CN101808668A - 药物内包活性靶向型高分子微团、医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种能够防止不适当地释放药物而损伤正常细胞的药物内包活性靶向型高分子微团。该高分子微团(100)，包括具有标的结合部位(11)的骨架聚合物单元(10)、和具有药物(14)而不具有标的结合部位(11)的骨架聚合物单元(20)，这些单元(10)、(20)，以标的结合部位(11)朝向外侧并且药物(14)朝向内侧的状态呈放射状排列，i)当在维持放射状排列的状态下与标的(40)结合时，通过胞吞作用被摄入供给标的(40)的细胞(50)的内部，放射状排列在细胞(50)内崩解，由此使药物(14)在细胞(50)内释放，ii)当与标的(40)结合之前在血液(60)中放射状排列崩解时，单元(20)通过代谢排出体外，由此能够防止药物(14)对正常细胞造成损伤。

Description

药物内包活性靶向型高分子微团、医药组合物
技术领域
本发明涉及具有对肿瘤细胞、炎症细胞、免疫活性细胞、新生血管和血管内皮等给药对象物的指向性的活性靶向型药物内包高分子微团，以及利用该微团得到的医药组合物。
背景技术
如果通过口服或者静脉注射将药物向全身给药，则不仅向作为给药对象物的病灶部位供给药物，而且也向正常组织供给药物。结果产生由药物投与所导致的副作用，因而有时需要改变或者中断治疗方法。以降低副作用为目的，具有与给药对象物固有的受体、配体和酶等分子标记物特异性结合能力的称为分子标的药的药物被开发(参照非专利文献1)。但是，目前为止，这样的分子标的药不能充分降低例如已知的由吉非替尼(Gefitinib)给药造成间质性肺炎的发生事例这样的副作用，并且，对病灶部位的治疗效果也不充分。
从将药物选择性供给给药对象物，并且在给药对象物附近维持最适的药物浓度的观点出发，被称为药物递送***(Drug DeliverySystem，DDS)的技术受到瞩目。专利文献1公开了药物和配体处于结合在合成聚合物上的状态的活性靶向型的高分子结合DDS。
专利文献1：国际公开第2002/087497号小册子
非专利文献1：Asahina H，Yamazaki K，Kinoshita I，et al.，BritishJournal of Cancer，95，2006，p.p.998-1004
发明内容
从降低副作用的观点出发，期望将未能准确送达至给药对象物的药物在损伤正常细胞之前从体内除去。专利文献1中所记载的高分子结合物，是将药物和配体结合在一个合成聚合物链上，因此，当与对应的受体结合但是没有被摄入作为给药对象物的细胞内时，药物就会持续暴露在血液中。因此，这样的现有的活性靶向型DDS，为了降低副作用，还有进一步改善的余地。
本发明目的在于提供一种药物内包活性靶向型高分子微团，包括具有标的结合部位的骨架聚合物单元α、和具有药物而不具有上述标的结合部位的骨架聚合物单元β，上述骨架聚合物单元α和骨架聚合物单元β，以上述标的结合部位朝向外侧并且上述药物朝向内侧的状态呈放射状排列，i)当在维持上述放射状排列的状态下与标的结合时，通过胞吞作用被摄入供给该标的的细胞的内部，上述放射状排列在上述细胞内崩解，由此使上述药物在该细胞内释放，ii)当与标的结合之前在血液中上述放射状排列崩解时，上述骨架聚合物单元β通过代谢排出体外，由此能够防止上述药物对正常细胞造成损伤。
本说明书中，骨架聚合物单元α含有的标的结合部位，是指可以对机体或者病毒来源的物质特异性结合从而形成与该物质的生物学上的结合对、具有生物学上的识别机能的部位。作为机体和病毒来源的物质，能够例示存在于机体细胞、细菌、真菌和病毒中的分子。作为机体细胞，能够例示肿瘤细胞和新生血管细胞及其周边的细胞、免疫活性细胞(例如B细胞)、炎症细胞(例如白血球)、血管内皮细胞、构成各种脏器的细胞。骨架聚合物单元α，通过含有与这些物质形成结合对的蛋白质、肽和糖链等化合物，处于含有标的结合部位的状态。
另一方面，本发明也提供含有上述高分子微团和制药学上可接受的载体的医药组合物。
发明的效果
本发明中，通过在不同的聚合物单元上分别含有药物和标的结合部位，为微团组装了安全机构，该安全机构能够在微团结构被摄入作为给药对象物的细胞之前崩解时，通过代谢将药物排出体外。由此，与现有的活性靶向型DDS相比，容易避免副作用的产生。
附图说明
图1是用于表示本发明的高分子微团对癌细胞的损伤作用的数据的一个例子的图。
图2是用于表示本发明的高分子微团对癌细胞的损伤作用的数据的另外的例子的图。
图3是用于表示由本发明的高分子微团的给药引起的肿瘤体积的经时变化的数据的图。
图4是用于表示由本发明的高分子微团的给药引起的被检测动物的体重的经时变化的数据的图。
图5是用于表示不含药物的活性靶向型高分子微团对癌细胞的损伤作用的数据的一个例子的图。
图6是用于说明本发明的高分子微团的构造和作用的模式图。
具体实施方式
本发明的高分子微团100，如图6的a)所示，具有骨架聚合物单元α10和骨架聚合物单元β20。骨架聚合物单元α10具有含有标的结合部位11的化合物、以聚乙二醇链为代表的亲水性聚合物片段12、以及以聚氨基酸链为代表的疏水性聚合物片段13。另外，下文有时以PEG表示聚乙二醇。标的结合部位11结合在亲水性聚合物片段12上。骨架聚合物单元β20具有药物14、以聚乙二醇链为代表的亲水性聚合物片段12、以及以聚氨基酸链为代表的疏水性聚合物片段13。药物14以酯键或者酰胺键结合在疏水性聚合物片段13上。这样，骨架聚合物单元α10具有标的结合部位11但不具有药物14，而骨架聚合物单元β20具有药物14但不具有标的结合部位11。这样，骨架聚合物单元α10和骨架聚合物单元β20以标的结合部位11朝向外侧、药物14朝向内侧的状态呈放射状排列。高分子微团100，如图6的a)所示，也可以含有不具有标的结合部位11和药物14、由亲水性聚合物片段12和疏水性聚合物片段13形成的骨架聚合物单元γ30。
本说明书中，骨架聚合物单元α10和骨架聚合物单元β20呈放射状排列，是指只要是标的结合部位11朝向外侧而药物14朝向内侧的凝聚状态即可，也可以是各单元的排列起点不集中于一点，具有稍微崩解的放射状排列的构造的微团。高分子微团100也可以是由骨架聚合物单元α10和骨架聚合物单元β20形成的高分子凝聚体处于干燥状态的物质。
高分子微团100，如图6的b)所示，当在维持放射状排列的状态下结合于标的40时，通过胞吞作用被摄入供给标的40的细胞50的内部(图6的b)中的中央表示)，之后，放射状的排列在细胞50内崩解，由此内包的药物14在细胞50内释放。更具体而言，骨架聚合物单元β20移行入细胞50内的溶酶体内，利用以脂酶为代表的酶切断酯键从而使药物14释放。
作为分子量为数万以下的高分子，原则上通过肾脏迅速从尿中***。因此，即使高分子微团100的放射状排列如图6的c)所示那样在被摄入给药对象物之前崩解从而使药物14处于在血液60中暴露的状态，分子量为数万以下的骨架聚合物单元β20也不会固定于标的40而使药物14持续暴露于血液60中，从而通过代谢迅速地排出体外。这样，在高分子微团100中组装有安全机构，防止在被摄入给药对象物之前微团构造崩解时导致药物对正常细胞造成损伤。
优选骨架聚合物单元α优选以通式I：Z-A1-B1表示，由具有标的结合部位的化合物和嵌段共聚物形成，骨架聚合物单元β优选以通式II：A2-B2(-D)表示，由药物和嵌段共聚物形成。其中，Z是具有标的结合部位的化合物，A1和A2是相互独立的聚乙二醇链片段，B1和B2是相互独立的聚氨基酸链片段，D是药物。
骨架聚合物单元α，能够通过将在聚乙二醇链片段的α末端具有羟基、羧基、醛基、氨基、巯基、马来酰亚胺基等连接基团的嵌段共聚物与具有标的部位的化合物通过缩合或者加成反应形成。
骨架聚合物单元β的聚乙二醇链片段的α末端，可以具有如羟基这样的上述连接集团，但是优选具有碳原子数在1～12的范围内(C1-C12)的直链或者具有支链的烷基或烷氧基，或者羟基。
作为聚氨基酸链片段，能够列举聚谷氨酸或者其酯或酰胺衍生物、聚天冬氨酸或者其酯或酰胺衍生物。这样的酯或酰胺衍生物，能够通过使具有疏水性有机基团相应的羟基化合物或氨基化合物与聚谷氨酸或聚天冬氨酸的反应性衍生物(例如酯)反应而形成。作为疏水性有机基团，能够列举具有碳原子数在1～6的范围内(C1-C6)的烷基苯酚、胆固醇、直链或者具有支链的碳原子数在8～18的范围内(C8-C18)的烷基。
骨架聚合物单元α和骨架聚合物单元β中的嵌段共聚物，例如，能够以日本特开平2-300133号公报中记载的方法形成，该方法中，以Y-PEG-CH2CH2CH2-NH2(Y表示官能团或取代基或者被保护的官能团或取代基)为引发剂，在脱水后的有机溶剂中，添加N-羧基-γ-苯甲基-L-谷氨酸酯或者N-羧基-β-苯甲基-L-天冬氨酸酯以达到期望的聚合度，使其反应。导入比苯甲基体积大的疏水基团时，可以用C4烷基-苯基、胆固醇、C8～C18的烷基取代苯甲基。这样的疏水基团，可以使用二环己基碳二亚胺以及二异丙基碳二亚胺这样的缩合剂，在脱水后的有机溶剂中，将具有羟基或氨基的疏水性化合物导入聚谷氨酸侧链中。
骨架聚合物单元α，优选具有下述通式I-a或者通式I-b所示的结构，骨架聚合物单元β，优选具有下述通式II-a或者通式II-b所示的结构。
Figure GPA00001062781100051
其中，R1是具有标的结合部位的化合物，R2是碳原子数在1～12的范围内的烷基或者是末端具有羟基的碳原子数在1～12的范围内的烷基，L1是O(CH2)pNH，L2是O(CH2)p-CO-，p是1～5范围内的整数，R是氢原子或者疏水性有机基团，q是1或2，n1和n2是相互独立的40～450范围内的整数，m1和m2是相互独立的20～80范围内的整数，R3是药物残基或者总数m2的至少10～70％具有连接基团的药物残基，当存在时，其它的基团为氢原子或者疏水性有机基团。
n1和n2都优选为40～450范围内的整数，更优选70～350范围内的整数，特别优选110～280范围内的整数。m1和m2都优选为20～80范围内的整数，更优选25～50范围内的整数。n1、n2、m1、m2的数值为平均值。
高分子微团100中，骨架聚合物单元α10和骨架聚合物单元β20的摩尔比处于1∶19～19∶1的范围内。
作为具有标的结合部位11的化合物，如上所述，能够列举与机体和病毒来源的物质形成结合对的蛋白质、肽或者糖链。作为这样的蛋白质，能够列举与机体和病毒来源的物质结合的抗体及其片段、铁传递蛋白以及上皮生长因子(EGF)。作为抗体，可以列举识别作为在以癌细胞为代表的给药对象物的表面高表达的受体和细胞表面抗原的EGFR、Her2、CD20、VEGFR和CD52等抗原的抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。作为抗体的片段，可以是具有能够特异识别抗原的长度的片段，能够列举(Fab’)2和Fab。作为肽，能够列举胰岛素、LHRH、IGF以及它们的衍生物。作为糖类，能够列举具有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖残基的糖类。
当具有标的结合部位11的化合物用于形成结合对的标的40为病毒来源的物质时，供给该物质的细胞因感染的病毒破坏细胞膜而处于细胞死亡的状态，因此，不能通过胞吞作用将高分子微团100摄入细胞内。因此，本说明书中，当标的40为病毒来源的物质时，将标的40的周边存在的细胞作为供给标的40的细胞处理。当病毒来源的物质存在于细胞外时，其周边的细胞也被病毒感染的可能性高，因此具有对该周边细胞供给药物的意义。
作为药物14，能够列举核酸衍生物、多西紫杉醇、喜树碱类、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D以及这些埃博霉素类的衍生物、西罗莫司、依维莫司、曲贝替定、伏立诺他、醋酸奥曲肽、米托蒽醌、长春新碱、头孢氨苄、头孢克洛、氨苄西林、巴氨西林、阿莫西林、卡那霉素、阿米卡星、阿贝卡星、地贝卡星、西索米星、妥布霉素、红霉素、克拉霉素、罗他霉素、氯霉素、万古霉素、氟康唑、阿糖腺苷、阿昔洛维、去羟肌苷、齐多夫定、扎西他滨、拉米夫定、扎那米韦、奥塞米韦、洛匹那韦、利托那韦。作为核酸衍生物，能够列举吉西他滨、奈拉滨(Nelarabine)、克罗拉滨(Clofarabine)、地西他滨(Decitabine)、链佐星(Streptozocin)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、氟达拉滨。核酸衍生物也可以是盐，但在通过酯键使其结合在骨架聚合物单元β上时，优选不是盐的物质。作为艾博霉素类的衍生物，能够列举Patupilone、Ixabepilone、BMS-310705、KOS-862、ZK-EPO。
当药物中存在多个羟基时，骨架聚合物单元β可以形成该羟基中的一个以上以酯键结合在聚谷氨酸侧链的羧基上的构造。本说明书中，骨架聚合物单元β中也包括1个药物以酯键结合于聚谷氨酸侧链中的多个羧基上的构造、以及两个以上的嵌段共聚物部分通过一个药物而交联的构造。
本发明的高分子微团，例如，能够通过将骨架聚合物单元α和骨架聚合物单元β在水性溶液中混合，使其自组装成微团状而形成。另外，例如，本发明的高分子微团，能够通过在将骨架聚合物单元β和骨架聚合物单元γ在水性溶液中混合、使其自组装成微团状之后，将具有标的结合部位的化合物结合在骨架聚合物单元γ的亲水性片段的α末端上而形成。水性溶液，例如，能够通过在精制水中添加乙醇和二甲基亚砜等可与水混合的有机溶液和公知的缓冲剂而形成。准备具有相互不同的标的结合能力的多种骨架聚合物单元α，和结合有相互不同的药物的多种骨架聚合物单元β，通过分别适当进行组合，能够容易地形成各种活性靶向型药物内包高分子微团，非常方便。
以专利文献1中记载的高分子结合物为代表的现有的活性靶向型DDS，通过在以酯键结合有药物的嵌段共聚物上，结合具有标的结合部位的化合物而形成。但是，在使药物结合在嵌段共聚物上的过程中，在嵌段共聚物中用于结合具有标的结合部位的化合物的官能团或者取代基有可能失去与该化合物结合的能力。另外，在结合该化合物的过程中，药物有可能发生分解。因此，现有的活性靶向型DDS难以简便地进行调制。另一方面，如上所述，本发明的高分子微团不仅能够避免药剂的失活，还能够容易地形成各种活性靶向型内包高分子微团。
根据本发明，能够提供含有上述的高分子微团和制药学上可接受的载体的医药组合物。制药学上可接受的载体，根据目的的给药剂型，可以是该技术领域中常用的稀释剂以及赋形剂，但是优选适用于调制作为非口服药剂的液剂、冷冻干燥剂的精制水、去离子水、等渗剂以及pH调整剂。
本发明的医药组合物的给药方法，优选皮下、静脉、动脉、局部等的非口服给药方法。医药组合物的给药量可以根据药物的种类、用法、患者的年龄、性别、患者的健康状态等进行适当调整，以药物进行换算，以每天0.1～10000mg/m2的范围、优选1～1000mg/m2的范围给药。
实施例
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明。
(实施例1)
如下操作形成作为高分子微团的铁传递蛋白结合喜树碱微团，该高分子微团中，具有铁传递蛋白作为具有标的结合部位的化合物，内包喜树碱(CPT)作为药物。
首先，作为骨架聚合物单元β，如下操作形成喜树碱结合物(PEG-pGlu-CPT)。使1g的PEG-pGlu-Ac在80mL的无水二甲基甲酰胺(无水DMF)中溶解后，添加387mg的喜树碱(和光纯药)。另外，该PEG-pGlu-Ac中的PEG链长为12kDa，天冬氨酸的平均残基数为40，天冬氨酸的侧链为羧酸。接着，依次添加823mg的N，N’-二异丙基碳二亚胺(国产化学)和136mg的二甲基氨基吡啶(和光纯药)，在4℃搅拌3天，升温至室温之后进一步搅拌过夜。将这样得到的反应液移至透析管(Spectrum Laboratories，Spectra/Por
Figure GPA00001062781100081
，截留分子量值为3500)，相对于精制水，在4℃进行透析。除去白色沉淀之后，将得到的黄色溶液以孔径为0.8μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100091
-AA)进行过滤。将滤液冷冻干燥，由此得到1.1g淡黄色粉末的PEG-pGlu-CPT。该PEG-pGlu-CPT中，喜树碱处于通过酯键结合在PEG-pGlu上的状态(MeO-PEG-pGlu-CPT)。该PEG-pGlu-CPT具有上述通式II-a所示的构造。PEG的链长为12kDa。
准备在PEG末端具有马来酰亚胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLA)。该聚合物中的PEG的链长为12kDa。在样品瓶中精确称取10mg的PEG-pGlu-CPT和10mg的Maleimide-PEG-PBLA，添加1mL精制水。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，以孔径为0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex-GP PES)进行过滤，回收滤液。将滤液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0))，回收微团成分(1.5mL)。在该微团成分中，含有PEG-pGlu-CPT和Maleimide-PEG-PBLA呈放射状排列的微团。
在人类来源的铁传递蛋白(Sigma-Aldrich公司)(以下，有时将铁传递蛋白表示为Tf)40mg中，添加0.2M的硼酸缓冲液(pH 8.0)、100mM的乙二胺四乙酸(EDTA)和精制水，溶解Tf。接着添加10mg/mL的Traut′s试剂(Pierce Chemical公司)138μL，使硼酸缓冲液的最终浓度为50mM，EDTA的最终浓度为2mM，形成共计1mL的混合液之后，在30℃静置45分钟。将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，2mMEDTA)，回收高分子成分(1.5mL)。
混合该回收液0.75mL和上述的微团成分0.75mL，在30℃静置2小时，由此使Maleimide-PEG-PBLA的马来酰亚胺基与Tf反应，形成含有作为骨架聚合物单元α的铁传递蛋白结合聚合物的微团。该铁传递蛋白结合聚合物具有上述通式I-a所示的构造。PEG的链长为12kDa。该反应液中的磷酸钠缓冲液的最终浓度为20mM，EDTA的最终浓度为1mM。接着，在反应液中添加200mM甲酸铵缓冲液，将pH调整为5之后，进行凝胶过滤精制(Sepharose CL-4B(1Φ×30cm)，洗脱液：20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，由此除去未反应的Tf。
将回收的微团成分通过进行超滤(MilliPore公司生产的AmiconUltra-15)浓缩至2mL之后，添加NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH9.6)将pH调整至7，接着在添加了100mM的半胱氨酸溶液20μL的状态下，在室温下静置10分钟。将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4))，回收高分子成分(3mL)。向该高分子成分中分别添加1M的FeCl3和100mM的Na2CO3(以100mM的柠檬酸调整为pH7.0)各30μL。将这样得到的混合液在4℃静置过夜之后，进行超滤(MilliPore公司生产的AmiconUltra-15)，通过重复进行利用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.4)稀释和去除铁离子，最终浓缩为2mL。将该浓缩液以0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100101
GV)进行过滤，回收滤液，由此得到含有铁传递蛋白结合喜树碱微团的溶液。
(实施例2)
使用多西紫杉醇(DTX)作为药物，以多西紫杉醇结合物(PEG-pGlu-DTX)作为骨架聚合物单元β，除此以外，与实施例1相同进行操作，得到作为高分子微团的铁传递蛋白结合多西紫杉醇，该高分子微团中具有铁传递蛋白作为具有标的结合部位的化合物，内包多西紫杉醇作为药物。另外，构成骨架聚合物单元α和骨架聚合物单元β的嵌段共聚物部分的PEG的链长均为10kDa。PEG-pGlu-DTX中，多西紫杉醇处于以通过酯键结合在PEG-pGlu上的状态(MeO-PEG-pGlu-DTX)，具有上述通式II-a所示的构造。
作为骨架聚合物单元β的PEG-pGlu-DTX如下操作形成。将聚谷氨酸的单末端处于乙酰化状态的500mg聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(PEG-pGlu-Ac)在10mL无水DMF(关东化学)中溶解后，再添加1.06g多西紫杉醇(ScinoPharm Taiwan，Ltd)。另外，该PEG-pGlu-Ac中的PEG的平均分子量为10000，谷氨酸的平均残基数为40，谷氨酸的侧链为羧酸。接着，依次添加160mg的4-二甲基氨基吡啶(和光纯药)和210μL的N，N’-二异丙基碳二亚胺(国产化学)，在室温下搅拌过夜。将这样得到的反应液向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶1)500mL中滴下使聚合物结晶析出后，减压过滤收集该聚合物。将过滤收集得到的聚合物在100mL精制水中悬浊，作为高分子微团进行超滤(MilliPore公司生产的实验室规模TFF***，截留分子量值为100000，5倍稀释后，浓缩至100mL)。将该超滤操作重复进行5次之后，进行冷冻干燥。将通过冷冻干燥得到的聚合物在10mL无水DMF中溶解的状态下，向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶1)500mL中滴下使聚合物结晶析出之后，减压过滤收集该聚合物。将过滤收集得到的聚合物以粉末状态原样向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶1)100mL中添加从而洗净之后，进行减压过滤收集。将过滤收集得到的聚合物在室温下进行减压干燥过夜，由此得到530mg淡黄色粉末的PEG-pGlu-DTX。
使1mg的PEG-pGlu-DTX在精制水和乙醇的混合溶液(体积比1∶1)10mL中溶解，根据对波长233nm的光线的吸光度测定多西紫杉醇的含量，结果为每一聚合物中含有14.3个分子。该PEG-pGlu-DTX中，多西紫杉醇处于以酯键结合在PEG-pGlu-Ac上的状态(MeO-PEG-pGlu-EVE)。该PEG-pGlu-EVE具有上述通式II-a所示的构造。PEG的链长为10kDa。
(实施例3)
如下操作形成作为高分子微团的EGF结合多西紫杉醇微团，该高分子微团中具有上皮生长因子(EGF)作为具有标的结合部位的化合物，内包多西紫杉醇(DTX)作为药物。
与实施例2相同地形成作为骨架聚合物单元β的DTX结合物(PEG-pGlu-DTX)。
准备PEG链长为10kDa的在PEG末端具有马来酰亚胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLA)。在样品瓶中精确称取5mg该聚合物和5mg的PEG-pGlu-DTX，添加1mL精制水之后，进行与实施例1相同的处理，回收微团成分(1.5mL)。该微团成分中含有PEG-pGlu-DTX和Maleimide-PEG-PBLA呈放射状排列的微团。
在添加有1mg重组人类EGF(R&D System公司)的瓶中，添加精制水1mL，调制1mg/mL的EGF溶液。对该EGF溶液0.5mL添加0.2M的硼酸缓冲液(pH8.0)、100mM的乙二胺四乙酸(EDTA)和精制水，进一步添加10mg/mL的Traut’s试剂(Pierce Chemical公司)138μL，以使硼酸缓冲液的最终浓度为50mM、EDTA的最终浓度为2mM，形成合计1mL的混合液之后，在30℃静置45分钟。接着，将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，2mM EDTA)，回收高分子成分(1.5mL)。
混合该回收液1.5mL和上述微团成分0.5mL，在30℃静置2小时，由此使Maleimide-PEG-PBLA的马来酰亚胺基与EGF反应，形成含有作为骨架聚合物单元α的EGF结合聚合物的微团。该EGF结合聚合物具有上述通式I-a所示的构造。将这样得到的反应液进行凝胶过滤精制(Sepharose CL-4B(1Φ×30cm)，洗脱液：20mM乙酸钠缓冲液(pH7.4))，由此除去未反应的EGF。
将回收的微团成分通过进行超滤(MilliPore公司生产的Amincon
Ultra-15)浓缩至约2mL，得到含有EGF结合多西紫杉醇的溶液。
(实施例4)
如下操作形成作为高分子微团的抗RANKL抗体结合依维莫司微团，该高分子微团具有抗RANKL抗体作为具有标的结合部位的化合物，内包依维莫司(EVE)作为药物。
首先，如下操作形成作为骨架聚合物单元β的依维莫司结合物(PEG-pGlu-EVE)。将聚谷氨酸的单末端处于乙酰化状态的140mg聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(PEG-pGlu-Ac)在10mL无水DMF(关东化学)中溶解后，再添加142mg的依维莫司(MOLCAN.Co.)。另外，该PEG-pGlu-Ac中的PEG的平均分子量为10000，谷氨酸的平均残基数为40，谷氨酸的侧链为羧酸。接着，依次添加16.9mg的4-二甲基氨基吡啶(和光纯药)和22.0μL的N，N’-二异丙基碳二亚胺(国产化学)，在室温下搅拌过夜。将这样得到的反应液向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比3∶1)100mL中滴下使聚合物结晶析出后，减压过滤收集该聚合物。将由过滤收集得到的聚合物在无水DMF中溶解的状态下，对蒸馏水透析两天(截留分子量(MWCO)＝3500，交换4次蒸馏水)后，进行冷冻干燥。将由冷冻干燥得到聚合物在10mL无水DMF中溶解的状态下，向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比3∶1)100mL中滴下使聚合物结晶析出之后，减压过滤收集该聚合物。将过滤收集得到的聚合物以粉末状态原样向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(体积比3∶1)100mL中添加从而洗净之后，进行减压过滤收集。将过滤收集得到的聚合物在室温下进行减压干燥过夜，由此得到180mg淡黄色粉末的PEG-pGlu-EVE。
使1mg的PEG-pGlu-EVE在精制水和甲醇的混合溶液(体积比1∶1)25mL中溶解，根据对波长278nm的光线的吸光度测定依维莫司的含量，结果为每一聚合物中含有12.6个分子。该PEG-pGlu-EVE中，依维莫司处于以酯键结合在PEG-pGlu上的状态(MeO-PEG-pGlu-EVE)。该PEG-pGlu-EVE具有上述通式II-a所示的构造。PEG的链长为10kDa。
在样品瓶中精确称取5mg的PEG-pGlu-EVE，添加1mL精制水。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所生产HighPower Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，使用0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100131
GP PES)进行过滤，回收滤液。在该滤液中，含有作为骨架聚合物单元β的PEG-pGlu-EVE。
如下操作形成作为骨架聚合物单元α的抗RANKL抗体结合聚合物。准备在PEG末端具有马来酰亚胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLA)。该聚合物中的PEG的链长为10kDa。在样品瓶中准确称取5mg的Maleimide-PEG-PBLA，添加1mL 20mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所生产HighPower Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，使用0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100132
GP PES)进行过滤，回收含有Maleimide-PEG-PBLA的滤液。
在添加有500μg的抗RANKL抗体(R&D Systems公司)的瓶中，添加0.5mL的PBS，调制1mg/mL的抗RANKL抗体溶液。对该抗RANKL抗体溶液0.4mL添加0.2M的硼酸缓冲液(pH8.0)、100mM的EDTA和精制水，再添加10mg/mL的Traut’s试剂(Pierce Chemical公司)2μL，以使硼酸缓冲液的最终浓度为50mM、EDTA的最终浓度为2mM，形成合计0.6mL的混合液之后，在30℃静置45分钟。接着，将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，2mM EDTA)，回收高分子成分(1.5mL)。
混合该回收液1.5mL和上述含有Maleimide-PEG-PBLA的滤液38μL，在30℃静置2小时，再在4℃静置过夜，由此使Maleimide-PEG-PBLA的马来酰亚胺基与抗RANKL抗体反应，形成作为骨架聚合物单元α的抗RANKL抗体结合聚合物。该抗RANKL抗体结合聚合物具有上述通式I-a所示的构造。将这样得到的反应液进行凝胶过滤精制(Sepharose CL-4B(1Φ×30cm)，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4))，由此除去未反应的SH化抗体。
通过将回收的微团成分进行超滤(MilliPore公司生产的AminconUltra-15，截留分子量值为100000)，浓缩至约1mL，得到含有抗RANKL抗体结合聚合物的溶液。
混合含有PEG-pGlu-EVE的滤液36μL和含有抗RANKL抗体结合聚合物的溶液500μL，在4℃静置3天，由此得到含有抗RANKL抗体结合依维莫司微团的溶液。使用Zetasizer(Malvern Instruments公司)进行测定，抗RANKL抗体结合依维莫司微团的平均粒径为119nm。
(实施例5)
如下操作形成作为高分子微团的铁传递蛋白结合依维莫司微团，该高分子微团具有铁传递蛋白作为具有标的结合部位的化合物，内包依维莫司作为药物。
与实施例4相同地得到含有作为骨架聚合物单元β的PEG-pGlu-EVE的滤液。
如下操作形成作为骨架聚合物单元α的铁传递蛋白结合聚合物。首先，与实施例4相同地得到含有Maleimide-PEG-PBLA的滤液。使10mg的人铁传递蛋白(Sigma-Aldrich公司)在1mL精制水中溶解，调制铁传递蛋白溶液。对该铁传递蛋白溶液696μL，添加0.2M的硼酸缓冲液(pH8.0)、100mM的EDTA和精制水，再添加10mg/mL的Traut’s试剂(Pierce Chemical公司)34μL，使硼酸缓冲液的最终浓度为50mM，EDTA的最终浓度为2mM，形成合计1mL的混合液之后，在30℃静置45分钟。接着，将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，2mM EDTA)，回收高分子成分(1.5mL)。
混合该回收液1.5mL和含有上述Maleimide-PEG-PBLA的滤液0.9mL(聚合物浓度5mg/mL)，在30℃静置2小时(磷酸钠缓冲液(pH7.0)的最终浓度为20mM，EDTA的最终浓度为1mM)，再在4℃静置过夜，由此使Maleimide-PEG-PBLA的马来酰亚胺基与铁传递蛋白反应，形成作为骨架聚合物单元α的铁传递蛋白结合聚合物。该铁传递蛋白结合聚合物具有上述通式I-a所示的构造。
将这样得到的反应液进行凝胶过滤精制(Sepharose CL-4B(1Φ×30cm)，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4))，由此除去未反应的SH化铁传递蛋白。将回收的微团成分通过超滤(MilliPore公司生产的Amicon Ultra-15，截留分子量值为100000)浓缩至约2mL之后，添加NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH9.6)将pH调整为7，进一步在添加100mM的半胱氨酸溶液20μL的状态下，在室温下静置10分钟。将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4))，回收高分子成分(3mL)。向该高分子成分中分别添加1M的FeCl3、100mM的Na2CO3(以100mM的柠檬酸调整为pH 7.0)各30μL。将这样得到混合液在4℃静置过夜之后，进行超滤(MilliPore公司生产的Amicon Ultra-15，截留分子量值为100000)，重复进行以20mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)稀释和除去铁离子，由此最终浓缩至约3mL，得到含有铁传递蛋白结合聚合物的溶液。
混合含有PEG-pGlu-EVE的滤液200μL和含有铁传递蛋白结合聚合物的溶液500μL，在4℃静置3天，由此得到含有铁传递蛋白结合依维莫司微团的溶液。使用Zetasizer(Malvern Instruments公司)进行测定，铁传递蛋白结合依维莫司微团的平均粒径为106nm。
(比较例1)
如下操作形成不具有标的结合部位而内包多西紫杉醇作为药物的高分子微团(下面，为了容易地进行说明，称为Tf非结合DTX微团)。在样品瓶中准确称取实施例2中形成的PEG-pGlu-DTX 10mg，添加20mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)1mL使之悬浊。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所生产High Power Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，以孔径0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100151
GP PES)进行过滤，回收滤液。将该滤液进行凝胶过滤(GEScience公司生产的PD-10，洗脱液：10％蔗糖溶液)，由此得到含有Tf非接合DTX微团的高分子成分。
(比较例2)
如下操作形成不具有含有标的结合部位的化合物而内包喜树碱作为药物的高分子微团(下面，为了容易地进行说明，称为Tf非接合CPT微团)。在样品瓶中准确称取实施例1中形成的PEG-pGlu-CPT 10mg，添加精制水1mL使之悬浊。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所生产High Power Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，以孔径0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的Millex
Figure GPA00001062781100161
GP PES)进行过滤，回收滤液。将该滤液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，由此得到含有Tf非接合CPT微团的高分子成分。
(比较例3)
如下操作形成具有Tf作为含有标的结合部位的化合物但不内包药物的高分子微团(下面，为了容易地进行说明，称为Tf结合空微团)。
准备在PEG末端具有马来酰亚胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLG)。该聚合物中的PEG的链长为10kDa。在样品瓶中精确称取5mg的Maleimide-PEG-PBLG，添加1mL 20mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。在4℃搅拌一昼夜之后，使用Biodisruptor(日本精机制作所生产HighPower Unit)，在冰浴下超声波处理10分钟，以孔径0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的MillexGP PES)进行过滤，由此回收含有Maleimide-PEG-PBLG的滤液。
在人类来源的Tf(和光纯药)10mg中，添加0.2M的硼酸缓冲液(pH8.0)、100mM的乙二胺四乙酸(EDTA)和精制水，溶解Tf。接着再添加10mg/mL的Traut’s试剂(Pierce Chemical公司)34μL，使硼酸缓冲液的最终浓度为50mM，EDTA的最终浓度为2mM，形成合计为1mL的混合液之后，在30℃静置45分钟。将这样得到的反应液进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，2mM EDTA)，回收高分子成分(1.5mL)。
混合该回收液1.5mL和上述含有Maleimide-PEG-PBLG的滤液0.9mL，在30℃静置2小时，再在4℃静置过夜，由此使Maleimide-PEG-PBLG的马来酰亚胺基与Tf反应。将这样得到的反应液进行凝胶过滤精制(Sepharose CL-4B(2Φ×30cm)，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0))，由此除去未反应的SH化Tf。
将由凝胶过滤回收得到的高分子成分进行超滤(MilliPore公司生产的Amicon Ultra-15，截留分子量值为100000)，回收高分子成分(4mL)。在0.5mL的该高分子成分中，混合100mM的FeCl3(100mM柠檬酸以1M的Na2CO3调整为pH 7.0)50μL。将这样得到的混合液在4℃静置2小时，进行凝胶过滤(GE Science公司生产的PD-10，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0))，除去剩余的铁离子，由此得到含有Tf结合空微团的溶液。
[细胞毒性试验1]
将实施例2的Tf结合DTX微团的细胞毒性与比较例1的Tf非接合DTX微团的细胞毒性进行比较。使用通过DS Pharma Biomedical株式会社从ECACC(European Collection of Cell Culture)购入的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，基于WST法，对各微团的细胞毒性如下进行评价。
将该细胞在90μL的培养基中悬浊的状态下接种在96孔板中，使每个孔中含有约5000个人乳腺癌MDA-MB-231细胞，在37℃、5％CO2的气氛下培养过夜。该培养基由RPMI1640(GibcoTM，Invitrogen)和10％FBS(Fetal Bovine Serum，biowest)形成。接着，将实施例2的微团溶液和比较例1的微团溶液以培养基稀释成各种DTX浓度的样品溶液，向各个孔中添加(每孔10μL)，在37℃、5％CO2的气氛下培养2小时。之后，从孔内除去培养基，以磷酸缓冲生理盐水(PBS)将孔内洗净2次，添加新鲜的培养基(每孔100μL)，继续培养直至总培养时间达到72小时。之后，添加WST Reagent(同仁)(每孔10μL)，在37℃、5％CO2的气氛下继续培养约2小时。对各个孔测定对450nm的光线的吸光度(Abs450)，根据下述的数学式算出细胞增殖率(％cellgrowth)。另外，该数学式中的对照的Abs450值，是指由使用不含有DTX的培养液进行上述培养的孔所得到吸光度。
Figure GPA00001062781100171
图1是表示MDA-MB-231细胞相对于多西紫杉醇浓度的细胞增殖率的图。该图的横轴是表示将样品溶液中的微团的量换算成多西紫杉醇浓度得到的值。黑方块是添加Tf非结合DTX微团时的数据，黑三角是添加Tf结合DTX微团时的数据。各数据的误差棒是标准偏差(SD)。如图1的图所示，Tf结合DTX微团对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，与Tf非结合DTX微团相比，从低DTX浓度开始发挥显著作用。
[细胞毒性试验2]
细胞毒性试验2中，将添加样品溶液实施的培养时间变更为72小时、之后立刻将WST Reagent以每孔10μL分别添加，在37℃、5％CO2的气氛下继续培养约2小时，除此以外，与细胞毒性试验1相同地进行，研究实施例2的Tf结合DTX微团和比较例1的Tf非结合DTX微团的细胞毒性。
另外，各微团的DTX浓度，基于对波长233nm的光线的吸光度而算出。其中，对于Tf结合DTX微团，减去对波长233nm的光线的吸光度中的Tf(脱铁铁传递蛋白)的部分的值。
图2是表示MDA-MB-231细胞相对于多西紫杉醇浓度的生存率的图。该图中的纵轴、横轴、黑方块和黑三角所表示的意思与图1的图相同。各数据中的误差棒为标准偏差(SD)。如图2的图所示，Tf结合DTX微团对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，与Tf非结合DTX微团相比，从低DTX浓度开始发挥显著作用。
[细胞毒性试验3]
细胞毒性试验3中，作为细胞，使用通过住商Pharma International株式会社从ATCC(American Type Culture Collection)购入的人***癌DU145细胞，作为微团，使用实施例1的Tf结合CPT微团和比较例2的Tf非结合CPT微团，将添加样品溶液实施的培养时间变更为8小时，除此以外，与细胞损伤试验1同样地进行，研究各微团的细胞毒性。
[细胞毒性试验4]
细胞毒性试验4中，作为细胞，使用通过DS Pharma Biomedical株式会社从ECACC购入的人肝癌HepG2细胞，除此以外，与细胞损伤试验3相同地进行，研究各微团的细胞毒性。
[细胞毒性试验5]
细胞毒性试验5中，作为细胞，使用人乳腺癌MDA-MB-231细胞，除此以外，与细胞毒性试验3相同地进行，研究各微团的细胞毒性。
细胞毒性试验3～5的结果如表1所示。表1的“溶液”相关的数据，是直接添加微团内没有内包CPT的培养液而调制得到的样品溶液相关的数据。
[表1]
Figure GPA00001062781100191
Tf的效果：Tf非结合微团的GI50/Tf结合微团的GI50
另外，各微团的CPT浓度如下进行测定。
a)CPT浓度的测定方法
相对微团样品100μL，添加200μL 6N的HCl，在冻存管(Cryotube)(家田化学)中以100℃加热1小时。回收得到的反应液75μL，添加50μL 6N的NaOH中和之后，以0.22μm的过滤器(MilliPore公司生产的MILLEX
Figure GPA00001062781100192
-GV)过滤。将滤液以25mM的甲酸铵缓冲液(pH 3.0)稀释10倍，将该处理样品溶液填充至HPLC样品瓶中，以下述的分析条件进行HPLC分析，由此测定CPT浓度。
b)HPLC分析条件
***：Waters Alliance System
柱：Tosoh TSK-gel ODS-80TM(4.6Φ×150mm)(40℃)
流动相：25mM的甲酸铵(pH 3.0)/乙腈＝70/30
流速：1mL/min
检测：荧光(Ex：370nm，Em：420nm)
注入体积：20μL
[细胞毒性试验6]
细胞毒性试验6中，作为细胞，使用通过DS Pharma Biomedical株式会社从ECACC购入的人乳腺癌细胞MDA-MB-231，作为微团，使用比较例3的Tf结合空微团，并且药剂和细胞的接触时间延长至72小时，除此以外，与细胞损伤试验3相同地进行，研究各微团的细胞毒性。
图5是表示MDA-MB-231细胞相对于Tf浓度的细胞增殖率的图。该图的横轴表示将样品溶液中的微团的量换算成Tf浓度得到的值。黑方块表示添加Tf结合空微团时的数据，黑三角表示添加Tf结合DTX微团时的数据，白圆表示添加Tf溶液时的数据。各数据中的误差棒为标准偏差(SD)。如图5的图所示，Tf结合多西紫杉醇显示对MDA-MB-231细胞的优异的细胞毒性，但是，Tf溶液和Tf结合空微团没有细胞毒性。
[药效评价试验]
使用由RPMI1640和10％FBS形成的培养基，将人乳腺癌MDA-MB-231细胞在37℃、5％CO2的气氛下，培养至增殖到移植所需要的细胞数。之后，将该细胞以在100μL的生理盐水中悬浊的状态，接种在雌性裸鼠(Balb nu/nu，5周龄，日本Charles River株式会公司生产)的背部皮下。每只裸鼠接种的细胞为3×106个。之后，在通过饲养裸鼠21天使肿瘤体积达到70.8±3.7mm3(Average±SE)时，开始将药物内包微团给药。
给药日程为每隔四天共计3次尾静脉内给药，对以下三组，每周测定3次肿瘤体积以及小鼠体重。每组中的小鼠数量为8只。
(1)对照(无处理)
(2)比较例1的Tf非结合DTX微团(每次的DTX给药量为小鼠每1kg体重给药10mg)
(2)实施例2的Tf结合DTX微团(每次的DTX给药量为小鼠每1kg体重给药10mg)
图3是表示肿瘤体积的经时变化的图。该图的纵轴是表示相对试验开始时的肿瘤体积的相对值，横轴表示从试验开始所经过的时间(Days)。该图中的箭头表示将药物内包微团给药的时间。黑圆表示对照组的数据，黑三角表示Tf非结合DTX微团组的数据，黑方块表示Tf结合DTX微团组的数据。图4是表示小鼠的体重变化的图。图4的图的纵轴表示相对于试验开始时的小鼠体重的相对值。图4的图中的横轴、箭头、黑圆、黑三角和黑方块表示的意思与图3的图相同。各数据中的误差棒为标准误差(SE)。
如图3和图4的图所示，如果以Tf结合DTX微团给药，则与对照和以Tf非结合DTX微团给药时相比，能够实现小鼠体重没有变化的状态，并且显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。另外，虽然图3的图中没有表示，但是以Tf结合DTX微团给药时，能够使给药第29天的T/C值(药物给药组(T)和对照组(C)的肿瘤体积比)降低至0.33。

Claims (4)

1.一种药物内包活性靶向型高分子微团，其特征在于：
包括具有标的结合部位的骨架聚合物单元α和具有药物而不具有所述标的结合部位的骨架聚合物单元β，所述骨架聚合物单元α和骨架聚合物单元β，以所述标的结合部位朝向外侧并且所述药物朝向内侧的状态呈放射状排列，
i)当在维持所述放射状排列的状态下与标的结合时，通过胞吞作用被摄入供给该标的的细胞的内部，所述放射状排列在所述细胞内崩解，由此使所述药物在该细胞内释放，
ii)当与标的结合之前在血液中所述放射状排列崩解时，所述骨架聚合物单元β通过代谢排出体外，由此能够防止所述药物对正常细胞造成损伤。
2.如权利要求1所述的高分子微团，其特征在于：
所述骨架聚合物单元α，由具有标的结合部位的化合物和嵌段共聚物形成，以通式I：Z-A1-B1表示，
骨架聚合物单元β，由药物和嵌段共聚物形成，以通式II：A2-B2(-D)表示，
其中，Z是具有标的结合部位的化合物，A1和A2是相互独立的聚乙二醇链片段，B1和B2是相互独立的聚氨基酸链片段，D是所述药物。
3.如权利要求2所述的高分子微团，其特征在于：
所述骨架聚合物单元α以下述通式I-a或者通式I-b表示，所述骨架聚合物单元β以下述通式II-a或者通式II-b表示，
其中，R1是具有标的结合部位的所述化合物，R2是C1-C12的烷基或者是末端具有羟基的C1-C12的烷基，L1是O(CH2)pNH，L2是O(CH2)p-CO-，p是1～5范围内的整数，R是氢原子或者疏水性有机基团，q是1或2，n1和n2是相互独立的40～450范围内的整数，m1和m2是相互独立的20～80范围内的整数，R3是所述药物残基或者总数m2的至少10～70％具有连接基团的所述药物残基，当存在时，其它的基团为氢原子或者疏水性有机基团。
Figure FPA00001062781000021
4.一种医药组合物，其特征在于：
含有权利要求1所述的高分子微团和制药学上可接受的载体。
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