CN101815939A - 以液相色谱质谱法检测生物药剂产品中的过滤器可提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及液相色谱质谱法(LCMS)来确定在制造、过滤或存贮过程中被引入一种生物药剂产品中的处于超过一个特定浓度下的可提取物的存在或缺乏。在此披露的方法可以用来检测实际的生物药剂产品中而不是一个代用品溶剂***中的可提取物的存在。对实际药品中的可提取物的检测提供了对可能引入人类或动物患者体内的可提取物的特征曲线的一个精确表征。在一个实施方案中，该可提取物是通过生物药剂产品的过滤而被引入的。

Description

以液相色谱质谱法检测生物药剂产品中的过滤器可提取物的方法

相关申请

本申请要求了于2007年8月24日提交的美国临时申请号60/966,065的权益。其全部传授内容通过引用结合在此。

背景技术

过滤装置被广泛用来从生物药剂产品中除去颗粒和微生物或纯化蛋白质。在过滤过程中，来自过滤装置的材料可能被提取到产物之中并影响它的效力以及安全性。食品与药物管理局(FDA)要求对用于人类和动物药品的过滤器的可提取物进行评估。

过滤器的可提取物主要是由低浓度的低聚物以及具有不同物理和化学性质的添加剂所构成的复杂的混合物。因为生物药剂产品的其他组分的浓度将会更高，过滤器的可提取物的分析信号可能被掩盖，并因此致使它们的存在不可检测出。按照惯例，使用模型流方法(Model Stream Approach)(Stone，T.E.；Goel，V.；Leszczak，J.Pharmaceutical Tech.1994，116-130)来研究在过滤步骤之后存在的可提取物。在该方法的过程中，使过滤装置经受一种模型溶剂，该模型溶剂模拟了一种药物溶液特有的化学效应。根据该原则，选择模型溶剂来代表过滤装置将可能暴露的环境中的极端(高或低的pH、高的盐浓度、或有机溶剂)，但并不与生物药剂产品的实际含量完全一样。在腐蚀性条件下可能产生“最坏的情况”，此时过滤器的可提取物的含量被最大化。采用分析技术诸如液相色谱紫外检测法(LCUV)、气相色谱质谱法(GCMS)以及傅里叶变换红外光谱法(FTIR)来检测在试验过程中进入模型溶剂中的可提取物的存在。

发明内容

本发明使用液相色谱-质谱法来检测生物药剂产品中的污染物诸如可提取物或可浸取物(“可提取物”的)的存在，诸如通过一种生物药剂产品的过滤被引入的过滤器的可提取物或可能在该生物药剂产品的制造和加工中从接触产品的材料(或表面)中产生的其他可提取物，诸如塑料。与当前用于测试可提取物的技术相比，在此披露的方法可以用来检测实际的生物药剂产品中的过滤器的以及其他可提取物的存在，而不是使用一种模型溶剂***。对实际药品中的过滤器的以及其他可提取物的检测提供了对于由所加工的生物药剂产品而有可能引入人类或动物患者体内的这些可提取物的特征曲线(profile)的精确表征。

本发明的一个实施方案是一种检测生物药剂产品中的可提取物的方法，该方法是通过制备一个无任何可提取物的生物药剂产品的参比样品，向该参比样品中加入可提取物标准物。然后通过液相色谱(LC)法对该参比样品进行分离。在分离之后，将样品转向废液一段时间以除去参比样品中对可提取物的检测造成基质干扰的组分。剩余的参比样品通过一台质谱仪进行处理以获得一个参考质谱图。同样地，制备一个测试样品。该测试样品是可能包含可提取物的生物药剂产品，这些可提取物是通过生物药剂产品的过滤或通过它的制造工艺而被引入的。使用液相色谱法对测试样品进行分离。在分离之后，将测试样品转向废液一段时间以除去测试样品中对可提取物的检测造成基质干扰的组分。剩余的参比样品通过一台质谱仪进行处理以获得测试质谱图。将测试质谱图与参考质谱图进行比较以确定测试样品中可提取物的存在或缺乏。在一个实施方案中，可提取物是通过生物药剂产品的过滤而被引入的过滤器的可提取物。在另一个实施方案中，这些提取物可能是会从用来制造以及加工该生物药剂产品或中间产物的设备、材料或表面浸出的任何物质，诸如塑料。在一个特别优选的实施方案中，该过滤器的可提取物可以是来自聚丙烯(PP)支撑膜或聚偏氟乙烯(PVDF)微孔膜(诸如来自可商购的名字为

(

Corporation)的过滤器和膜)。

在本发明的另一个实施方案中，可以通过LCMS确定在生物药剂产品中存在的可提取物的量。

本发明的另一个实施方案是针对一种使用液相色谱质谱法(LCMS)并使用过滤器的可提取物的特征性停留时间来检测过滤器的可提取物的方法。另一个实施方案是使用大约11.5至大约12.4分钟的平均停留时间。

本发明的另一个实施方案是针对使用液相色谱质谱法(LCMS)来检测过滤器的可提取物的特征性离子的一种方法。另一个实施方案是检测在大约329.2至大约357.2质荷比(M/Z)处的离子。

在本发明的另一个实施方案中，该样品通过LC被分离并然后在被MS处理之前转向废液一段时间。在本发明的另一个实施方案中，在LC分离之后样品转向废液的时间的长度是取决于所使用的过滤器的类型、灭菌和过滤条件、以及生物药剂产品的含量。在另一个实施方案中，在对感兴趣的过滤器特征性的第一批目标可提取化合物从LC步骤中被洗脱掉之前尽可能最晚的时刻应发生这种转向。在本发明的另一个实施方案中，该时间段长达10分钟。在另一个实施方案中，这种转向废液的时间是10分钟。

在本发明的另一个实施方案中，导致基质干扰的组分是选自下组，其构成为：活性药用成分、缓冲剂类、盐类、防腐剂类、增溶剂类、螯合剂类、酸类、碱类、糖类、蛋白质、肽、以及它们的组合。

附图说明

上述内容从以下对本发明的实例性的实施方案的更具体说明中是更清楚的。

图1A是一种液体流动模式的示意图，此时在液相色谱/质谱技术中使用一个常规的注射阀，且该注射阀处于“废液”设置。

图1B是一种液体流动模式的示意图，此时图1A中的常规注射阀被切换至“源液”设置。

图2A是按照本发明的一个实施方案穿过一个液相色谱分流器的一种液体流动模式的示意图，而该分流器处于“废液”设置。

图2B按照本发明的一个实施方案穿过一个液相色谱分流器的一种液体流动模式的示意图，且该分流器处于“源液”设置。

图3是来自过滤器的可提取物标准物的液相色谱分离步骤的基峰色谱图，其叠置在对照物的色谱图上。

图4是来自两个峰的质谱图，这两个峰在标准物的液相色谱步骤的色谱图中已被确定。

图5是可提取物标准物、基于小分子的药品、以及掺有可提取物标准物的基于小分子的药品的色谱图的叠放。

图6是可提取物标准物、基于大分子的药品、以及掺有可提取物标准物的基于大分子的药品的色谱图的叠放。

具体实施方式

以下是对本发明的实例性的实施方案的一个说明。所有专利、公开的申请、以及在此引用的参考文献的传授内容通过引用以其整体结合在此。

食品与药物管理局(FDA)要求在对计划用于人类或动物使用的药品的批准过程中对过滤器的可提取物进行评估。根据FDA的要求，用来提取来自过滤器装置中的过滤器的可提取物的溶剂理想地将是药品本身，因此获得了相同的定性的提取特征曲线(Guidance for Industry：“The Container Closure Systemsfor Packaging Human Drugs and Biologics.”1999；Attachment C：ExtractionStudies)。然而，对过滤器的可提取物的检测在实际的生物药剂学的溶液中难以完成，很大程度上是因为在过滤过的药品中的过滤器的可提取物的浓度通常要低于该溶液中的其他组分的数量级。为避开这种分析障碍，当前的用于过滤器的可提取物检测的方法是通过模型溶剂法(Stone，T.E.；Goel，V.；Leszczak，J.Pharmaceutical Tech.1994，116-130)获得的。在该科学方法中，采用一种代用品溶剂***来使过滤装置经受极端的化学条件，这些条件并不必须是生物药剂产品的条件的代表。使用替代的溶剂的目的是产生一种最坏的情况来表明所有可能来自给定的过滤器装置的可提取物。尽管该模型溶剂法提供了有用的信息，它并不能用来检测在用于人类或动物使用的生物药剂产品中存在的实际的过滤器的可提取物。检测实际存在于生物药剂产品中的过滤器的可提取物的能力将有助于保证该药品的安全性以及效力。

本发明披露了一种允许检测实际的生物药剂产品中的过滤器的可提取物的方法，而不是在一个模型溶剂***中。该方法利用液相色谱-质谱法(LCMS)来检测通过生物药剂产品的过滤而被引入的可提取物特征性的离子。尽管以下实例说明了用于检测过滤器的可提取物的本发明的方法，这些方法总体上是适用于任何在制造或加工中被引入生物药剂产品中的可提取物，诸如来自过滤器壳体或与生物药剂产品相接触的具有浸取潜力的其他设备的塑料可浸取物。因此，本发明的方法允许对可提取物(总的来说是在一种生物药剂产品中)的检测。

常规的方法(诸如LCUV和FTIR)并不适用于直接检测生物药剂产品中的可提取物，或者是因为受限的灵敏度或者是因为严重的基质干扰。然而，可提取物的检测现在可以按照本发明的方法直接在生物药剂产品中完成，这归因于用于减小或消除基质干扰的一种方法以及***的发现。对生物药剂产品中会造成基质干扰的一种或多种组分的减小或消除将允许使用质谱仪对低或微量水平的可提取物进行检测，它们否则会被干扰组分所掩盖。通过应用本发明的方法，对生物药剂产品中的过滤器的可提取物的检测现在是有可能的，并且因此为本行业进行测试并向FDA报告的一种未满足的需要做出了有效的贡献。

在此描述的方法对于检测、鉴定以及任选地定量一种可能含可提取物、可浸取物或杂质的生物药剂产品中的污染物是有用的。可提取物是在一种溶剂的存在下可能从接触产品的材料的弹性体的或塑料的组分中被提取出的化合物，可浸取物是从接触产品的材料弹性体的或塑料的组分中浸取入配制品中的化合物。杂质是在存在于生物药剂产品中或可能被引入生物药剂产品中的化合物。如在此讲明的，术语“可提取物”旨在覆盖含可提取物、可浸取物或杂质的污染性化合物。为方便描述，本发明的方法将描述为可提取物，但可浸取物和杂质也被考虑到。可提取物是主要由低聚物以及具有不同物理和化学特性的添加剂所构成的复杂混合物，并且通常以大大低于该生物药剂产品中的任何其他成分的浓度存在，使得检测它们的存在是困难的。FDA要求对可提取物进行评估而获得它们对于生物药剂产品的安全性以及效力的影响。

生物药剂产品包括用于人类或动物使用的药品。这种生物药剂产品是由一种活性药用成分(API)以及赋形剂类组成。API是在疾病的诊断、治疗、缓解、处理或预防中将要提供药理活性或其他直接效果、或影响人类或动物身体的结构或任何功能的任何化合物。术语“API”包括可以在药品的制造中经受化学变化并且以一种旨在提供特定的活性或效果的改性的形式存在于药品中的那些组分。适合本发明使用的API的实例，包括但不限于：有机小分子、有机大分子、核酸、氨基酸、以及蛋白质。有机小分子典型地具有低于500道尔顿的分子量，而有机大分子超过500道尔顿。当有机大分子存在时基质干扰通常更严重。当有机大分子存在时，可能必须要在LCMS步骤之前包括一个预处理步骤。以下描述了代表性的预处理步骤，诸如沉淀。

生物药剂产品可进一步包含赋形剂，赋形剂包括但不限于：缓冲剂类、酸类、碱类、盐类、增溶剂类、防腐剂类、螯合剂类、糖类、氨基酸、蛋白质以及溶剂类。在生物药剂产品中可能存在一种、几种或所有这些组分。这些成分中的许多(若不是全部)，部分地造成了对可提取物的检测信号的基质干扰并且应该在可提取物的检测之前从生物药剂产品中被消除或减少。可以使用已知的用于去除或减少造成基质干扰的组分的量值的方法，诸如蛋白质的沉淀。例如，可以在蛋白质溶液中以4比1的体积比加入丙酮。反应15分钟之后将该溶液在15,000RPM下离心10分钟。然后移出含一种或多种有意义的分析物的上清液，用于进一步的分析。用于减小或除去基质干扰组分的方法也可以使用以下详细描述的新颖的转向方法和***而完成。

在生产过程中，生物药剂产品可以从它们与之接触的容器或过滤装置中提取出化学的化合物。生物药剂产品与其接触的时间的长度、容器或过滤装置的温度处理、接触发生的温度、以及存在于该生物药剂产品中的其他溶剂或溶质都会影响可能存在于该生物药剂产品中的可提取物的量和类型。可提取物包含一个或多个化学种类，并且可以在生物药剂产品的生产过程中在不同的步骤中出现。例如，当使用过滤装置来从生物药剂产品中除去颗粒和微生物或纯化蛋白质时在生物药剂产品通过一个过滤装置时可提取物可通过过滤而被引入。过滤器的代表性实例包括聚偏氟乙烯(PVDF)微孔膜和聚丙烯(PP)支撑膜，诸如

过滤器；硼硅酸盐玻璃纤维微孔膜和聚丙烯支撑膜，诸如

过滤器；聚丙烯微孔膜和聚丙烯支撑(PP)膜，诸如

过滤器；聚四氟乙烯微孔膜和聚丙烯支撑膜，诸如

过滤器；以及亲水的聚醚砜微孔膜和聚丙烯支撑膜，诸如Millipore

过滤器。

在另一个实例中，药品在日常存储或保质期的研究中可以提取出它们的容器中的组分，由此被可提取物所污染。代表性的实例包括处理容器膜(processcontainer films)，其中流体接触材料是用超低密度聚乙烯(ULDPE)制成的；气体阻挡物是用聚乙烯乙烯醇的共聚物(EVOH)制成的；并且外层是用乙烯醋酸乙烯酯(EVA)以及ULDPE制成的，诸如

处理容器膜。

Millipore

和

被注册为商标Millipore Corporation，Billerica，MA。

用于检测生物药剂产品中的可提取物的方法包括将一个测试样品的质谱图与一个参比样品进行比较。如在此使用的，“参比样品”是一个不含任何可提取物(在生产期间引入)的生物药剂产品的样品，但向其中加入了一种可提取物。例如，参比样品可以是一个未被过滤的生物药剂产品的样品，并向其中加入了一种可提取物标准物。可提取物标准物是可以通过一种特定容器或过滤器装置的使用而被引入生物药剂产品中的可提取物的混合物。接触产品的材料(诸如一个过滤器装置)的可提取物标准物的特征曲线可以通过之前建立的方法被测定。例如，可以在宽的范围的条件(包括极端温度、极端pH范围、或反应性溶剂(包括有机溶剂)、长的提取时间、以及高压灭菌周期的循环)下将模型流法应用于生产工艺的一个特定的组成部分中，诸如一个过滤器装置。选择的溶剂将被选择用来模拟有待测试的生物药剂产品中的溶剂。在许多例子中，水或其他水溶剂将成为选择的溶剂，因为多数的生物药剂产品存在于水性介质中。对在这种方法的过程中所发现的组分的分析可以表明这样的化学物，它们可以从用于生物药剂产品的生产的材料中被提取或浸取出，并且可以提供在生物药剂产品中可提取物的特征曲线。可提取物标准物以适当的浓度包含这些已知的组分。

如在此使用的，“测试样品”是一种可以包含有待确定的可提取物的生物药剂产品。例如，生物药剂产品的过滤可能引入可提取物，并因此将是一种适当的测试样品。

制备可以在参比样品或测试样品的注射之前进行。一种可能的制备方法可包括将样品加热或加入十二烷基硫酸钠(SDS)来使任何存在的蛋白质变性和/或沉淀。一些生物药剂产品可包含其他的能通过固相提取、或pH或溶液的离子强度的改变而被除去的组分。其他的样品制备技术可以用于本发明的方法。一种用于分析模型溶剂中的可提取物的浓度的方法是不挥发残渣分析。可以在注射进LCMS之前将这些样品稀释以获得适当的浓度。

使用液相色谱法分别对参比和测试样品进行分离。在该方法开展期间，应该将流动相、固定相、流速、温度和注射体积最佳化。在LC分离之后，将样品洗脱液转向废液一段时间。这种转向过程除去了或减小了可能导致基质干扰的组分，该组分影响了该测试方法的执行因而不能产生可信的数据。基质干扰是由具有极端pH值、高的盐浓度、反应性的化学组分、或高浓度的非目标化合物的样品造成的。以下段落描述了能导致基质干扰的生物药剂产品组分的总体分类。

生物药剂产品的活性药用成分(API)是基质干扰的一个来源。在一些情形下，API比目标可提取物在更早的时刻洗脱，并且可以使用在此描述的转向方法被转向离开MS。

另一种常见的基质干扰的原因是缓冲剂类。一列可能的缓冲剂包括但不限于：ACES、乙酸盐、ADA、氢氧化铵、AMP(2-氨-2-甲基-1-丙醇)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、AMPSO、BES、BICINE、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(bis-tris)、双三羟基甲氨基丙烷(BIS-TRIS propane)、硼酸盐、CABS、二甲次胂酸盐、CAPS、CAPSO、碳酸盐、CHES、柠檬酸盐、DIPSO、EPPS、HEPPS、乙醇胺、甲酸盐、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、HEPBS、HEPES、HEPPSO、组氨酸、肼、咪唑、苹果酸盐、马来酸盐、MES、甲胺、MOBS、MOPS、MOPSO、磷酸盐、哌嗪、哌啶、PIPES、POPSO、丙酸盐、吡啶、焦磷酸盐、琥珀酸盐、TABS、TAPS、TAPSO、牛磺酸(AES)、TES、曲辛、三乙醇胺、氨基丁三醇。

盐类是生物药剂产品的另一种可能向检测中引入基质干扰的组分。代表性的盐类包括但不限于：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重碳酸盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、glyceptate、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对α-羟乙酰氨基苯砷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、氢溴化物、盐酸化物、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、朴酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱、甲苯磺酸盐、以及三乙基碘的盐类。还包括碱金属盐类(尤其是钠和钾)、碱土金属盐类(尤其是钙和镁)、铝盐和铵盐、以及用生理学上可接受的有机碱成的盐类，这些有机碱是诸如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、N，N’-二苄乙二胺、2-羟乙胺、双-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、脱氢松香胺、N，N’-双脱氢松香胺、葡萄糖胺、N-甲葡糖胺、三甲基吡啶、奎宁、喹咛制、以及碱性的氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。

防腐剂类通常被加入生物药剂产品中以延长其保质期。一个代表性的清单包括但不限于：抗坏血酸、苯甲酸、苯甲醇、氯化苄烷铵(benzylalkoniumchloride)、异抗坏血酸、丙酸、山梨酸、硫二丙酸、抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁对甲氧酚、丁羟甲苯、抗坏血酸钙、丙酸钙、山梨酸钙、鈣，鈣′-硫二丙酸双十二酯、愈创树脂、羟苯甲酯、焦亚硫酸盐、间甲酚、羟苯甲酯、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、没食子酸丙酯、对羟苯甲酸丙酯、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、亚硫酸钠、氯化亚锡、二氧化硫、生育酚。

为了溶解API并维持其溶解，可以向生物药剂产品中加入增溶剂，但这些增溶剂可能导致基质干扰。PEG、Tween、CMC、以及SDS是作为增溶剂使用的试剂的所有可能情况。

螯合剂也可能是基质干扰的一个来源并且包括：柠檬酸、酒石酸、乙酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、双乙酸钙、葡萄糖酸钙、六偏磷酸钙、磷酸二氢钙、植酸钙、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、柠檬酸异丙酯、苹果酸、一异丙基柠檬酸盐、柠檬酸钾、柠檬酸钠、双乙酸钠、葡萄糖酸钠、六偏磷酸钠、偏磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠、焦磷酸四钠、酒石酸钠、酒石酸钠钾、硫代硫酸钠、三聚磷酸钠、十八烷酰柠檬酸酯、以及己二胺四乙酸四钠。

通常向生物药剂产品中加入酸和碱以调整pH或增强效力，但是它们的存在是基质干扰的一个来源。代表性的酸包括：硝酸、盐酸、硫酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、醋酸、抗坏血酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、甲酸、庚酸、己酸、氢氰酸、氢氟酸、乳酸、亚硝酸、辛酸、草酸、戊酸、磷酸、丙酸、亚硫酸、以及尿酸。代表性的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、丙氨酸、氨、二甲胺、乙胺、甘氨酸、肼、甲胺、以及三甲胺。

糖类，包括葡萄糖(右旋糖)、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、阿糖醇、赤藓糖醇、丙三醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、以及木糖醇，蛋白质类诸如白蛋白，以及肽类都可能是基质干扰的来源。

作为赋形剂使用的一种氨基酸的一个实例是L-组氨酸。

作为赋形剂使用的一种蛋白质的一个实例是牛血清白蛋白(BSA)。

将样品洗脱液进行转向包括在本方法的液相色谱步骤之后立即将样品引导离开质谱仪。该转向过程将持续一个预先设定的时间值，这是基于之前的实验性测定值。应该对样品进行转向到直至在对于该标准物的第一目标可提取物已知的停留时间之前的直接一点处。转向时间将取决于所测试的生物药剂产品的组分、可能存在的可提取物的性质、以及分析方法。

在转向步骤之后，剩余的参比样品通过质谱仪进行处理以获得一个参考质谱图。参考质谱图是参比样品的强度对m/z(质/荷比)的曲线，参比样品也就是，最初未包含任何来自生物药剂产品的生产的可提取物。在参考质谱图中发现的离子是归因于在注射进LCMS之前加入参比样品中的可提取物标准物。

同样地，剩余的测试样品通过质谱仪进行处理以获得一个测试质谱图。测试质谱图是测试样品的强度对m/z(质荷比)曲线，测试样品也就是，已经与一种容器或过滤器装置接触、并因此可能含可提取物的生物药剂产品。将测试样品的质谱图与参比样品的质谱图进行比较以检测在测试样品中过滤器的可提取物的存在或缺乏。在测试质谱图中的离子(如果发现的话)是归因于在生物药剂产品的生产过程中从材料中浸出的可提取物。

样品的LC色谱图或质谱图中一个或多个峰的出现表明可提取物是存在的。对可提取物的检测通过在LC色谱图或质谱图中发现一个或多个峰的存在而完成。对测试样品的质谱图与参比样品的质谱图的比较将表明测试样品中可提取物的存在或缺乏。在参考以及测试质谱图两者中都出现的峰当作表明生物药剂产品中过滤器的可提取物的存在。只在参考质谱图、而未在测试质谱图中出现的峰当作表明生物药剂产品中过滤器的可提取物的缺乏。

该方法的另一个实施方案是定量、或测定不相关的过滤器的可提取物的数量以及全部可提取物在生物药剂产品中存在的浓度。定量的步骤可以包括对LC中峰高度的测量。

按照本发明的一个实施方案，提供了一个液相色谱分流器、以及一种用于产生自液相色谱法的液体的转向方法，该方法有助于减小有待通过质谱进行分析的样品中干扰化合物的存在。根据本发明的这样一个实施方案允许使用者检测药品或生物药剂产品中过滤器的可提取物，这是通过减小在质谱分析中可以掩盖可提取物的峰的干扰化合物的存在进行的。

通过对根据本发明的一个实施方案的液相色谱分流器的说明，首先在相似的上下文中描述了一种常规的注射阀的用途。常规的注射阀可以在“废液”设置和“源液”设置之间进行切换，这会改变该注射阀的端口之间的液体流动模式。

图1A是一种液体流动模式的示意图，此时在液相色谱/质谱技术中使用一个常规的注射阀，且该注射阀处于“废液”设置。有待分析的液体从一个泵101流进一个自动进样器102中，并且从那里进入液相色谱柱103。在液体穿过液相色谱柱103之后，液相色谱洗脱液104进入一个常规的六端口注射阀的一个第一端口105中。洗脱液104包含过滤器的可提取物(它们在药品或生物药剂产品中的检测是有意义的)，以及干扰这些可提取物的测量的化合物。当常规六端口注射阀处于“废液”设置时，洗脱液自第一端口105直接流向该阀的第二端口106，并且从那里直接流向质谱仪111。与此同时，校准液从注射泵112流向该阀的第五端口109(对逆时针方向环绕六端口注射阀进行计数)。然后校准液流向第六端口110，并从那里穿过一个液流回路113，该回路是以串联的流动关系定位在六端口阀的第六端口110和第三端口107之间的。校准液从第三端口107向第四端口108前进并从那里去往废液114。

图1B是一种液体流动模式的示意图，此时图1A中的常规注射阀被切换至“源液”设置。如图1A中，液体最初从泵101流入自动进样器102，并且穿过液相色谱柱103流动而产生洗脱液104，该洗脱液被引入第一端口105中。当该六端口阀处于“源液”设置时，洗脱液104随后被导入第六端口110，并且穿过液流回路113进入第三端口107。因为液流回路113在处于图1A中的“废液”设置时已经包含校准液，则一些校准液在其穿过液流回路113流动时与洗脱液一起被清除。然后洗脱液从第三端口107流向第二端口106，并然后直接流向质谱仪111。因为一些校准液携带有洗脱液，则将校准液与洗脱液一起引入质谱仪111，以允许质量校准。与此同时，来自注射泵112的校准液被导向第五端口109，并且从那里通过第四端口108被导向废液114。

使用如图1A和1B中的常规六端口注射阀，在该采集方法的图1A的“废液”设置与图1B中的“源液”设置之间通过时间区段对该阀门可以进行切换。然而，该常规六端口注射阀处于两种设置中时，液相色谱洗脱液104都被不断地引入质谱仪111中，并且因此随之携带了干扰质谱分析、或与之不相容的化合物。因此使用图1A和1B中的常规的六端口注射阀难以精确地检测和度量药物样品中过滤器的可提取物的存在。

相比之下，图2A是按照本发明的一个实施方案穿过一个液相色谱分流器的一种液体流动模式的示意图，且分流器处于“废液”设置。不像在图1A和1B的常规六端口注射阀中，图2A和2B中的分流器包括在一个六端口注射阀的相邻端口之间的一个液流回路215，并且在与通向质谱仪211的端口206以及通向废液214的端口208相邻的一个端口207处引入液相色谱洗脱液204。处于“废液”设置时，校准液从注射泵212流入一个六端口注射阀的第五端口209中，并且从那里流向第六端口210。使用在彼此相邻的第六端口210和第一端口205之间添加的一个液流回路215，则校准液然后流进第一端口205中。校准液从那里被导向第二端口205，并且导向质谱仪211。与此同时，来自液相色谱柱203的洗脱液204在第三端口207处进入该分流器，并被导向第四端口208，而且从那里被导向废液214。因此，处于“废液”设置时，使用图2A的实施方案的分流器，所有来自液相色谱柱的洗脱液204流向废液214。因此，处于“废液”设置时，所有在洗脱液204中存在的干扰化合物，与洗脱液一起同样被导向废液214；而质谱仪211仅接收校准液。

图2B是按照本发明的一个实施方案穿过一个液相色谱分流器的一种液体流动模式的示意图，且该分流器处于“源液”设置。在此，从液相色谱柱203流出的洗脱液204进入第三端口207中并被导向第二端口206，并且从那里直接通向质谱仪211，以允许对洗脱液中的过滤器的可提取物的分析。因为在第一端口205和第二端口206之间的液流路径被闭合了(就如同第五端口209和第六端口210之间的液流路径)，使得从第六端口210到第一端口205的液流通过液流回路215形成了一个闭合的回路。与此同时，从注射泵212流出的校准液从第五端口209被导向第四端口208，并且从那里被导向废液214。

使用图2A和2B的实施方案的分流器，在采集方法的图2A的“废液”设置和图2B的“源液”设置之间通过时间区段可将该阀门进行切换。然而，不像使用图1A和1B的常规的阀门的技术，图2A和2B的实施方案允许在处于“废液”设置时，液相色谱洗脱液204被全部导向“废液”；并且然后在处于“源液”设置时，被全部导向质谱仪。以这种方式，图2A和2B的分流器可以切换至“废液”设置一段时间，例如像，前十分钟的液相色谱洗脱液的液流-在此时间的过程中多数或几乎全部的会干扰过滤器的可提取物的质谱测试、或与之不相容的化合物被洗脱掉。然后，一旦多数或几乎全部的干扰化合物已经被洗脱掉并且送往废液，则图2A和2B的分流器可以被切换至“源液”设置以允许液相色谱洗脱液直接流向质谱仪以允许过滤器的可提取物的测量而不受干扰组分的干扰。因此，图2A和2B的液相色谱分流器允许对药品或生物药剂学样品中过滤器的可提取物的存在进行更精确的检测和测量。

按照图2A和2B的实施方案，分流器处于“废液”模式并且液相色谱洗脱液被直接送往废液的时间段可以通过分析大多数干扰化合物被洗脱掉的时间(通过与目标过滤器的可提取物被洗脱掉的时间比较)来确定。例如，干扰化合物的一个质谱峰可能在某一个初始时间段的过程中被观察到，接着出现过滤器的可提取物的一个峰。理想的是，在液相色谱洗脱液中该第一目标过滤器可提取化合物的所感兴趣特征出现之前的尽可能最晚的时刻应当将该分流器从“废液”切换到“源液”。如上所指出，十分钟是使用该分流器的“废液”设置的一个有用时间段的一个实例，但也可以使用其他的时间段，这取决于过滤器材料的性质、可提取物化合物、干扰化合物、药品成分、以及其他因素。总的来说，洗脱液应该被转向一段时间来将导致基质干扰的污染物除去至足以在可提取物的检测中允许所希望的精度的程度。

按照本发明的一个实施方案，与图2A和2B的分流器一起使用的六端口注射阀，可以例如是基于一个从Bruker Daltonics Inc.，Billerica，MA可得的六端口注射阀，该阀已被改性来增加液流回路215并且使用根据本发明的一个实施方案的液流模式。例如，校准液能以每分钟2至10微升的速率流动。例如，质谱仪211可以是一台从Bruker Daltonics Inc.，Billerica，MA可得的mirOTOF质谱***。

例证

实例1：过滤器的可提取物的分离和检测

在循环60分钟的126℃下的高压灭菌之后，将一个10英寸0.22m

的过滤器在Milli-

水中在环境温度下提取24小时。

和Milli-

是Millipore Corporation，Billerica，MA的注册商标。使用不含过滤器的Milli-

水在相同条件下制备一个对照样品。然后通过不挥发残渣分析法对这些溶液进行分析，在注射进LCMS之前使用Milli-

水稀释10倍。

图3中所示的是可提取物(红色)和对照样品(绿色)的基峰色谱图。当与对照样品比较时，发现可提取物包含两个特征为

过滤器的峰。造成图3的色谱图中所见的对两个峰的物质的质谱图描述在图4中。在荷质比为329和357处的峰对应于已知的从过滤器产生的可提取物化合物。这些试验性地被确定为在膜制造工艺中使用的酚型的抗氧化剂。因为这些化合物以极低的浓度存在，LCMS提供了用于检测它们存在的最好模式。

实例2和3：生物药剂产品中过滤器的可提取物的分离和检测

在药品中掺入ppm水平的一种可提取物标准物。在大分子应用中，使氨基酸或蛋白质从生物药剂产品中沉淀出来，并且然后将该样品注入LCMS中。同时，在注入之前以同样的方式制备未掺样的样品。

可提取物标准物、一种药品以及基于小分子的掺有可提取物标准物的药品的色谱图的叠放(图5：小分子；图6：大分子)。其结果证实，尽管存在基质的抑制，在掺样的样品中药品成分的存在下，可以检测出可提取物。该方法适用于很宽范围内的生物药剂学成分并且显示对多数应用是敏感的且可靠的。该方法允许对在生物药剂产品中可提取物的直接存在或缺乏的第一时间验证。相比之下，没有任何常规的方法允许这样的检测。

尽管本发明已经具体地示出并通过参考实例描述了它的实施方案，应被本领域的普通技术人员理解的是在此所做的不同形式和细节上的改变并未脱离所附权利要求书所包含的本发明的范围。

Claims (18)

1.检测生物药剂产品中的可提取物的一种方法，包括：使用液相色谱-质谱法来检测在该生物药剂产品的制造中被引入的可提取物的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中，这些可提取物是通过该生物药剂产品的过滤而被引入的过滤器的可提取物。

3.检测生物药剂产品中的可提取物的一种方法，包括：

(a)制备一个参比样品，包括：

i)获得不含可提取物的生物药剂产品的一个参比样品；

ii)向该参比样品中加入一种含可提取物的标准物；

iii)通过液相色谱法对该参比样品进行分离；

iv)将该参比样品转向废液一段时间以除去该参比样品中对可提取物的检测造成基质干扰的污染物；并且

v)将剩余的参比样品通过一台质谱仪进行处理以获得一个参考质谱图；

(b)制备一个测试样品，包括：

i)获得可能含有可提取物的一种生物药剂产品的一个测试样品；

ii)通过液相色谱法对该测试样品进行分离；

iii)将该测试样品转向废液一段时间以除去该测试样品中对可提取物的检测造成基质干扰的污染物；并且

iv)将该剩余的测试样品通过一台质谱仪进行处理以获得一个测试质谱图；并且

(c)将该测试样品的质谱图与该参比样品的质谱图进行比较以检测该测试样品中的可提取物。

4.如权利要求3所述的方法，进一步包括确定检出的该可提取物的量。

5.如权利要求3所述的方法，其中，造成基质干扰的可提取物是选自下组，其构成为：活性药用成分、缓冲剂类、盐类、防腐剂类、增溶剂类、螯合剂类、酸类、碱类、糖类、氨基酸、溶剂类、蛋白质以及它们的组合。

6.如权利要求3所述的方法，其中，该可提取物是通过该生物药剂产品的过滤而被引入的过滤器的可提取物。

7.如权利要求3所述的方法，其中，该生物药剂产品是通过含聚偏氟乙烯微孔膜以及聚丙烯支撑膜的一个过滤器而被过滤的。

8.如权利要求3所述的方法，其中，该生物药剂产品是通过含硼硅酸盐玻璃纤维微孔膜以及聚丙烯支撑膜的一个过滤器而被过滤的。

9.如权利要求3所述的方法，其中，该生物药剂产品是通过含聚丙烯微孔膜以及聚丙烯支撑膜的一个过滤器而被过滤的。

10.如权利要求3所述的方法，其中，该生物药剂产品是通过含聚四氟乙烯微孔膜以及聚丙烯支撑膜的一个过滤器而被过滤的。

11.如权利要求3所述的方法，其中，该生物药剂产品是通过含亲水的聚醚砜微孔膜以及聚丙烯支撑膜的一个过滤器而被过滤的。

12.如权利要求3所述的方法，其中，使该生物药剂产品与包含超低密度聚乙烯、聚乙烯乙烯醇共聚物、以及乙烯醋酸乙烯酯的一个处理容器相接触。

13.如权利要求7所述的方法，其中，在该剩余的样品通过该质谱仪进行处理之前使前十分钟的该样品转向废液。

14.检测生物药剂产品中的过滤器的可提取物的一种方法，包括使用液相色谱质谱法(LCMS)来检测一种生物药剂产品中通过过滤而被引入的可提取物，其中检测了过滤器的可提取物的特征性离子。

15.检测生物药剂产品中的过滤器的可提取物的一种方法，包括使用液相色谱质谱法(LCMS)来检测一种生物药剂产品中通过过滤而被引入的可提取物的存在，其中检出了具有大约329.2和大约357.2M/Z的质量的过滤器的可提取物。

16.检测生物药剂产品中的过滤器的可提取物的一种方法，包括使用液相色谱质谱法(LCMS)来检测一种生物药剂产品中通过过滤而被引入的可提取物的存在，其中检测了过滤器的可提取物的特征性停留时间。

17.检测生物药剂产品中的过滤器的可提取物的一种方法，包括使用液相色谱质谱法(LCMS)来检测一种生物药剂产品中通过过滤而被引入的可提取物的存在，其中检出了具有大约11.5以及大约12.4分钟的平均停留时间的过滤器的可提取物。

18.检测生物药剂产品中的过滤器的可提取物的一种方法，包括：

(a)制备一个参比样品，包括：

i)获得不含通过过滤而被引入的可提取物的生物药剂产品的一个参比样品；

ii)向该参比样品中加入一种含可提取物的标准物；

iii)通过液相色谱对该参比样品进行分离；

iv)将该参比样品转向废液一段时间以除去该参比样品中对过滤器的可提取物的检测造成基质干扰的污染物；并且

v)将该剩余的参比样品通过一台质谱仪进行处理以获得一个参考质谱图；

(b)制备一个测试样品，包括：

i)获得可能含有通过过滤而被引入的可提取物的一种生物药剂产品的一个测试样品；

ii)通过液相色谱法对该测试样品进行分离；

iii)将该测试样品转向废液一段时间以除去该测试样品中对过滤器的可提取物的检测造成基质干扰的污染物；并且

iv)将该剩余的测试样品通过一台质谱仪进行处理以获得一个测试质谱图；并且

(c)将该测试样品的质谱图与该参比样品的质谱图进行比较以检测该测试样品中的过滤器的可提取物。

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