CN101796195A - β-葡糖苷酶增强的丝状真菌全纤维素酶组合物和使用方法 - Google Patents

β-葡糖苷酶增强的丝状真菌全纤维素酶组合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供β-葡糖苷酶增强的丝状真菌全纤维素酶组合物。还提供了用β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物水解纤维素物质的方法。本发明还提供了通过添加有效量的β-葡糖苷酶来减少水解纤维素物质所需要的全纤维素酶量的方法。

Description

β-葡糖苷酶增强的丝状真菌全纤维素酶组合物和使用方法
1.相关申请的交叉参照
本申请要求美国临时申请No.60/970,842的权益，所述临时申请于2007年9月7日提交，此处以其整体引入作为参考。
2.领域
本公开内容涉及酶的领域，特别是用于纤维素物质酶促水解的方法和组合物。
3.介绍
由于非可再生能源的极限临近，作为可再生能源的纤维素潜力巨大。纤维素可被转化为糖，如葡萄糖，并通过众多微生物(包括细菌、酵母和真菌)用作为能源用于工业目的。例如，可将纤维素物质用酶转化为糖，所得的糖可用作工业微生物的原料，生产如塑料和乙醇等产品。
纤维素物质作为可再生碳源的应用取决于经济上可行的用于纤维素物质酶促水解的纤维素酶的发展。纤维素酶是催化纤维素水解为如葡萄糖、纤维二糖和其他纤维寡糖等产物的酶。纤维素酶协同作用将纤维素水解为葡萄糖。外切纤维二糖水解酶(CBH)如CBHI和CBHII，一般作用于纤维素末端产生纤维二糖，而内切葡聚糖酶(EGs)作用于纤维素的任意部位。这些酶共同将纤维素水解为较小的纤维寡糖(如纤维二糖)。纤维二糖由β-葡糖苷酶水解为葡萄糖。
虽然许多微生物有能力降解纤维素，但这些微生物中只有少数，能产生显著量的能将结晶纤维素完全水解的酶。相应地，仍然存在着为工业应用中水解纤维素开发高效酶***的需要。因此需要提高纤维素物质酶促水解的效率和经济性。
4.概述
本教导提供β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物和使用方法。通常，与单独的全纤维素酶制品相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物有相等或更好的特异性性能。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物含有高于10％到大约80％(w/w，蛋白质)的β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物含有的全纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性为大约0.60到22pNPG/CMC单位。
本教导还提供通过添加有效量的β-葡糖苷酶来减少水解纤维素物质所需要的全纤维素酶量的方法。在一些实施方案中，该方法提供减少水解纤维素物质所需要的全纤维素酶的量，这是通过添加超过全纤维素酶的量的10％(w/w，蛋白质)的β-葡糖苷酶的量。在一些实施方案中，该方法包括全纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性，其中β-葡糖苷酶活性对纤维素酶活性的比值为大约0.60到22pNPG/CMC单位。本教导还提供了通过将纤维素物质与有效量的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物进行接触来水解纤维素物质的方法。
本教导的这些和其他特征如下所述。
5.附图简述
熟练的技术人员会理解，附图只用于说明目的，并非意图以任何方式限制本教导的范围。
图1是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在1％PASC上使用木霉属(Trichoderma)全纤维素酶和木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总％转化率(A)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(B)。
图2是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w微晶纤维素(Avicel)上用木霉属全纤维素酶和木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总百分比转化率(A)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(B)。
图3是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w PCS上用木霉属全纤维素酶和木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总百分比转化率(A)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(B)。
图4是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w甘蔗渣上用木霉属全纤维素酶和木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总百分比转化率(A)、所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(B)和通过增加β-葡糖苷酶量的百分比转化率(C)。
图5是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w PCS上用木霉属全纤维素酶Rut C30和木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总％转化率(a)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(b)。
图6是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在1％w/wPASC上用木霉属全纤维素酶和纯化的木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总％转化率(a)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(b)。
图7是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w PCS上用木霉属全纤维素酶和纯化的木霉属β-葡糖苷酶1，所述图表显示总％转化率(a)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(b)。
图8是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在1％w/wPASC上用木霉属全纤维素酶和纯化的木霉属β-葡糖苷酶3，所述图表显示总％转化率(a)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(b)。
图9是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在7％w/w PCS上用木霉属全纤维素酶和纯化的木霉属β-葡糖苷酶3，所述图表显示总％转化率(a)以及所产生纤维二糖和葡萄糖的相对量(b)。
图10是显示微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中在1％w/wPASC上用木霉属全纤维素酶和纯化的木霉属β-葡糖苷酶7。将总％转化率针对含有和不含β-葡糖苷酶7的给定剂量的木霉属全纤维素酶来作图。
6.多种实施方案详述
应当理解前面的一般描述和后面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是此处所述组合物和方法的限制。除非此处另有定义，这里所用的所有技术和科学术语，与本发明所属领域内普通技术人员的一般理解有相同的意义。本申请中，除非另有说明，单数词的使用包括了复数形式。使用“或”表示“和/或”，除非另有说明。同样地，术语“包含/含有”(“comprise”、“comprising”、“comprises”)的各种词性形式和“包括”的各种词性形式(“include”、“including”、“includes”)并非意图限制。此处引用的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列，在此明确引入作为参考。
此处提供的标题，并不是对可以参考说明书整体而得到的本发明各方面或实施方案的限制。相应地，此处的术语通过参考说明书整体而得到更充分的定义。
6.1β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物
提供了β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物，及其制备和使用方法。通常，与单独的全纤维素酶制品相比，此处所述的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物有大约相等或更好的特异性性能。在一些实施方案中，与单独的全纤维素酶制品相比，此处描述的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物在纤维素物质糖化作用中有大约相等或更好的特异性性能。
β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物可包括任何有β-葡糖苷酶活性的多肽。术语“β-葡糖苷酶”此处定义为分类为EC 3.2.1.21的β-D-葡糖苷葡糖水解酶(β-D-glocoside glucohydrolase)，和/或那些在某些GH家族中的酶，其包括但不限于在GH家族1、3、9或48中的酶，所述酶催化纤维二糖的水解(具有β-D-葡萄糖的释放)。
β-葡糖苷酶可从任何合适的微生物通过重组方法获得或从商业来源得到。来自微生物的β-葡糖苷酶的合适并不限制的例子，包括并不限于细菌和真菌。合适的细菌包括热酸菌属(Acidothermus)、醋弧菌属(Acetivibrio)、Aeromona、气单胞菌属(Aeromonas)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、Anaerocellum、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、Alcanivorax、碱湖生菌属(Alkalilimnicola)、Alkaliphilus、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮弧菌属(Azoarcus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Anaeromyxobacter、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、包特氏菌属(Bordetella)、包柔体属(Borrelia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、色杆菌属(Chromobacterium)、棍状杆菌属(Clavibacter)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、棒状菌属(Corynebacterium)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、噬纤维菌属(Cytophaga)、真杆菌属(Eubacterium)、丝状杆菌属(Fibrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、粘杆菌属(Gloeobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Hahella、动球菌属(Kineococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、利斯特氏菌属(Listeria)、Maricaulis、粘细菌属(Myxobacter)、中间原体属(Mesoplasma)、甲基球菌属(Methylococcus)、粘球菌属(Myxococcus)、小双孢菌属(Microbispora)、酒球菌属(Oenococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、胃球菌属(Ruminococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红育菌属(Rhodoferax)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Saccharophagus、Salinispora、沙门氏菌属(Salmonella)、Solibacter、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、栖热袍菌属(Thermotoga)、栖热菌属(Thermus)、密螺旋体属(Treponema)、Thermobifida、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、食酸菌属(Acidovorax)、Deinococcus geothermalis、Desulfotalea、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶是从丝状真菌得到的。术语“丝状真菌”表示的是本领域技术人员承认的任意和全部丝状真菌。一般来说，丝状真菌是真核微生物，包括亚门真菌亚门(Eumycotina)和藻属(Oomycota)的所有丝状形式。这些真菌的特征在于营养菌丝体，该菌丝体带有由壳多糖、β-葡聚糖和其他复杂多糖组成的细胞壁。在一些实施方案中，本教导中的丝状真菌在形态、生理和遗传方面与酵母不同。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下属：曲霉菌属(Aspergillus)、支顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢属(Cephalosporium)、Ceriporiopsis、Chaetomium paecilomyces、金小孢子属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰孢属(Fusarium)、Gilocladium、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、白腐真菌(Phanerochaete)、柄孢壳属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、Thermomyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、发癣菌属(Trichophyton)、和Trametes pleurotus。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下几种：构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awomari)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、A.kawachi例如NRRL 3112、ATCC 22342(NRRL 3112)、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f；米曲霉(A.oryzae)例如ATCC 11490；青霉属(Penicillium)粗糙脉孢菌(N.crassa)、里氏木霉(Trichoderma reesei)例如NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767和绿色木霉(Trichoderma viride)例如ATCC 32098和32086。
可以使用的β-葡糖苷酶优选例包括以下β-葡糖苷酶，其来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kawaguchi等人，1996，Gene 173：287-288)、Aspergillus kawachi(Iwashita等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：5546-5553)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(WO 2002/095014)、双氮纤维单胞菌(Cellulomonas biazotea)(Wong等人，1998，Gene 207：79-86)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)(WO 200478919)，扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)(Machida等人，1988，Appl.Environ.Microbiol.54：3147-3155)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Wood等人，2002，Nature 415：871-880)，和里氏木霉β-葡糖苷酶1(美国专利No.6,022,725)、里氏木霉β-葡糖苷酶3(美国专利No.6,982,159)、里氏木霉β-葡糖苷酶4(美国专利No.7,045,332)、里氏木霉β-葡糖苷酶5(美国专利No.7,005,289)、里氏木霉β-葡糖苷酶6(USPN 20060258554)和里氏木霉β-葡糖苷酶7(USPN 20040102619)。
在一些实施方案中，可以通过表达编码β-葡糖苷酶的基因来生产β-葡糖苷酶。例如，β-葡糖苷酶可分泌到细胞外隙，例如，通过革兰氏阳性生物(如芽胞杆菌属(Bacillus)和放线菌属(Actinomycetes))或真核宿主(例如木霉属、曲霉属、酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia))。
应当理解，在一些实施方案中，与天然水平相比，重组微生物中的β-葡糖苷酶可以过量表达。在一些实施方案中，如果利用宿主细胞来进行β-葡糖苷酶表达，则细胞可被遗传修饰来减少细胞内源性的一种或多种蛋白质的表达。在一个实施方案中，细胞可包含一个或多个天然基因，特别是编码分泌蛋白的基因，该基因已缺失或已失活。例如，一个或多个编码蛋白酶的基因(例如编码天冬氨酰蛋白酶的基因，见Berka等人，Gene 199086：153-162和USP6,509,171)或编码纤维素酶的基因可被缺失或灭活。在一个实施方案中，木霉属物种(Trichoderma sp.)宿主细胞可以是这样的里氏木霉宿主细胞，其在cbh1、cbh2、和egl1、egl2基因中包含灭活缺失，如WO 05/001036所述。例如，编码β-葡糖苷酶的核酸可存在于木霉属物种宿主细胞的核基因组中，或可存在于在木霉宿主细胞中复制的质粒中。
β-葡糖苷酶可依原样使用或β-葡糖苷酶可被纯化。此处使用的术语“依原样”是指发酵产生的酶制品不经历或经历极少的回收和/或纯化。例如，细胞一旦分泌β-葡糖苷酶到细胞培养基中，含有β-葡糖苷酶的细胞培养基就可以使用。可选地，β-葡糖苷酶可用任何方便的方法从细胞培养基中回收，例如，通过沉淀、离心、亲和、过滤或本领域任意其他已知方法，包括Chen H、Hayn.M、Esterbauer，H.″Purification andcharacterization of two extracellular b-glucosidases from Trichodermareesei″，Biochimica et Biophysica Acta，1992，1121，54-60。例如，可以应用：亲和层析(Tilbeurgh等人，(1984)FEBS Lett.16：215)、离子交换层析法(Goyal等人，(1991)Biores.Technol.36：37、Fliess等人，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314、Bhikhabhai等人，(1984)J.Appl.Biochem.6：336和Ellouz等人，(1987)Chromatography 396：307)(所述离子交换层析法包括使用有高分辨能力材料的离子交换(Medve等人，(1998)J.Chromatography A 808：153))、疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865：123)、两相分配(Brumbauer等人，(1999)Bioseparation 7：287)、乙醇沉淀、反向HPLC、在二氧化硅上的层析或在阳离子交换树脂(如DEAE)上的层析、层析聚焦、硫酸铵沉淀或使用例如SephadexG-75的凝胶过滤。
在一些实施方案中，使用β-葡糖苷酶可不进行从细胞培养基其他组分的纯化。在一些实施方案中，例如细胞培养基可以被浓缩，然后使用而不进行蛋白从细胞培养基组分的进一步纯化，或被使用而不进行任何其它修饰。
β-葡糖苷酶是从微生物得到时，可以使用本领域中众所周知的回收方法来回收酶。例如，从细胞培养基中通过常规方法回收酶，所述方法包括并不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一些实施方案中，可以使用纯化的β-葡糖苷酶。此处使用的术语“纯化的β-葡糖苷酶”表示这样的β-葡糖苷酶，其不含有从其中获取所述β-葡糖苷酶的生物的其他组分。β-葡糖苷酶可被纯化，其中只存在少量其他蛋白质。此处使用的术语“纯化”也表示其他组分的去除，特别是存在于β-葡糖苷酶来源细胞的其他酶。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶可以是“基本纯的”，也就是说，不含有来自生产该酶的微生物的其他组分。β-葡糖苷酶可通过许多本领域已知方法进行纯化，这些方法包括并不限于层析法(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如制备性等电聚焦)、区分溶解度(如硫酸铵沉淀)或提取。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶至少是25％纯，优选至少50％纯，更优选至少75％纯，甚至更优选至少90％纯，最优选至少95％纯，甚至最优选至少99％纯，其如SDS-PAGE所测定的。
β-葡糖苷酶也可以从商业来源得到。适合在本发明中使用的商用β-葡糖苷酶制品的例子，包括如NOVOZYMTM 188(来自黑曲霉的β-葡糖苷酶)、土壤杆菌属物种(Agrobacterium sp)和Thermatoga maritime，其可从Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.，Bray BusinessPark，Bray，Co.Wicklow，爱尔兰)获得。
β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶通常包含β-葡糖苷酶和全纤维素酶制品。然而，应当理解β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物可通过重组方法生产。例如，在有能力产生全纤维素酶的微生物中表达β-葡糖苷酶。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶。还提供了包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物，该组合物中含有超过10％的β-葡糖苷酶。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中将纤维素物质水解为可溶性糖所需的全纤维素酶制品的量通过β-葡糖苷酶被减少。
β-葡糖苷酶通常以与全纤维素酶制品的量有关的量存在于组合物中。在一些实施方案中，组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中按重量∶重量比例(如蛋白质∶蛋白质比例)，以与全纤维素酶制品的量有关的量存在β-葡糖苷酶。
在一些实施方案中，组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中β-葡糖苷酶的量相对于总蛋白质范围在大于10％到90％之间，例如，相对于总蛋白质样在11％到90％、15％到85％、20％到80％、25％到75％、30％到70％、35％到65％、40％到60％、45％到55％和50％。
在一些实施方案中，组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中例如，β-葡糖苷酶的量相对于总蛋白质占大于10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更多。
如上所述，在一些实施方案中，组合物通常包含β-葡糖苷酶和全纤维素酶制品。如此处所用的短语“全纤维素酶制品”是指天然存在和非天然存在的含有纤维素酶的组合物。“天然存在”的组合物是通过天然存在的来源生产的组合物，该组合物含有一种或多种纤维二糖水解酶类型、一种或多种内切葡聚糖酶类型和一种或多种β-葡糖苷酶组分，其中这些组分的每一种都以来源生产的比例得到。天然存在的组合物是这样一种组合物，其产生于纤维素分解酶方面未经修饰的生物，从而组分酶的比例并未从天然生物产生的比例发生改变。“非天然存在”的组合物包含那些组合物，其产生是通过(1)以天然存在的比例或非天然存在(也就是改变了的)比例来组合组分纤维素分解酶，或(2)修饰生物以过量表达或不足表达一种或多种纤维素分解酶，或(3)修饰生物以致至少一种纤维素分解酶被缺失。相应地，在一些实施方案中，全纤维素酶制品可缺失多种EG和/或CBH中的一种或多种、和/或β-葡糖苷酶。例如，EG1可单独缺失或与其他EG和/或CBH组合被缺失。
一般来说，全纤维素酶制品包括酶，该酶包括并不限于(i)内切葡聚糖酶(EG)或l，4-β-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，其包括1，4-β-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(又已知为纤维糊精酶(cellodextrinases))(EC 3.2.1.74)和1，4-β-d-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH)(EC 3.2.1.91)和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。
在本公开内容中，全纤维素酶制品可来自任何可用于纤维素物质水解的微生物。在一些实施方案中，全纤维素酶制品是丝状真菌全纤维素酶。“丝状真菌”包括亚门真菌和藻属的所有丝状形式。
在一些实施方案中，全纤维素酶制品是支顶孢属、曲霉属、裸孢壳属(Emericella)、镰孢属、腐质霉属、毛霉菌属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属物种的全纤维素酶。
在一些实施方案中，全纤维素酶制品是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、Fusarium negundi、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium dulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是特异腐质酶(Humicolainsolens)、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthorathermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、Scytalidiumthermophilum或太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)，如RL-P37(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)第46-53页；Montenecourt B.S.，Can.，1-20，1987)、QM9414(ATCC No.26921)、NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56466、56767或绿色木霉如ATCC 32098和32086的全纤维素酶。
在一些实施方案中，全纤维素酶制品是里氏木霉RutC30的全纤维素酶，其可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)如里氏木霉ATCC 56765中得到。
在一些实施方案中，全纤维素酶是绳状青霉，其可从美国典型培养物保藏中心如绳状青霉ATCC号10446得到。全纤维素酶制品也可从商业来源得到。适合用于本发明的商用纤维素酶制品的例子，包括例如CELLUCLASTTM(可从Novozymes A/S得到)以及LAMINEXTM、IndiAgeTM和PrimafastTM(可从Genencor Division，Danisco US.Inc得到)。
在本公开内容中，全纤维素酶制品可来自本领域已知的任意微生物培养方法，导致能够水解纤维素物质的酶的表达。发酵可包括在实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小或大规模发酵，如连续、分批、补料分批或固态发酵，其在允许纤维素酶表达或分离的条件下、于合适的培养基中进行。
通常，微生物在细胞培养基中培养，该培养基适合用于产生能够水解纤维素物质的酶。培养运用本领域已知方法，在含有碳源、氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生。本领域已知适合生长和纤维素酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件。作为非限制性的例子，通过里氏木霉生产纤维素酶的正常温度范围是24℃到28℃。
通常，全纤维素酶制品以发酵生产的样子使用，不进行或极少进行回收和/或纯化。例如，一旦纤维素酶由细胞分泌到细胞培养基中，就可以使用含有纤维素酶的细胞培养基。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有发酵物质的未分级分离的成分，包括细胞培养基、细胞外酶和细胞。可选地，全纤维素酶制品可用任何方便的方法加工，如，通过沉淀、离心、亲和、过滤或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，全纤维素酶制品例如可以被浓缩，然后不经进一步纯化而被使用。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有降低细胞活力或杀死细胞的化学剂。在一些实施方案中，使用本领域已知方法裂解或透化处理细胞。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中全纤维素酶的量相对于总蛋白质范围在少于90％到10％，例如，相对于总蛋白质89％到10％、85％到15％、80％到20％、75％到25％、65％到30％、60％到35％、65％到40％、60％到45％、55％到50％。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中全纤维素酶制品相对于总蛋白质的浓度例如小于90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中β-葡糖苷酶的量在总蛋白质的10％到90％范围内，并且全纤维素酶包含总蛋白质的少于90％到10％，例如，β-葡糖苷酶占总蛋白质的11％而全纤维素酶占89％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的12％而全纤维素酶占88％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的13％而全纤维素酶占87％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的14％而全纤维素酶占86％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的15％而全纤维素酶占85％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的16％而全纤维素酶占84％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的17％而全纤维素酶占83％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的18％而全纤维素酶占82％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的19％而全纤维素酶占81％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的20％而全纤维素酶占80％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的21％而全纤维素酶占79％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的22％而全纤维素酶占78％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的23％而全纤维素酶占77％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的24％而全纤维素酶占76％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的25％而全纤维素酶占75％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的26％而全纤维素酶占74％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的27％而全纤维素酶占73％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的28％而全纤维素酶占72％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的29％而全纤维素酶占71％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的30％而全纤维素酶占70％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的31％而全纤维素酶占69％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的32％而全纤维素酶占68％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的33％而全纤维素酶占67％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的34％而全纤维素酶占66％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的35％而全纤维素酶占65％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的36％而全纤维素酶占64％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的37％而全纤维素酶占63％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的38％而全纤维素酶占62％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的39％而全纤维素酶占61％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的40％而全纤维素酶占60％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的41％而全纤维素酶占59％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的42％而全纤维素酶占58％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的43％而全纤维素酶占57％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的44％而全纤维素酶占56％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的45％而全纤维素酶占55％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的46％而全纤维素酶占54％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的47％而全纤维素酶占53％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的48％而全纤维素酶占52％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的49％而全纤维素酶占51％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的50％而全纤维素酶占50％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的51％而全纤维素酶占49％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的52％而全纤维素酶占48％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的53％而全纤维素酶占47％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的54％而全纤维素酶占46％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的55％而全纤维素酶占45％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的56％而全纤维素酶占44％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的57％而全纤维素酶占43％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的58％而全纤维素酶占42％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的59％而全纤维素酶占41％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的60％而全纤维素酶占40％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的61％而全纤维素酶占39％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的62％而全纤维素酶占38％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的63％而全纤维素酶占37％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的64％而全纤维素酶占36％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的65％而全纤维素酶占35％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的66％而全纤维素酶占34％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的67％而全纤维素酶占33％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的68％而全纤维素酶占32％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的69％而全纤维素酶占31％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的70％而全纤维素酶占20％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的71％而全纤维素酶占29％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的72％而全纤维素酶占28％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的73％而全纤维素酶占27％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的74％而全纤维素酶占26％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的75％而全纤维素酶占25％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的76％而全纤维素酶占24％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的77％而全纤维素酶占23％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的78％而全纤维素酶占22％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的79％而全纤维素酶占21％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的80％而全纤维素酶占20％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的81％而全纤维素酶占19％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的82％而全纤维素酶占18％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的83％而全纤维素酶占17％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的84％而全纤维素酶占16％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的85％而全纤维素酶占15％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的86％而全纤维素酶占14％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的87％而全纤维素酶占13％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的88％而全纤维素酶占12％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的89％而全纤维素酶占11％、β-葡糖苷酶占总蛋白质的90％而全纤维素酶占10％。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中重量∶重量比例上β-葡糖苷酶的量大致等于全纤维素酶制品的量。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中重量∶重量比例上β-葡糖苷酶的量大致是全纤维素酶制品量的50％。
如上所述，β-葡糖苷酶通常以与全纤维素酶制品的量有关的量存在于组合物中。在一些实施方案中，组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中β-葡糖苷酶存在的量在酶的活性基础上与全纤维素酶制品的量相关。在一些实施方案中，根据本发明的组合物特征在于β-葡糖苷酶活性与全纤维素酶制品活性之间的关系。在一些实施方案中，组合物包含全纤维素酶制品和β-葡糖苷酶，其中β-葡糖苷酶的活性和全纤维素酶制品的活性按照酶活性的比例提供。
上面提到的酶的活性比例与β-葡糖苷酶和全纤维素酶制品各自的标准测定条件有关。β-葡糖苷酶的活性和全纤维素酶制品的活性可用本领域已知方法测定。在这一背景下，可使用以下条件。β-葡糖苷酶的活性可用本领域已知的任何方法测定，如Chen，H.、Hayn，M.和Esterbauer，H″，Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases fromTrichoderma reesei″，Biochimica et Biophysica Acta，1992，1121，54-60所述的测定方法。1pNPG表示，50℃(122°F)和pH 4.8下，1μmol硝基酚在10分钟内从对位-硝基苯基-B-D-吡喃葡萄糖苷中释放出来。全纤维素酶制品的纤维素酶活性可用羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)作为底物来测定。全纤维素酶活性的测定，在CMC活性方面来测量。这个方法测量由作用于CMC的酶混合物所产生的还原端的产生，其中1个单位是释放1μmol产物/分钟的酶量(Ghose，T.K，Measurement ofCellulse Activities，Pure & Appl.Chem.59，第257-268页，1987)。
通常，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含了范围在约0.5到25pNPG/CMC单位的酶活性比例。在一些实施方案中，酶活性比例是从大约1到20pNPG/CMC单位，或从大约1.5到15pNPG/CMC单位，或从大约2到10pNPG/CMC单位，或从大约2.5到8pNPG/CMC单位，从大约3到7pNPG/CMC单位，或从大约3.5到6.5pNPG/CMC单位，或从大约4到6pNPG/CMC单位，或从大约4.5到5.5pNPG/CMC单位，或从大约5到6pNPG/CMC。特别适合的是，例如大约5.5pNPG/CMC单位的比例。
6.2方法
除了以上所述的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物，也提供了此处所述组合物的使用方法。在一般方面，本教导涉及水解纤维素物质。这些方法通常包括将纤维素物质与β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶接触，并在足以影响纤维素物质水解并从而生成产物的条件下，将纤维素物质和β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶维持在一起。在一些实施方案中，提供了将纤维素转化为葡萄糖的方法。
通常，与单独的全纤维素酶制品相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶组合物有大约相等或更好的特异性性能。此处所述方法通常比单独使用全纤维素酶的同等方法更加成本有效。在特定实施方案中，与其他单独使用全纤维素酶的同等方法相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶和此处所述方法需要较少的全纤维素酶蛋白质来水解纤维素物质。例如使用糖化作用测定，与单独使用全纤维素酶的同等方法相比，主题方法将水解纤维素物质所需的全纤维素酶的量减少了大约一半。在特定实施方案中，与其他单独使用全纤维素酶的同等方法相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶和此处所述方法需要更少的全纤维素酶活性来水解纤维素物质。例如使用糖化作用测定，与单独使用全纤维素酶的同等方法相比，主题方法将水解纤维素物质所需的全纤维素酶活性减少了大约一半。
此处提供了减少水解纤维素物质所需的全纤维素酶制品量的方法，该方法通过添加有效量的β-葡糖苷酶，则水解所述纤维素物质所需的所述全纤维素酶制品量减少。在一些实施方案中，与单独的所述全纤维素酶制品相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶有大约相等或更好的特异性性能。通常，在重量∶重量比例上β-葡糖苷酶的量大于全纤维素酶量的10％。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值大于0.61pNPG/CMC单位。
本领域已知检测水解纤维素物质所需全纤维素酶的减少的方法，例如糖化作用测定。在一些实施方案中，提供了减少水解纤维素物质所需的全纤维素酶制品量的方法，该方法是通过添加有效量的β-葡糖苷酶，其中，β-葡糖苷酶减少了在50℃下大于48小时之内水解超过30％纤维素物质所需的全纤维素酶的量。
还提供了水解纤维素物质的方法，该方法包括将纤维素物质与有效量的β-葡糖苷酶和全纤维素酶组合物接触，其中β-葡糖苷酶的量减少了水解纤维素物质所需的全纤维素酶组合物的量。在一些实施方案中，在重量∶重量比例上β-葡糖苷酶的量大于全纤维素酶量的10％。在一些实施方案中，在重量∶重量比例上其中的β-葡糖苷酶的量小于全纤维素酶量的80％。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值大于0.61pNPG/CMC单位。
β-葡糖苷酶通常在量上与全纤维素酶制品的量相关。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶以在重量∶重量比例(如蛋白质∶蛋白质比例)上与全纤维素酶制品的量相关的量存在。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶的量相对于总蛋白质范围在大于10％到90％，例如，相对于总蛋白质样为11％到90％、15％到85％、20％到80％、25％到75％、30％到70％、35％到65％、40％到60％、45％到55％和50％。
在一些实施方案中，β-葡糖苷酶的量相对于总蛋白质大于例如10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更多。
在一些实施方案中，方法中β-葡糖苷酶的量，以β-葡糖苷酶活性和全纤维素酶制品活性间关系的方式提供。在一些实施方案中，方法中β-葡糖苷酶活性的量，按照与全纤维素酶制品酶活性相关的酶活性来提供。一般来说，β-葡糖苷酶与全纤维素酶制品的酶活性之比是在约0.5到25pNPG/CMC单位的范围中。在一些实施方案中，酶活性之比是从大约1到20pNPG/CMC单位，或从约1.5到15pNPG/CMC单位，或从大约2到10pNPG/CMC单位，或从大约2.5到8pNPG/CMC单位，从大约3到7pNPG/CMC单位，或从大约3.5到6.5pNPG/CMC单位，或从大约4到6pNPG/CMC单位，或从大约4.5到5.5pNPG/CMC单位，或从大约5到6pNPG/CMC。特别合适的是例如大约5.5pNPG/CMC单位的比例。
此处所述的组合物可以以下有效量添加：从固体的大约0.001到10.0％wt.，更优选从固体的大约0.025％到4.0％wt.，以及最优选从固体的约0.005％到5.0％wt.。
在本公开内容的方法中，纤维素物质可以是任何含有纤维素的材料。纤维素物质可以包括但不限于纤维素和半纤维素。在一些实施方案中，纤维素物质包括但不限于生物质、草质材料、农业残渣、林业残渣、城市固体废物、废纸、以及纸浆和纸的残渣。
在一些实施方案中，纤维素物质包括木材、木浆、造纸污泥、纸浆废流、刨花板、玉米秆、玉米纤维、米(rice)、纸和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、果浆(fruit pulp)、蔬菜浆(vegetable pulp)、浮石、酒粕(distillers grain)、草、稻壳、甘蔗渣、棉、黄麻、***、亚麻、竹、剑麻、蕉麻、稿秆、玉米芯、酒粕、叶、麦秸秆、椰毛、藻类、柳枝稷，和它们的混合物。
纤维素物质可依原样使用或可用本领域已知的常规方法进行预处理。这样的预处理包括化学、物理和生物的预处理。例如，物理预处理技术可无限制包括研磨、破碎、蒸煮/蒸汽***、辐照和热水流裂解(hydrothermolysis)的多种类型。化学预处理技术可无限制包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳以及pH控制的热水流裂解。生物预处理技术可无限制包括应用溶解木质素的微生物。
本公开内容的方法可用于单糖、二糖和多糖的生产，这些糖类作为微生物的化学或发酵原料，用于产生有机产品、化学品和燃料、塑料及其他产物或中间体。特别是，加工残渣(干燥的酒粕、来自酿造的酒糟(spentgrain)、甘蔗渣等)的价值可通过纤维素或半纤维素的部分或完全溶解而增加。除了乙醇，从纤维素和半纤维素还可生产的一些化学品包括丙酮、醋酸盐、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糖醛、聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate)、cis、顺-黏康酸、动物饲料和木糖。
本教导的各方面可根据下述的例子中得到进一步的理解，这些例子不应解释为限制本教导的范围。对本领域技术人员而言，很明显的是，可以对本材料和方法进行许多改变而不背离本教导。
7.实施例
实施例7.1糖化作用测定的材料和方法
用于该测定的全纤维素酶和β-葡糖苷酶如下：里氏木霉全纤维素酶，其作为LAMINEX BG从美国Genencor可获得；里氏木霉RUT-C30全纤维素酶(ATCC No.56765)；里氏木霉BGLl(CEL3A)(见美国专利No.6,022,725)；里氏木霉BGL3(CEL3B)(见美国专利No.6,982,159)和里氏木霉BGL7(CEL3E)(见USPN20040102619)。所有酶在pH5的50mM醋酸钠中稀释到期望浓度。
除微晶纤维素(Avicel)外，测定中所有底物都在使用前得到期望百分比的固体。PCS和甘蔗渣混合，以容许向微量滴定板精确移液。使用的底物材料：预处理的玉米秆PCS和甘蔗渣由美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory，NREL)以稀硫酸进行预处理，洗涤并调至pH5。酸预处理玉米杆(PCS)是56％纤维素、4％半纤维素和29％木质素。酸预处理蔗渣(APB)是53％纤维素，3％半纤维素和31％木质素。微晶纤维素(纯的结晶纤维素)加入平板中，然后在pH5下用50mM醋酸钠稀释至大约7％(7mgs/ml)。PASC(磷酸溶胀纤维素，纯的，无定形纤维素)，在pH5下在50mM醋酸钠中稀释至0.5％PASC。
酶的用量基于总蛋白质，总蛋白质用BCA蛋白质测定试剂盒(PierceCat.No.23225)或缩二脲法测量。总酶用加载(loading)是20mg蛋白质/克纤维素。随后应用了全纤维素酶制品对β-葡糖苷酶的几个比例，如50∶50的比例是10mg/g全纤维素酶制品和10mg/g β-葡糖苷酶。
每孔150微升底物用重复性移液器(repeater pipette)加载到平底的96孔微量滴定板中。20微升适当稀释的酶溶液加在顶部。PASC情况下，酶先加入板中。用铝板密封器盖上板，置于37或50℃的培养箱中(伴随摇动)，进行时间在表格1中说明。通过向每个孔添加100μl pH10的100mM甘氨酸来终止反应。伴随彻底混合，令其内容物通过Millipore96孔过滤板(0.45μm，PES)进行过滤。将滤液稀释到含有100μl pH10的10mM甘氨酸的板中，产生的可溶性糖的量用HPLC测量。所有Agilent 1100系列的HPLC都配备着脱灰/保护柱(Biorad#125-0118)和基于Aminex lead的碳水化合物(carbohydrate)柱(Aminex HPX-87P)。移动相是水，流速0.6ml/min。
对于摇瓶实验，将稀酸预处理的玉米秆加至500ml摇瓶中，从而初始水解将含有7％纤维素。用400微升四环素和300微升环己酰胺阻止微生物生长。最终水解物工作体积用缓冲液(pH4.8的0.1M柠檬酸钠)加至100ml。最后，以20mg蛋白质/克纤维素的恒定总蛋白质加载来添加酶，随后紧密地盖上每个摇瓶，将其置入摇床/培养箱。每一次酶加载均在37和50℃下运行，一式两份，在200rpm下运行72小时。产生的可溶性糖如上所述用HPLC进行测量。
实施例7.2在PASC底物上的全纤维素酶和β-葡糖苷酶1的糖化作用测定
在1％PASC上实施微量滴定板糖化作用测定，其中使用含有和不含BGL1的里氏木霉全纤维素酶制品。图1显示了使用里氏木霉全纤维素酶LAMINEX BG和BGL1在1％PASC上的微量滴定板糖化作用测定。图1(a)显示了针对含有和不含BGL1的全纤维素酶的给定剂量作图的总％转化率(conversion)，图1(b)显示了相同总蛋白质加载下，全纤维素酶单独和全纤维素酶连同BGL1所产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。
图1(a)显示出，将10mg/g BGL1添加到10mg/g全纤维素酶中，与20mg/g全纤维素酶相比，将同样或更多的纤维素转化为可溶性糖。也就是说，约一半的全纤维素酶可用β-葡糖苷酶代替，得到与单独的全纤维素酶相比，具有同等或更好的特异性性能的酶混合物。此外，以等量蛋白质加载时，全纤维素酶β-葡糖苷酶混合物的产物具有比单独的全纤维素酶的产物更高的葡萄糖/纤维二糖比例。以BGL1替换约一半的全纤维素酶制品并不影响总糖化率。
使用本领域已知方法，将CBH2启动子下具有乙酰胺酶(amdS)选择性的编码里氏木霉BGL1的多核苷酸，用电穿孔转化里氏木霉全纤维素酶的生产菌株。稳定的转化子生长一周，以SDS-PAGE评估所述转化子的BGL1的表达水平。相对于总纤维素酶蛋白质显示高BGL1表达(总蛋白质的约50％)的那些转化子被测试了对磷酸溶胀纤维素的活性。结果显示，与不曾转化来过量表达BGL1的里氏木霉全纤维素酶相比，一些表达BGL1的转化子有同等或更高的特异性性能。
实施例7.3全纤维素酶和β-葡糖苷酶1在微晶纤维素、预处理玉米秆(PCS)和甘蔗渣上的糖化作用测定
图1所述添加BGL1所发现的效应，并不是PASC底物(其为纯的无定形纤维素)独有的。用其他纤维素物质(微晶纤维素(Avicel)、稀酸预处理的玉米秆(PCS)和稀酸预处理的甘蔗渣)也观察到相似的效应。图2显示了如PASC上所述的实验结果，所述实验在7％纤维素固体的微晶纤维素上实施。图2显示了使用里氏木霉全纤维素酶LAMINEX BG和BGL1在7％微晶纤维素上的微量滴定板糖化作用测定。图2(a)显示了针对含有和不含BGL1的全纤维素酶的给定剂量作图的总％转化率。图2(b)显示了相同总蛋白质加载下全纤维素酶单独和全纤维素酶连同BGL1产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。类似于PASC，用BGL1替换约一半的全纤维素酶制品并不改变总％转化率。附加的β-葡糖苷酶增加了纤维二糖对葡萄糖的比值，但该效应并不像用PASC那样明显，因为在微晶纤维素上全纤维素酶单独产生高得多的葡萄糖对纤维二糖的比值。PCS和蔗渣的结果，在总转化率和葡萄糖对纤维二糖的比值上都与用微晶纤维素观察到的类似(图3和图4)。图3显示了用里氏木霉全纤维素酶LAMINEX BG和BGL1在7％纤维素的PCS上的微量滴定板糖化作用测定：(a)针对含有和不含BGL1的全纤维素酶的给定剂量绘制了总％转化率；(b)相同总蛋白质加载下全纤维素酶单独和全纤维素酶连同BGL1产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。在7％PCS上的全纤维素酶对BGL1的多种比值也在摇瓶中被测试。摇瓶数据与微量滴定板中观察到的良好相关(数据未出示)。图4是显示用木霉属全纤维素酶和木霉属β-葡糖苷酶1在7％甘蔗渣上的微量滴定板糖化作用测定结果的图表，其中显示了总百分比转化率(A)和所产生的纤维二糖和葡萄糖的相对量(B)和通过增加β-葡糖苷酶量的百分比转化率(C)。
实施例7.4.丝状真菌全纤维素酶和β-葡糖苷酶在预处理玉米秆上的糖化作用测定
为查明添加β-葡糖苷酶的效应是否为所述里氏木霉菌株全纤维素酶所独有，将7％纤维素固体的PCS的实验用Rut C30(另一种里氏木霉全纤维素酶)重复进行。图5显示用Rut C30全纤维素酶和BGL1在7％纤维素的PCS上的微量滴定板糖化作用测定：(a)针对含有和不含BGL1的Rut C30全纤维素酶的给定剂量绘制了总％转化率；(b)相同总蛋白质加载下，Rut C30全纤维素酶单独和Rut c30全纤维素酶连同BGL1所产生的纤维二糖和葡萄糖的相对量。
以同等的蛋白质，Rut C30全纤维素酶水解的纤维素不会如LaminexBG二者任一那么多(图3)。当约四分之一或一半Rut C30全纤维素酶蛋白质被BGL1代替时，％转化率大于等量的Rut C30全纤维素酶单独(图5)。在这一情形下，β-葡糖苷酶的添加可用于减少达到特定转化率所需的酶总剂量。
实施例7.5全纤维素酶和纯化的β-葡糖苷酶1在PACS和预处理玉米秆(PCS)上的糖化作用测定
图6显示了用里氏木霉全纤维素酶LAMINEX BG和纯化的BGL1于1％PASC上的微量滴定板糖化作用测定：(a)针对含有和不含BGL1的里氏木霉全纤维素酶和BGL1的给定剂量绘制总％转化率；以及(b)相同总蛋白质加载下，里氏木霉全纤维素酶和BGL1所产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。图7显示了用里氏木霉全纤维素酶LAMINEX BG和纯化的BGL1于7％纤维素的PCS上的微量滴定板糖化作用测定：(a)针对含有和不含BGL1的里氏木霉全纤维素酶的给定剂量绘制总％转化率；和(b)相同总蛋白质加载下，里氏木霉全纤维素酶单独和里氏木霉全纤维素酶连同BGL1所产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。用1％PASC或7％PCS作底物时(图6和图7)，来自BGL1和全纤维素酶的大约50∶50的混合物的％转化率，现在高于等量全纤维素酶单独。对于PCS和PASC上时，15mg/g里氏木霉全纤维素酶和5mg/g BGL1的混合物也产生了比20mg/g里氏木霉全纤维素酶更高的转化率。和用未纯化的BGL1一样，葡萄糖/纤维二糖的比例随纯化BGL1的添加而增高，在PASC上时可见到更加显著的差异。
实施例7.6全纤维素酶和β-葡糖苷酶3或β-葡糖苷酶7在微晶纤维素、预处理玉米秆(PCS)和甘蔗渣上的糖化作用测定
向上述全纤维素酶添加β-葡糖苷酶的益处并不限于BGL1。也在微量滴定板糖化作用测定中在PASC和PCS上测试了和全纤维素酶一起的两种其他里氏木霉β-葡糖苷酶，BGL3和BGL7。
图8显示了用里氏木霉全纤维素酶Laminex BG和已纯化BGL3于1％PASC上的微量滴定板糖化作用测定。(a)针对含有和不含BGL3的里氏木霉全纤维素酶的给定剂量绘制了总％转化率。(b)相同总蛋白质加载下里氏木霉全纤维素酶单独和里氏木霉全纤维素酶连同BGL3所产生的纤维二糖和葡萄糖相对量。向全纤维素酶添加等部分的纯化的BGL3对于PASC具有与用BGL1所观察到的相似但稍微不明显的效应(图6a)。尽管改善超过了10mg/g全纤维素酶单独，但是10mg/g里氏木霉全纤维素酶和10mg/g BGL3的混合物并不像BGL1的情况中所观察到的那样产生与20mg/g里氏木霉全纤维素酶相等的转化率(图6a)。但15mg/g里氏木霉全纤维素酶和5mg/g BGL3的混合确实产生了优于相同总蛋白加载的单独的里氏木霉全纤维素酶的性能益处，虽然再一次地，这并不是像用BGL1所见的益处那样明显。用BGL3代替约一半的里氏木霉全纤维素酶总蛋白质也增加了葡萄糖对纤维二糖的比值，虽然总糖稍低(图8b)。对于7％纤维素的PCS效果类似。用BGL3代替约一半总蛋白质产生了相似但不是更高的纤维素到可溶性糖的百分比转化率(图9a)；结果类似但与用BGL1所见相比不够明显(图7a)。葡萄糖对纤维二糖的比值也下降了，但纤维二糖的浓度降低也更少。这并不令人惊奇，因为PCS上生产的总纤维二糖低于PASC的。
将另一种里氏木霉β-葡糖苷酶BGL7，也以和BGL1和BGL3同样的方式在1％PASC上测试。图11显示了使用里氏木霉全纤维素酶LaminexBG和纯化的BGL7于1％PASC上的微量滴定板糖化作用测定。针对含有和不含BGL7的里氏木霉全纤维素酶的给定剂量绘制了总％转化率。虽然从添加大量BGL7上存在一些改善(图10)，该改善并不像用BGL1和BGL7中所见那样明显(图6a、7a)。在相等的蛋白质基础上，没有下述BGL7和里氏木霉全纤维素酶的混合物，所述混合物产生比全纤维素酶单独更高的特异性性能。
实施例7.7全纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性
表1显示木霉属全纤维素酶(WC)和β-葡糖苷酶1的活性单位比例。将微量滴定板糖化作用测定中的酶加载从mg总蛋白质转化为活性单位，这是通过乘以活性单位/mg蛋白质。里氏木霉全纤维素酶14CMC U/mg(见Berlin A.、Maximen ko V.、Gilkes N.和Saddler J.″Optimization ofenzyme complexes for lignocellulose hydrolysis″Biotechnol.Bioeng.2007，97(2)，287-296)，而BGL1的活性用pNPG测定法测量(77pNPG U/mg)。表1列出了以wt∶wt为基础的木霉属全纤维素酶对BGL1的比值，伴有底物中每克纤维素加载的相应活性单位。将pNPG U/g值除以CMC U/g值产生了存在于混合物中的pNPG/CMC活性比，所述比独立于底物或酶加载。
表1
Figure GPA00001046681600261

Claims (44)

1.减少水解纤维素物质所需要的全纤维素酶制品量的方法，该方法通过添加有效量的β-葡糖苷酶来形成β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中水解所述纤维素物质所需要的所述全纤维素酶制品的量被减少。
2.权利要求1的方法，其中与所述全纤维素酶制品单独相比，β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶有大约相等或更好的特异性性能。
3.权利要求1的方法，其中按重量∶重量比β-葡糖苷酶的量大于全纤维素酶量的10％。
4.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值大于0.61pNPG/CMC单位。
5.权利要求1的方法，其中按重量∶重量比β-葡糖苷酶的量少于全纤维素酶制品量的80％。
6.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值小于22pNPG/CMC单位。
7.权利要求1的方法，其中按重量∶重量比β-葡糖苷酶的量大致等于全纤维素酶的量。
8.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值约为5.5pNPG/CMC单位。
9.权利要求1的方法，其中所述全纤维素酶制品包含一种或多种纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
10.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶降低了水解超过30％纤维素物质所需要的全纤维素酶量。
11.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶降低了在50℃在大约48小时内水解超过30％纤维素物质所需要的全纤维素酶的量。
12.权利要求1的方法，其中全纤维素酶制品是木霉属全纤维素酶。
13.权利要求12的方法，其中所述木霉属全纤维素酶是全肉汤配制物。
14.权利要求1的方法，其中β-葡糖苷酶是木霉属β-葡糖苷酶。
15.权利要求14的方法，其中木霉属β-葡糖苷酶选自BGL1、BGL3、BGL4、BGL5、BGL6和BGL7以及其任意组合。
16.水解纤维素物质的方法，其包括：
将纤维素物质与有效量的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶接触，所述β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶与全纤维素酶单独相比，包含大约相等或更好的特异性性能。
17.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含按重量∶重量比相对于全纤维素酶大于10％的β-葡糖苷酶。
18.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含大于0.61pNPG/CMC单位的β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值。
19.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含按重量∶重量比相对于全纤维素酶少于80％的β-葡糖苷酶。
20.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含大于0.61pNPG/CMC单位的β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值。
21.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含大约小于22pNPG/CMC单位的β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值。
22.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含按重量∶重量比大致等于全纤维素酶的量的β-葡糖苷酶的量。
23.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含约为5.5pNPG/CMC单位的β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值。
24.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含一种或多种纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
25.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含β-葡糖苷酶的量来降低水解超过30％纤维素物质所需要的全纤维素酶的量。
26.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含β-葡糖苷酶的量来降低在50℃大约48小时内水解超过30％纤维素物质所需要的全纤维素酶的量。
27.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含木霉属全纤维素酶。
28.权利要求16的方法，其中所述木霉属全纤维素酶是全肉汤配制物。
29.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含木霉属β-葡糖苷酶。
30.权利要求16的方法，其中β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶包含选自BGL1、BGL3、BGL4、BGL5、BGL6和BGL7的木霉属β-葡糖苷酶。
31.β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其包含大于10％的β-葡糖苷酶。
32.β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其包含的β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值大于0.61pNPG/CMC单位。
33.β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其包含按重量∶重量比大于全纤维素酶量的10％的β-葡糖苷酶的量。
34.β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其包含有效量的β-葡糖苷酶，其中所述β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶具有与全纤维素酶制品相比大约相等或更好的特异性性能。
35.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中按重量∶重量比β-葡糖苷酶的量少于全纤维素酶量的80％。
36.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中按重量∶重量比β-葡糖苷酶的量与全纤维素酶的量大致相等。
37.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值大于0.61pNPG/CMC单位。
38.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值小于22pNPG/CMC单位。
39.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中β-葡糖苷酶活性对全纤维素酶活性的比值约为5.5pNPG/CMC单位。
40.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中所述全纤维素酶制品包含一种或多种纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
41.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中全纤维素酶制品是木霉属全纤维素酶。
42.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中所述木霉属全纤维素酶是全肉汤配制物。
43.权利要求34的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中β-葡糖苷酶是木霉属β-葡糖苷酶。
44.权利要求43的β-葡糖苷酶增强的全纤维素酶，其中木霉属β-葡糖苷酶选自BGL1、BGL3、BGL4、BGL5、BGL6和BGL7。
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