CN101810664B - 芫根总皂苷制备减肥降血脂药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从芫根植株中提取得到的芫根总皂苷制备减肥降血脂药物的用途,尤其是减少体重,达到减肥的目的,同时还能降低血清中TC、TG和LDL-C含量并升高HDL-C水平含量。
Description
技术领域
本发明涉及从芫根植株中提取得到的芫根总皂苷制备减肥降血脂药物的用途,属于药用天然产物领域。
背景技术
肥胖本身就是一种威胁人类健康的慢性疾病,同时也会伴随高血脂症、心脑血管疾病的发生,目前肥胖症已经成为全球关注的健康问题之一,因此研究开发出安全有效的减肥降血脂药物具有极大的临床和社会意义。
芫根(Brassica rapa L.),又名蔓菁,二年生草本,现广泛栽种于青藏高原。芫根生长在海拔高、温差大、日照强的高原环境中,适应能力强,产量高,营养丰富,通常作为饲料应用于畜牧业,其肉质根还可以作为蔬菜或果品供人食用,具有清热解毒、滋补增氧的功效。目前开发利用芫根的现有技术中,尚未见关于芫根总皂苷减肥降血脂功效方面的报道。皂苷广泛存在于自然界,在菌类、蕨类、单子叶、双子叶植物等中具有分布。大量研究显示,植物皂苷是植物生长过程中产生的代谢产物,具有抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒、抗生育和降低胆固醇、降低高血脂、抑制血栓形成等作用。因此,开发利用植物皂苷具有巨大的生物学、医学意义。本发明通过提取芫根总皂苷并对其进行减肥降血脂活性检测,拓宽了芫根综合开发利用的途径,为探索天然的、有效的减肥降血脂药物提供了理论依据,符合高原植物资源的有效利用和藏药新药开发的需要,有利于推动民族地区经济的发展。
发明内容
本发明的目的在于从芫根中提取具有生物活性的皂苷,将皂苷作为减肥降血脂药物,并寻找最适剂量,减少服用量且得到显著的治疗效果,以提供一种芫根总皂苷用于制备减肥降血脂药物的用途。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
从芫根根块中提取到总皂苷,得率为0.5~4重量%,呈固态棕黄色,易溶于乙醇,易溶于热水。以高脂饲料饲养的营养性肥胖大鼠作为模型对芫根总皂苷进行体内减肥降血脂活性检测;以大鼠前提脂肪细胞培养为模型对芫根总皂苷进行体外减肥活性检测,除非另有说明,本发明中的%为重量百分比。
本发明芫根总皂苷的制备方法具体为:
方法A:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)提取液减压浓缩后,溶于30~70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2~3,按1∶1~3体积加入石油醚萃取,除去亲脂性杂质;
(3)按1∶1~3体积加入正丁醇进行萃取,减压浓缩至无有机溶剂味的固体,得到粗制总皂苷;
(4)将粗制总皂苷加入少量甲醇至溶解,然后一边搅拌一边加入少量乙酸乙酯,混合均匀,析出总皂苷,反复处理3~9次,干燥后即得到精制总皂苷,该芫根总皂苷得率为0.5~2重量%,纯度为60~70%。
方法B:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)粗提液浓缩至原来的1/3后,利用大孔吸附树脂吸附,用1倍柱体积的水洗去水溶性杂质,例如糖等,改用30%~80%乙醇对其进行梯度洗脱,收集洗脱液;
(3)将洗脱液减压浓缩至无有机溶剂味固体,得到粗制总皂苷;
(4)将粗制总皂苷加入少量甲醇至溶解,然后一边搅拌一边加入少量乙酸乙酯,混合均匀,析出总皂苷,反复处理3~9次,干燥后即得到精制总皂苷,该芫根总皂苷得率为0.8~3重量%,纯度为65~90%。
方法C:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)将粗提液浓缩,加入30℃~70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2~3,2000~3000rp离心20~30min得到沉淀和上清液两部分;
(3)将沉淀物加入50~95%乙醇进行回流提取,将过滤液浓缩、干燥得到一部分总皂苷;
(4)将上清液减压浓缩,2000~3000rpm离心20~30min,用水洗沉淀物,干燥得到另一部分总皂苷;
(5)合并以上两个部分得到总皂苷,该芫根总皂苷得率为1~4重量%,纯度为60~75%。
所述制备方法中的芫根原料均为芫根的块根,经切片后自然风干,然后粉碎得到粉状物,粉碎细度达到40~200目;
上述方法B中所用的大孔吸附树脂为D101或SA-3或AB-8;上述方法A、B中所用的甲醇为无水或含水甲醇,所用乙酸乙酯浓度为100%。
所述干燥方法为减压真空干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
采用制备药物制剂的常规方法和助剂,将芫根总皂苷制备成各种制剂,例如粉剂、片剂、胶囊、颗粒剂、缓释片、缓释胶囊、滴丸或液体制剂等。上述制剂应用于临床治疗肥胖症、高血脂症及制成含芫根总皂苷减肥降脂保健品。
本发明用Liebermann反应检测所提的芫根总皂苷,反应中溶液呈黄→红→蓝→紫→绿色变化,可以确定其为皂苷类化合物。总皂苷的定量测定是利用苷元与香兰素的硫酸试剂发生的显色反应,产生有色物质,以齐墩果酸为标准品绘制标准曲线,利用紫外分光光度法测定总皂苷纯度。
通过上述方法制备的芫根总皂苷在减肥降血脂方面有显著的效果。在营养性肥胖大鼠体内实验中,当芫根总皂苷的剂量≥0.8g/kg·d时,大鼠体重、lee’s指数、睾丸周围脂肪系数及血脂指标均显示出显著减肥降血脂效果。在大鼠前体脂肪细胞培养实验中,当芫根总皂苷的剂量≥200μg/ml时,芫根总皂苷显示出显著的抑制大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的作用。
本发明方法得到的芫根总皂苷原料易得,方法简单,生产成本低,产品中总皂苷含量较高,质量稳定、易于控制。
具体实施方式:
实施例1、
采用方法A,取晒干芫根块根粉碎至100目,用3倍体积50%乙醇,在30℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。30℃减压旋转蒸发浓缩滤液,将所得浸膏溶于30℃热水,浸膏体积/水体积为1∶2.5,按1∶1体积加入石油醚对其进行萃取,除去脂溶性杂质。再用正丁醇反复萃取3次,减压回收正丁醇后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶0.5),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,冷冻干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为0.75%,纯度为61%。
实施例2
采用方法A,取晒干芫根块根粉碎至40目,用6倍体积75%乙醇,在70℃的水浴中搅拌6h,抽滤得到粗提液,反复提取2次,合并滤液。70℃减压旋转蒸发浓缩滤液,将浸膏溶于70℃热水,浸膏体积/水体积为1∶2,按1∶2体积加入石油醚对其进行萃取,除去脂溶性杂质。再用正丁醇反复萃取5次,减压回收正丁醇后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶0.8),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,45℃减压真空干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.27%,纯度为65%。
实施例3
采用方法A,取晒干芫根块根粉碎至200目,用10倍体积95%乙醇,在65℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。65℃减压旋转蒸发浓缩滤液,将浸膏溶于65℃热水,浸膏体积/水体积为1∶2,按1∶1体积加入石油醚对其进行萃取,除去脂溶性杂质。再用正丁醇反复萃取6次,减压回收正丁醇后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶0.5),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,45℃减压真空干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.34%,纯度为67%。
实施例4、
采用方法B,取晒干芫根块根粉碎粉碎至100目,用3倍体积80%乙醇,在40℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。40℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3。将浓缩液经过大孔吸附树脂D101,使液体中的皂苷吸附于树脂,弃去流出液,再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱,弃去流出液,继而分别用3倍柱体积的30%、60%、90%乙醇进行梯度洗脱,并收集洗脱液,减压浓缩后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶1),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,40℃减压真空干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.37%,纯度为65%。
实施例5
采用方法B,取晒干芫根块根粉碎粉碎至100目,用6倍体积95%乙醇,在65℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。65℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3。将浓缩液经过大孔吸附树脂D101,使液体中的皂苷吸附于树脂,弃去流出液,再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱,弃去流出液,继而分别用2倍柱体积的20%、40%、60%、80%、90%乙醇进行梯度洗脱,并收集洗脱液,减压浓缩后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶0.7),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,45℃减压真空干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为2.96%,纯度为69%。
实施例6、
采用方法B,取晒干芫根块根粉碎粉碎至40目,用10倍体积60%乙醇,在70℃的水浴中搅拌12h,抽滤得到粗提液,反复提取2次,合并滤液。70℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3。将浓缩液经过大孔吸附树脂AB-8,使液体中的皂苷吸附于树脂,弃去流出液,再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱,弃去流出液,继而分别用2倍柱体积的20%、40%、60%、80%、90%乙醇进行梯度洗脱,并收集洗脱液,减压浓缩后得到粗总皂苷。将得到的粗总皂苷溶于少量无水甲醇,然后滴入乙酸乙酯(体积比为1∶0.5),搅拌混匀,有总皂苷析出。反复处理5次,收集析出的总皂苷,45℃减压真空干燥。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.21%,纯度为74%。
实施例7、
采用方法C,取晒干芫根块根粉碎至100目,用3倍体积60%乙醇,在40℃的水浴中搅拌12h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。滤液经减压浓缩得到浸膏,溶于40℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2.5,后以3000rpm的速度离心20min,分离上清液和沉淀。将沉淀物用3倍生药体积的60%乙醇进行回流提取,过滤浓缩,40℃减压真空干燥得到总皂苷;将上清液减压浓缩,3000rpm离心20min,用水洗沉淀物,45℃减压真空干燥得到另一部分总皂苷,合并两部分总皂苷。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.2%,纯度为61%。
实施例8
采用方法C,取晒干芫根块根粉碎至100目,用6倍体积75%乙醇,在70℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取2次,合并滤液。滤液经减压浓缩得到浸膏,溶于70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2,后以2500rpm的速度离心30min,分离上清液和沉淀。将沉淀物用3倍生药体积的95%乙醇进行回流提取,过滤浓缩,45℃减压真空干燥得到总皂苷;将上清液减压浓缩,2500rpm离心30min,用水洗沉淀物,45℃减压真空干燥得到另一部分总皂苷,合并两部分总皂苷。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为1.48%,纯度为64%。
实施例9
采用方法C,取晒干芫根块根粉碎至200目,用10倍体积90%乙醇,在70℃的水浴中搅拌8h,抽滤得到粗提液,反复提取4次,合并滤液。滤液经减压浓缩得到浸膏,溶于70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2,后以3000rpm的速度离心30min,分离上清液和沉淀。将沉淀物用5倍生药体积的90%乙醇进行回流提取,过滤浓缩,45℃减压真空干燥得到总皂苷;将上清液减压浓缩,3000rpm离心30min,用水洗沉淀物,45℃减压真空干燥得到另一部分总皂苷,合并两部分总皂苷。所得芫根总皂苷为棕黄色,得率为2.9%,纯度为70%。
实施例10
片剂:取芫根总皂苷50g,加入50g可压淀粉和40g羧甲基淀粉钠,混合均匀,以70%的乙醇为润湿剂,制软材,18目筛制粒,烘干,16目筛整粒,加入3g硬脂酸镁为润滑剂,混合均匀,压片、包衣,制成1000片包衣片。
实施例11
胶囊:取芫根总皂苷50g,加入80g可压淀粉和20g羧甲基纤维素钠,混合均匀,以70%的乙醇为湿润剂,制软材,24目筛制粒,烘干,20目筛整粒,加入3g硬脂酸镁,混合均匀,装胶囊,制成1000粒胶囊。
实施例12
颗粒剂:取芫根总皂苷100g,加入450g蔗糖粉、100g梭甲基纤维素钠、100g微晶纤维素和50g柠檬酸,混合均匀,以3%PVP为润湿剂制软材,20目筛制粒,烘干,18目筛整粒,分装,制成粒径为830~880μm的1000袋颗粒剂。每袋重0.72~0.78g。
实施例13
粉针剂:取芫根总皂苷12g,羟丙基-p-环糊精135g,加注射用水3L,搅成糊状,再加70℃~85℃的注射用水3L,溶解时温度控制在70℃~85℃,加甘露醇450g溶解,再用1moL/L盐酸溶液调pH值至5.6,加入针用炭后室温搅拌,过滤脱炭,精滤。滤液按每只2ml进行分装,采用速冻法干燥,将制品取出,进行封口,即得到性状为白色疏松块状物或粉末,即得粉针剂。
实施例14
滴丸:将150g聚乙二醇4000在水浴上加热得熔融液,趁热加入芫根总皂苷50g,搅拌均匀,65℃保温1小时,用滴丸机滴制,滴速120滴/分钟,滴制温度65~75℃,在15℃左右的液体石蜡中冷却,制得丸重约60mg,干燥,包衣,即得滴丸。
实施例15
口服液:取蒸馏水适量,加入20g芫根总皂苷、180g蔗糖粉、20g柠檬酸,搅拌溶解,过滤,滤液补充蒸馏水至10000ml,加入香精适量,搅拌均匀,分装,每支10ml,压盖,100℃消毒1小时,检查合格,即得口服液。
实施例16
粉剂:取芫根总皂苷30g,粉碎成粒径为20μm粉状物,加入500g蔗糖粉、100g梭甲基纤维素钠、100g微晶纤维素混合均匀,分装,制成1000袋粉剂。每袋重0.68~0.73g。添加量为食品或饲料的0.01~1%。
将上述实施例5制备所得的芫根总皂苷进行如下效果实验:
1、营养性肥胖大鼠检测芫根总皂苷减肥降血脂活性实验
SD大鼠60只(80±20g)随机分为6组,除空白组喂食基础饲料以外,每组均给予等量高脂饲料,每只每天20g。4周以后测得体重高于空白组15%,开始灌胃。实验组每天分别灌胃50mg/kg·d、200mg/kg·d、800mg/kg·d芫根总皂苷。空白组、高脂组灌以等量蒸馏水,阳性对照组灌以盐酸***2.5mg/kg·d。给药3周之后检测大鼠体重、身长,计算lee’s指数,眼眶静脉丛采血,用试剂盒测血清中总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白HDL-c、低密度脂蛋白LDL-c值。处死后解剖检测大鼠睾丸脂肪湿重。结果见表1、表2、表3、表4。
表1.芫根总皂苷对大鼠体重、身长和lee’s指数的影响
*表示与高脂组比较,0.01<p<0.05,**表示与高脂组比较p<0.01
表2、芫根总皂苷对大鼠睾丸周围脂肪湿重及其脂肪系数的影响
*表示与高脂组比较,0.01<p<0.05,**表示与高脂组比较p<0.01
表3、大鼠血清总胆固醇TC、甘油三酯TG
TC mmol/l TG mmol/l
空白组 2.078±0.245** 0.659±0.092**
高脂组 3.560±0.454 0.991±0.173
阳性对照 2.612±0.503** 0.949±0.173
50mg/kg·d 2.959±0.746 0.565±0.141**
200mg/kg·d 2.875±0.700 0.701±0.627*
800mg/kg·d 2.553±0.561** 0.609±0.184**
*表示与高脂组比较,0.01<p<0.05,**表示与高脂组比较p<0.01
表4.大鼠血清高密度脂蛋白HDL-c、低密度脂蛋白LDL-c
HDL-C mmol/l LDL-C mmol/l
空白组 0.691±0.042** 2.126±0.260*
高脂组 0.459±0.079 3.191±0.766
阳性对照 0.667±0.058** 2.310±0.363*
50mg/kg·d 0.682±0.012** 2.191±0.333*
200mg/kg·d 0.761±0.116** 2.161±0.161*
800mg/kg·d 0.733±0.112** 1.980±0.269*
*表示与高脂组比较,0.01<p<0.05,**表示与高脂组比较p<0.01
2、大鼠前体脂肪细胞培养
将体重为80g的幼年SD大鼠断颈处死,无菌操作取出睾丸周围脂肪组织,剪成1mm3左右的碎块,用I型胶原酶37℃消化1h~2h。用200目尼龙筛过滤后,1000~1500rpm离心10~20min。弃去上清液,加入红细胞裂解液,室温放置10min,加入10%小牛血清的αMEM,按5×104个/cm2密度接种于2个96孔培养板,至于37℃50ml/LCO2培养箱培养。1天后如下更换培养液:空白组为不含样品的10%小牛血清的αMEM;含总皂苷分别50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的三个剂量的10%小牛血清αMEM培养液,每2天更换一次培养液,8天后用MTT法检测细胞增殖情况。另一块96孔板用基础培养液培养4天后更换为上述含样品培养液,培养72h,用油红O染色法检测细胞分化情况。结果如表5、表6。
表5、MTT法检测前体脂肪细胞增殖各组OD490nm
*表示与空白组比较,0.01<p<0.05,**表示与空白组比较p<0.01
表6、油红O染色法检测前体脂肪细胞分化各组OD500nm
*表示与空白组比较,0.01<p<0.05,**表示与空白组比较p<0.01
上述实验结果表明,本发明的芫根总皂苷在各剂量,均显示出显著的减肥降血脂活性。可利用芫根总皂苷制备药物或者保健食品用于预防或者治疗肥胖症及高血脂症。
本发明的芫根总皂苷的制备方法和用途已经通过具体的实例进行了描述,本领域技术人员可借鉴本发明内容,适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的,其相关改变都没有脱离本发明的内容,所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的,都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (3)
1.芫根总皂苷用于制备减肥降血脂药物的用途,其中芫根总皂苷是通过如下方法制备得到的:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)提取液减压浓缩后,溶于30~70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2~3,按1∶1~3体积加入石油醚萃取,除去亲脂性杂质;
(3)按1∶1~3体积加入正丁醇进行萃取,减压浓缩至无有机溶剂味的固体,得到粗制总皂苷;
(4)将粗制总皂苷加入少量甲醇至溶解,然后一边搅拌一边加入少量乙酸乙酯,混合均匀,析出总皂苷,反复处理3~9次,干燥后即得到精制总皂苷,该芫根总皂苷得率为0.5~2重量%,纯度为60~70%。
2.芫根总皂苷用于制备减肥降血脂药物的用途,其中芫根总皂苷是通过如下方法制备得到的:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)粗提液浓缩至原来的1/3后,利用大孔吸附树脂吸附,用1倍柱体积的水洗去水溶性杂质,例如糖等,改用30%~80%乙醇对其进行梯度洗脱,收集洗脱液;所述的大孔吸附树脂为D101或SA-3或AB-8;
(3)将洗脱液减压浓缩至无有机溶剂味固体,得到粗制总皂苷;
(4)将粗制总皂苷加入少量甲醇至溶解,然后一边搅拌一边加入少量乙酸乙酯,混合均匀,析出总皂苷,反复处理3~9次,干燥后即得到精制总皂苷,该芫根总皂苷得率为0.8~3重量%,纯度为65~90%。
3.芫根总皂苷用于制备减肥降血脂药物的用途,其中芫根总皂苷是通过如下方法制备得到的:
(1)将芫根原料置于提取釜中,加入3~10倍生药体积的低级醇,低级醇为C1~C5醇类,其浓度为50~95%,提取温度为30~70℃,匀速搅拌6~12h,过滤得到滤液,并反复提取1~4次,合并滤液得到粗提液;
(2)将粗提液浓缩,加入30℃~70℃热水,浸膏与水的体积比为1∶2~3,2000~3000rp离心20~30min得到沉淀和上清液两部分;
(3)将沉淀物加入50~95%乙醇进行回流提取,将过滤液浓缩、干燥得到一部分总皂苷;
(4)将上清液减压浓缩,2000~3000rpm离心20~30min,用水洗沉淀物,干燥得到另一部分总皂苷;
(5)合并以上两个部分得到总皂苷,该芫根总皂苷得率为1~4重量%,纯度为60~75%。
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