧链末端均为具高度疏水性的甲基基团，而蛋白质多肽类药物为一种水溶性蛋白，两者间亲合力低甚至排斥。因此采用复乳法制备纳米粒PPADT包载药物，理论上不具有较高的载药量。PEG是一种高分子聚合物，具有无生物活性、无毒性、生物相容性好的特点，常用于药物修饰。本发明尝试改变PPADT侧链末端基团，在聚合物结构中引入侧链亲水性PEG修饰，使聚合物具有半疏水半亲水特性，可能成为提高PPADT蛋白载药量的有效解决办法。
另外，利用聚合物侧链亲水性PEG修饰硫醇缩酮聚合物(PPADT)，增大了聚合物侧链的空间构象，通过空间阻碍效应降低活性氧与硫醇键的接触几率，从而钝化聚合物对ROS的响应敏感性。
本发明的第一方面，提供一种油水双溶性ROS敏感纳米粒，是通过聚合物侧链亲水性PEG修饰的硫醇缩酮聚合物(PPADT)。
所述的纳米粒为复乳溶媒蒸发(WOW)制剂。
优选的，所述的纳米粒分子量约10,000Da。
本发明所述的硫醇缩酮聚合物(PPADT)，该硫醇缩酮聚合物对ROS敏感，其化学结构式如式I所示：
Figure GDA0002695698880000031
所述聚合物侧链亲水性聚乙二醇PEG的化学式如式II所示：
Figure GDA0002695698880000032
本发明的第二方面，提供一种上述的油水双溶性ROS敏感纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
采用先修饰再聚合的方法：原料2,5-二溴-1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷进行聚合反应，再和化合物氨基聚乙二醇(NH2-PEG)发生氨基化反应得到目标产物，即氨基聚乙二醇修饰的硫醇缩酮聚合物PPADT-PEG。
其反应方程式如下所示：
Figure GDA0002695698880000033
优选的，所述的制备方法包括以下步骤：
A、硫醇缩酮聚合物PPADT的合成
将苯酚、1,4-二甲硫醇苯酚、2,2-二甲氧基丙烷搅拌并加热至95℃，加入甲苯磺酸的甲醇溶液催化反应，107℃反应24h，得硫醇缩酮化合物PPADT，冻干保存。
PPADT分子结构中的硫醇缩酮基团对氧自由基浓度敏感，仅在氧自由基浓度较高的环境中降解，具有ROS敏感特性。具体如下：
Figure GDA0002695698880000041
B、硫醇缩酮聚合物PPADT-PEG的合成
通过2,5-二溴-1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷进行聚合反应，再和氨基聚乙二醇(NH2-PEG)发生氨基化反应，得到分子量约10,000Da的聚合物片段PPADT-PEG，即得所述的油水双溶性ROS敏感纳米粒。
本发明的第三方面，提供一种上述的油水双溶性ROS敏感纳米粒在制备药物载体中的应用。
本发明优点在于：
本发明通过聚合物侧链亲水性PEG修饰提高纳米粒的亲水性和载药量，通过增大聚合物侧链空间构象，利用空间阻碍效应适度降低对ROS的敏感性。
本发明的纳米粒具有结构相对简单、包裹性能好、疏水性能好和ROS靶向敏感等特点。
附图说明
图1为该油水双溶性ROS敏感纳米粒构建及原理简图。
图2为合成PPADT的表征图。
图3为合成PPADT的核磁谱，证实合成产物的分子结构与预期相同。
图4为该油水双溶性ROS敏感纳米粒电镜检测图。
图5为该油水双溶性ROS敏感纳米粒粒径检测图。
图6该油水双溶性ROS敏感纳米粒载药量对比图。
图7为注射后12h用小动物活体成像仪观察携带Cy5荧光的油水双溶性ROS敏感纳米粒在体分布情况。
图8为该油水双溶性ROS敏感纳米粒体外与细胞共培养安全性检测图。
图9为该油水双溶性ROS敏感纳米粒体内安全性检测图。
具体实施方式
现结合附图和实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施不仅限于此。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。其中：
氨基聚乙二醇，CAS 32130-27-1，Sigma-Aldrich(U.S.)
2,2-二甲氧基丙烷，CAS77-76-9，Sigma-Aldrich(U.S.)
实施例1.构建油水双溶性ROS敏感纳米粒
1、纳米粒的构建过程
将苯酚、1,4-二甲硫醇苯酚、2,2-二甲氧基丙烷搅拌并加热至95℃，加入甲苯磺酸的甲醇溶液催化反应，107℃反应24h，得硫醇缩酮化合物PPADT，再和化合物氨基聚乙二醇(NH2-PEG)发生氨基化反应得到目标产物-氨基聚乙二醇修饰的硫醇缩酮聚合物PPADT-PEG(图1)。
2、纳米粒表征检测
采用透射电镜观察所构建纳米粒的形态及粒径大小，采用红外光谱(FTIR)、生物核磁共振(1H-NMR,13C-NMR)和x线光电子光谱(XPS)表征其化学结构，凝胶渗透色谱(GPC)检测其分子量。结果如图2、图3，通过检测纳米粒的核磁谱和表征，证明合成产物的分子结构与预期相同。图4、图5所示所合成的PEG-PPADT纳米粒粒径为100nm左右，符合实验预期。
实施例2.油水双溶性ROS敏感纳米粒载药量检测：
将制备的纳米粒-40℃真空抽干后，称重并以1ml二氯甲烷溶解纳米粒，12000g离心10分钟，去除上清，重复3次，适量PBS溶液溶解附壁的SDF-1，ELISA法测其含量，与投药量及纳米粒重量对照计算其载药量。结果如图6所示，油水双溶性ROS敏感纳米粒的载药量明显高于单纯ROS敏感纳米粒组，证明经PEG修饰的纳米粒可以提高载药量。
实施例3.油水双溶性ROS敏感纳米粒体内示踪
在37℃中性溶液中用Cy5标记SDF-1，避光搅拌。适当孔径透析袋，充分过滤洗涤去除多余Cy5。以Cy5-SDF-1为原料替代SDF-1，通过复乳法合成(PPADT-PEG)-SDF-1-Cy5纳米粒。静脉给药后，动物活体荧光成像仪观察，通过荧光显微镜在650nm激发波长下观察SDF-1在各实验组动物体内的分布，据此评价体内ROS对纳米粒的靶向作用。结果如图7所示，说明油水双溶性ROS敏感纳米粒所载Cy5-SDF-1到达创面的量明显高于单纯ROS敏感纳米粒组，证明该纳米粒载药量和将药物靶向输送到创面的能力明显优于单纯ROS敏感纳米粒组。
实施例4.纳米粒体外安全性检测
体外细胞毒性实验：Cell Counting Kit-8(CCK8)法观察含不同浓度纳米粒的培养液中，RAW264.7细胞的细胞活力和增殖能力。结果图8所示，不同组间细胞活力和增殖能力没有统计学差异(p＞0.05)，说明不同浓度的纳米粒对细胞的活力和增殖能力没有明显影响。
在体生物毒性实验：通过静脉输注不同剂量PPADT-PEG纳米粒，观察大鼠血清酶学改变及各脏器病理改变。结果图9所示，不同组间AST和ALT酶的值没有统计学差异(p＞0.05)，说明不同浓度的纳米粒体内注射后对大鼠没有明显毒性作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (2)

1.一种油水双溶性ROS敏感纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用先修饰再聚合的方法：原料2,5-二溴-1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷进行聚合反应，再和化合物氨基聚乙二醇发生氨基化反应得到目标产物，即氨基聚乙二醇修饰的硫醇缩酮聚合物PPADT-PEG；
其反应方程式如下所示：
Figure FDA0002695698870000011
A、硫醇缩酮聚合物PPADT的合成
将苯酚、1,4-二甲硫醇苯酚、2,2-二甲氧基丙烷搅拌并加热至95℃，加入甲苯磺酸的甲醇溶液催化反应，107℃反应24h，得硫醇缩酮化合物PPADT，冻干保存；
B、硫醇缩酮聚合物PPADT-PEG的合成
通过2,5-二溴-1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷进行聚合反应，再和氨基聚乙二醇发生氨基化反应，得到分子量约10,000Da的聚合物片段PPADT-PEG，即得所述的油水双溶性ROS敏感纳米粒；
所述油水双溶性ROS敏感纳米粒是通过聚合物侧链亲水性PEG修饰的硫醇缩酮聚合物PPADT；所述的硫醇缩酮聚合物PPADT的化学结构式如式I所示；所述聚合物侧链亲水性聚乙二醇PEG的化学式如式II所示；
Figure FDA0002695698870000012
2.一种权利要求1制备的油水双溶性ROS敏感纳米粒在制备药物载体中的应用。
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