CN113866316B - 一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法。本发明采用高效液相法，按照下述色谱条件进行检测：色谱柱：丙基酰胺基团键合硅胶柱；流动相：体积比为60‑80:40‑20的乙腈水溶液；检测器：蒸发光散射检测器或示差检测器。本发明提供的检测方法能够用简便快捷的方法实现对醋酸钙片中聚乙二醇8000的准确定量检测，弥补了现有无法对醋酸钙片中聚乙二醇8000进行定量检测的不足，为提高和更好地控制醋酸钙片产品的质量提供了可靠保障，对于提高用药安全也具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法。
背景技术
慢性肾功能衰竭患者在肾功能下降到一定程度(内生肌酐清除率小于60mL/min)后会产生磷***障碍，血磷开始升高，但是透析率有限，无法有效快速降低血清磷浓度，而高血磷症常常会导致一系列的并发症，如继发性甲状旁腺功能亢进、心血管钙化、软组织或关节钙化等，严重影响人体功能，因此需要口服磷结合剂以减少食物中磷的摄入量。
醋酸钙片为作为磷结合剂，在消化道中可以与食物中的磷酸根结合形成不易吸收的不溶性磷酸盐-磷酸钙，之后由粪便排出体外，从而有效减少磷的吸收，降低血液中磷的浓度。另外，醋酸钙片与其他钙制剂相比，与磷的结合能力强且不易造成高钙血症。
醋酸钙片于1990年在美国审批上市，原研制剂为FRESENIUS MEDCL公司生产的，原研制剂及首仿制剂均已撤市。目前仿制药的参比制剂为Perrigo公司生产的醋酸钙片(PADDOCK LABORATORIES LLC)。现国内有5家企业生产并销售醋酸钙片，规格均为0.667g。
对参比制剂中各辅料的用量进行准确检测能够对仿制药的研发起到事半功倍的作用，使得仿制药的产品质量和疗效更加接近参比制剂。但是，由于醋酸钙片中醋酸钙占比达到95％以上，聚乙二醇8000含量较低，并且，醋酸钙与聚乙二醇8000较难实现分离，因此很难实现醋酸钙片中聚乙二醇8000的准确定量检测。
发明内容
针对现有检测方法难以实现醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的准确定量检测的问题，本发明提供一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法。本发明通过选择特定填料的色谱柱，并配合优选的流动相、流速、柱温等条件，实现了醋酸钙片中聚乙二醇8000的准确定量检测。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液和对照品溶液的配制：
取醋酸钙片用溶剂配制成供试品溶液；
取聚乙二醇8000对照品用溶剂配制成对照品溶液；
(2)按照下述高效液相色谱条件进行检测：
色谱柱：丙基酰胺基团键合硅胶柱；
流动相：体积比为60-80:40-20的乙腈水溶液；
检测器：蒸发光散射检测器或示差检测器。
发明人在研发过程中发现，醋酸钙的极性较强，若采用常规的C18色谱柱会导致醋酸钙出峰过早，且由于醋酸钙在产品中占比高达95％以上，因此，醋酸钙的出峰较宽，导致聚乙二醇8000的色谱峰与醋酸钙的色谱峰重合，不易实现聚乙二醇8000和醋酸钙的分离。且醋酸钙片中除了聚乙二醇8000还加入了硬脂酸镁作为润滑剂，若想实现聚乙二醇8000的定量检测，检测方法还应该能够有效分离醋酸钙和硬脂酸镁，才能保证聚乙二醇8000的定量检出。同时，由于醋酸钙片中聚乙二醇8000的常规用量仅为1％-3％左右，含量较低，因此，如何保证检测的准确度也是建立检测方法的难点之一。
本发明提供的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，采用丙基酰胺基团键合硅胶色谱柱，以特定比例的乙腈水溶液作为流动相，采用蒸发光散射检测器或示差折光检测器，通过高效液相色谱法，实现了醋酸钙片中聚乙二醇8000的有效检出，且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏度、准确度、重现性较好，能够用简便快捷的方法实现对醋酸钙片中聚乙二醇8000的准确定量检测，弥补了现有无法对醋酸钙片中聚乙二醇8000进行定量检测的不足，为提高和更好地控制醋酸钙片产品的质量提供了可靠保障，对于提高用药安全也具有十分重要的意义。
优选的，供试品溶液和对照品溶液的配制中，所述溶剂为水。
优选的，所述色谱柱的规格为250mm*4.6mm，填料直径为5μm。
进一步优选的，所述色谱柱为Venusil HILIC，4.6mm*250mm，5μm。
优选的色谱柱规格和型号可以提高聚乙二醇8000、硬脂酸镁辅料与醋酸钙主成分之间的分离度，且使聚乙二醇8000和醋酸钙的峰形较佳，从而有利于实现对醋酸钙片中含量较低的聚乙二醇8000辅料的定量检测，且结果准确可靠，重复性好。
优选的，所述流动相为体积比为70:30的乙腈水溶液。
优选的流动相更加适用于丙基酰胺基团键合硅胶柱，且能够在不产生基线干扰的前提下，更好地分离醋酸钙和聚乙二醇8000，并且能够有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。
优选的，柱温为35℃-45℃，流速为0.9mL/min-1.1mL/min。
进一步优选的，柱温为40℃，流速为1.0mL/min。
优选的，进样体积为20μL。
优选的，检测器温度为40℃。
优选的检测条件可使醋酸钙片中的聚乙二醇8000和醋酸钙达到更高的分离度，避免含量较高的醋酸钙原料对聚乙二醇8000的检测干扰，从而提高醋酸钙片中聚乙二醇8000含量检测的准确度和灵敏度。
优选的，所述检测器为蒸发光散射检测器。
优选的检测器能够获得更高的检测灵敏度，且色谱***更加稳定可靠。
优选的，所述供试品溶液的浓度为20.0mg/mL。
优选的，所述对照品溶液中聚乙二醇8000的浓度为0.1mg/mL-0.5mg/mL。
优选的供试品浓度有利于使含量较低的聚乙二醇8000获得更好的检出灵敏度，同时有效避免醋酸钙出峰较宽对聚乙二醇8000的干扰，从而有利于对供试品中聚乙二醇8000的含量进行更准确的计算。
本发明提供的检测方法，能够实现醋酸钙片中的聚乙二醇8000和醋酸钙的有效分离，准确定性及定量检测醋酸钙片中的聚乙二醇8000，对于提高醋酸钙片仿制药产品的质量和疗效具有十分重要的意义。
附图说明
图1为实施例2中2.1专属性项下标准曲线溶液2的色谱图；
图2为实施例2中2.1专属性项下醋酸钙溶液的色谱图；
图3为实施例2中2.1专属性项下对照品储备溶液的色谱图；
图4为实施例2中2.1专属性项下硬脂酸镁溶液的色谱图；
图5为实施例2中2.1专属性项下参比制剂溶液的色谱图；
图6为实施例2中2.1专属性项下仿制制剂溶液的色谱图；
图7为实施例2中2.3回收率项下中浓度溶液1的色谱图；
图8为实施例2中2.4耐用性项下乙腈-水比例为60:40的色谱图；
图9为对比例1中醋酸钙片参比制剂溶液的色谱图；
图10为对比例2中醋酸钙片参比制剂溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.1溶液的配制
(1)空白溶剂/稀释剂：水。
(2)供试品溶液：精密称取醋酸钙片细粉约500mg，置于25mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液。
(3)对照品溶液：精密称取聚乙二醇8000对照品适量，用水制成1mg/mL的溶液，分别精密量取1mL、2mL、3mL，分别置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Venusil HILIC(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈：水＝70：30(V/V)；
流速：1.0mL/min；
检测器温度：40℃；
柱温：40℃；
进样量：20μL。
取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，以各对照品溶液的峰面积的自然对数为横坐标，以各对照品溶液的浓度的自然对数为纵坐标，绘制线性回归方程，根据线性回归方程计算供试品溶液中聚乙二醇8000的含量。
实施例2
方法学验证：
2.1专属性
溶液的配制：
空白溶液：水。
对照品储备溶液：精密称取聚乙二醇8000对照品49.17mg，置50mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1mg/mL的对照品储备溶液。
标准曲线溶液1：精密量取上述对照品储备溶液1mL，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1mg/mL的标准曲线溶液1。
标准曲线溶液2：精密量取上述对照品储备溶液2mL，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2mg/mL的标准曲线溶液2。
标准曲线溶液3：精密量取对照储备溶液3mL，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.3mg/mL的标准曲线溶液2。
参比制剂溶液：精密称取Perrigo公司生产的醋酸钙片(批号7139311)细粉499.92mg，置于25mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，得浓度为20mg/mL的参比制剂溶液。
仿制制剂溶液：精密称取凯瑞德公司自制醋酸钙片(批号20181105)细粉201.20mg，置于10mL量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，得浓度为20mg/mL的仿制制剂溶液。
仿制制剂的辅料种类和辅料用量与参比制剂完全相同。
醋酸钙溶液：精密称取河北东风药业生产的(批号C20180420)醋酸钙原料939.26mg，置于50mL量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
硬脂酸镁溶液：精密称取硬脂酸镁细粉(罗恩试剂，批号RH119477)21.31mg，置于100mL量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
测定方法：精密量取上述各溶液各20μL，分别按照实施例1中的高效液相色谱条件进样检测，记录色谱图，结果如表1和表2所示。
表1专属性定位试验结果
| 名称 | 保留时间 | 峰面积 | 醋酸钙峰保留时间 | 醋酸钙峰面积 | 分离度 |
| 空白溶液 | 3.944 | 383.114 | — | — | — |
| 标准曲线溶液3 | 3.781 | 3948.401 | — | — | — |
| 醋酸钙溶液 | 3.946 | 488.800 | 9.005 | 55904.040 | 4.062 |
| 参比制剂溶液 | 3.854 | 3608.254 | 8.357 | 52270.010 | 3.369 |
| 仿制制剂溶液 | 3.810 | 2856.078 | 9.598 | 3973.541 | 16.458 |
| 硬脂酸镁溶液 | 3.987 | 609.912 | — | — | — |
表2专属性线性结果
试验结果表明，硬脂酸镁、醋酸钙与聚乙二醇8000的色谱峰不重合，硬脂酸镁和醋酸钙对聚乙二醇8000的检测无干扰；空白溶剂与聚乙二醇8000的色谱峰部分重合，聚乙二醇扣除空白后呈线性关系，r＝0.9977，r大于0.99，所以空白溶剂对聚乙二醇8000的含量检测无影响。
2.2检测限和定量限
溶液配制：
空白溶液：水。
对照品储备溶液：精密称取聚乙二醇8000对照品约49.17mg，置50mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限和定量限储备液：精密量取上述对照品储备溶液2mL，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密量取上述检测限和定量限储备液1mL，置20mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取定量限溶液3mL，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
取上述空白溶液、定量限溶液和检测限溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。定量限溶液连续进样检测5次，计算定量限连续测定5次的峰面积的重复性，试验结果见表3-5。
表3定量限试验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) | |
| 保留时间 | 3.832 | 3.842 | 3.844 | 3.846 | 3.831 | 3.839 | 0.18 |
| 峰面积 | 141.132 | 140.656 | 146.552 | 137.645 | 145.116 | 142.2202 | 2.53 |
| 信噪比 | 11.71 | 13.72 | 13.35 | 14.31 | 11.84 | / | / |
表4检测限试验结果
| 名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 信噪比 |
| 聚乙二醇8000 | 3.811 | 47.658 | 3.56 |
表5检测限和定量限试验结果
结论：聚乙二醇8000的检测限浓度为0.00295mg/mL，相当于样品的0.00559％，信噪比为3.56；聚乙二醇8000的定量限浓度为0.009834mg/mL，相当于样品的0.0197％，信噪比均大于10。聚乙二醇8000的定量限溶液连续进样5次的峰面积的RSD为2.53％，保留时间的RSD为0.18％。以上结果表明，本法的检测灵敏度高，适合醋酸钙片中聚乙二醇8000的定量检测。
2.3回收率
溶液配制：
空白溶液：水。
对照品储备溶液：精密称取聚乙二醇8000对照品52.34mg，置于50mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液1：精密量取对照储备溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液2：精密量取对照储备溶液2mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液3：精密量取对照储备溶液3mL，置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
回收率溶液：
低浓度溶液1：精密称取醋酸钙原料1442.64mg，聚乙二醇800016.32mg，硬脂酸镁15.11mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
低浓度溶液2：精密称取醋酸钙原料1443.11mg，聚乙二醇800014.06mg，硬脂酸镁14.99mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
中浓度溶液1：精密称取醋酸钙原料1449.26mg，聚乙二醇800019.14mg，硬脂酸镁15.67mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
中浓度溶液2：精密称取醋酸钙原料1451.23mg，聚乙二醇800019.28mg，硬脂酸镁15.77mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
高浓度溶液1：精密称取醋酸钙原料1439.46mg，聚乙二醇800024.46mg，硬脂酸镁15.52mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
高浓度溶液2：精密称取醋酸钙原料1443.62mg，聚乙二醇800023.41mg，硬脂酸镁14.96mg，置同一100mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
测定方法：取上述回收率溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表6-表7。
表6回收率线性结果
表7回收率结果
结论：由以上数据可知，聚乙二醇8000的回收率在96.67％～100.82％，平均值为98.8％，在95％～105％规定范围内，符合规定，准确度良好，说名本方法适用于醋酸钙片中聚乙二醇8000的含量检测。
2.4耐用性
溶液配制：
空白溶液：水。
对照品储备溶液：精密称取聚乙二醇8000对照品51.38mg，置于50mL容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液1：精密量取对照储备溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液2：精密量取对照储备溶液2mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液3：精密量取对照储备溶液3mL，置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
仿制制剂溶液：精密称取凯瑞德公司自制醋酸钙片(批号20181105)细粉约506.24mg，置于25mL量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，得浓度为20mg/mL的仿制制剂溶液。
测定方法：
分别考察流动相比例(乙腈:水＝60:40和80:20)，流速变化±0.1mL/min，柱温变化±5℃进行测定时，仪器色谱行为的变化，记录色谱图。
精密量取空白溶液、仿制制剂溶液和标准曲线溶液1-3各20μL，分别在上述色谱条件下进样检测，记录色谱图。结果如表8所示。
接受标准：仿制制剂溶液中聚乙二醇8000含量的RSD≤10％。
表8耐用性实验结果
结果显示，当检测条件在一定范围内(流速±0.1mL/min，柱温±5℃，流动相比例±20)发生变化时，聚乙二醇8000含量均值为1.44％，RSD为2.63％，小于10％，说明本方法耐用性良好。
实施例3
按照实施例1的色谱方法对三批自制仿制醋酸钙片(凯瑞德公司自制，批号20190701、20190702、20190703)以及参比制剂(Perrigo公司，批号7139311)进行检测，结果如表9所示。
表9
对比例1
将实施例1中的Venusil HILIC(4.6*250mm，5μm)色谱柱替换为Intersil ODS-3(4.6*250mm，5μm)色谱柱，其他色谱条件完全相同，对实施例1中的醋酸钙参比制剂溶液进行检测，记录色谱图，检测结果如表10所示。
表10
| 色谱柱 | 醋酸钙出峰时间(min) | 聚乙二醇出峰时间(min) |
| Venusil HILIC | 9.005 | 3.843 |
| Intersil ODS-3 | 3.658 | 3.765 |
结论：由上表可以看出，替换成Intersil ODS-3色谱柱后，醋酸钙与聚乙二醇8000未分开，方法的分离度不能满足要求。
对比例2
将实施例1中流动相中的乙腈替换为甲醇，其他色谱条件完全相同，对实施例1中的醋酸钙参比制剂溶液进行检测，记录色谱图，检测结果如表11所示。
表11
| 有机相 | 醋酸钙出峰时间 | 聚乙二醇出峰时间 |
| 乙腈-水(70:30) | 9.005 | 3.843 |
| 甲醇-水(70:30) | 3.867 | 4.325 |
结论：由上表可以看出，更换流动相后，醋酸钙和聚乙二醇8000的保留均变弱，出峰时间过快，无法实现醋酸钙与聚乙二醇8000的分离。
由对比例1和对比例2可以看出，采用其他C18色谱柱和流动相均无法达到本申请实施例中的检测效果，这说明本发明提供的检测方法能够实现对醋酸钙片中聚乙二醇8000的定性和定量，从而实现更有效地控制醋酸钙片中聚乙二醇8000的检出，提高产品有效性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液和对照品溶液的配制：
取醋酸钙片用水配制成供试品溶液；
取聚乙二醇8000对照品用水配制成对照品溶液；
（2）按照下述高效液相色谱条件进行检测：
色谱柱：丙基酰胺基团键合硅胶柱；
流动相：体积比为60-80:40-20的乙腈水溶液；
检测器：蒸发光散射检测器或示差检测器；
聚乙二醇8000含量扣除溶剂空白后进行计算。
2.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为250mm*4.6mm，填料直径为5μm。
3.如权利要求1或2所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Venusil HILIC，4.6mm*250mm，5μm。
4.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述流动相为体积比为70:30的乙腈水溶液。
5.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，柱温为35℃-45℃，流速为0.9mL/min-1.1mL/min。
6.如权利要求5所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，柱温为40℃，流速为1.0mL/min。
7.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，进样体积为20µL。
8.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述检测器为蒸发光散射检测器。
9.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为20.0mg/mL。
10.如权利要求1所述的醋酸钙片中聚乙二醇8000含量的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中聚乙二醇8000的浓度为0.1mg/mL-0.5mg/mL。
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