CN101792795B

CN101792795B - 水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

Info

Publication number: CN101792795B
Application number: CN2009101566203A
Authority: CN
Inventors: 王玲; 黄世文; 刘连盟
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: CN101792795A

Abstract

水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，属于生物技术领域。其包括对立枯丝核菌8个不同融合群菌株总DNA提取、PCR扩增、rDNA-ITS序列测定、分析等过程的基础上，找到了鉴别立枯丝核菌不同融合群菌株的碱基位点，分别设计出可鉴别不同融合群菌株的高特异性鉴别引物，与通用引物ITS4结合，同时增加通用引物ITS1，利用一步双重PCR方法检测，能得到特异性500bp片段和700bp的DNA片段，成功地进行不同融合群菌株的高特异性PCR鉴别。该发明对为水稻立枯丝核菌的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定立枯丝核菌引起的多种病害如纹枯病、立枯病等综合治理决策提供理论参考。

Description

水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻纹枯病菌融合群判定的鉴别方法。

背景技术

“民以食为天，食以稻为先”。水稻是我国主要的粮食作物，在我国国民经济和农业生产上发挥了重要作用。近年来，由于各种水稻病害流行小种的爆发及其致病力的变异，危害程度加重，严重威胁水稻的生产安全。水稻纹枯病是世界上水稻产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。随着矮秆、多蘖杂交稻组合的大力推广、施肥量及种植密度的提高以及气候变暖等因素，水稻纹枯病在我国的发生及危害日益严重。20世纪70年代以前，该病在我国仅为零星发生；70年代后迅速蔓延，并于80年代在我国水稻种植区大面积爆发；90年代以后，该病的发生为害更为猖獗，南方稻区的发病面积普遍超过50％以上。据报道，1982年水稻纹枯病在全国的发病面积约为1000万hm²，损失稻谷约为3.5×10⁹kg；1995年发病面积扩大到近1600万hm²，损失稻谷超过11×10⁹kg。近几年，水稻纹枯病在我国发病面积为1500～2000万hm²，每年损失稻谷约6×10⁹kg，一般发病田块导致减产15％～20％，严重时达60％～70％，占水稻病虫害损失的40％～50％。目前在我国南方大多数水稻种植区，纹枯病已经成为最重要的水稻病害，无论是发生面积或造成的为害损失均居病害之首，成为制约水稻生产的重要障碍之一。

水稻纹枯病的病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，是丝核菌属真菌中最复杂、最庞大同时也是研究比较深入的一个集合种。R.solani是水稻、玉米、大豆、草坪草和高粱等作物的纹枯病和立枯病的致病菌，还能引起马铃薯黑痣病、油菜菌核病、甜菜烂根病、豌豆茎腐病以及许多作物(如大豆、花生和蚕豆)的网斑或叶枯病等主要病斑(陈延熙1985、喻大昭2000)。目前，主要根据菌丝融合群的方法来划分R.solani在生理上特异的菌株。Ogoshi等(1987)、李华荣(1999)研究认为：当两个丝核菌分离物配对培养时，在光学显微镜下可以观察到菌丝生长和交叠。如果发生菌丝融合，观察到菌丝间的吸引和融合细胞的坏死，便称这两个分离物为相同的融合群；如果不发生融合，或不发生菌丝坏死，便不属于相同的融合群。根据菌丝融合与否，现已将R.solani分为14个融合群(AG-1～AG-13，AG-BI)。融合群又可以分为融合亚群，如Ogoshi等根据AG-1融合群内的菌株致病性将其分为AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三个亚群。李华荣等(1990)对四川省东、南稻区采集的108个水稻纹枯病菌按菌丝融合的方法进行菌系鉴定，其中水稻纹枯病菌隶属于AG-1为97％，AG-4为1％，AG-Bb为2％。杨艮华等(2002)对来自云南省20多个县市采集的水稻纹枯病样本进行分离得到54个菌株，按照菌丝融合将水稻纹枯病菌分为AG-1IA、AG-1IC、AG-6GW、AG-Bb和AGI-II5个菌系。由于AG-1IA的致病力最强且分离获得比例最高，目前普遍认为AG-1IA是水稻纹枯病的主要致病菌。

Ogoshi等(1987)和李华荣等(1999)认为，菌丝融合群分类法是当前丝核菌最成功的分类手段，但其不能提供R.solani融合群或亚群间以及融合群内或亚群内更多的遗传信息。因此，随着分子生物学及其相关科学的快速发展，以PCR为基础的分子生物学技术为解决立枯丝核菌的鉴定诊断提供了最有力的工具。直接测定立枯丝核菌的遗传物质(DNA)成为了分子诊断最有力的工具。在真菌的分子诊断和鉴定中，最有价值的基因组区域之一是核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)重复单元，这是由于rDNA在基因组中有多个拷贝(100～500)，并且每个单位的rDNA基因其保守区和可变区掺杂分布。White等(1999)公布的真菌rDNA特异性扩增的通用引物序列更是起了巨大的推动作用。在真菌分子分类研究过程中，rDNA的内转录间隔区(Internal Transcribed SpacerRegion，ITS)序列常作为种级分类群及种下个体差异研究的PCR选择区域。目前ITS-5.8S rDNA序列分析技术在R.solani融合群内和融合群间的分子特征及分子诊断研究中得到广泛的应用。Kuninaga等(1997)对隶属10个融合群17个亚融合群的45个立枯丝核菌的ITS-5.8S rDNA序列进行分析比较，结果表明，同一亚融合群不同菌株间的同源性达96％以上，不同亚融合群之间的同源性为66％~100％，不同融合群之间的同源性为55％~96％。结果说明，ITS-5.8SrDNA序列分析方法可对立枯丝核菌在融合群、融合亚群、甚至是亚亚群等分类单元进行有效的划分。Boysen等(1996)对AG-1和AG-4融合群的菌株进行rDNA-ITS序列比对，发现其序列差异较大。Takeshi等(2004)认为ITS-5.8S rDNA序列能将AG-1ID与AG-1的其它融合亚群进行有效区分。Salazar等(2000)利用ITS-5.8S rDNA序列分析法，对AG-2不同亚群及AG-2-2亚群的不同亚亚群进行了研究，表明ITS-5.8S rDNA序列分析能对这两个分类单元进行有效划分。上述结果证明，ITS-5.8S rDNA序列分析方法在立枯丝核菌不同级别的分类、鉴定中具有不可取代的地位。因此，利用立枯丝核菌ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物，可以对该病原菌引起的病害进行诊断和检测，这将对病害的防治具有实际的生产意义。

特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来真菌分子诊断取得的重要进展。通过PCR扩增就可以在混合样本中特异性地检测出病原菌。基于核糖体DNA(rDNA)而构建的特异性引物进展较快，在诊断病原真菌上取得了突破性进展。US5585238号专利针对ITS区分别设计了鉴定Septoria，Pseudocercosporella和Mycosphaerella的特异性引物。US5800997号专利针对ITS区设计了鉴定Cercospora，Helminthosporium，Kabatiella和Puccinia的特异性引物。WO95/29260号专利针对ITS区设计了鉴定Fusarium的特异性引物。在丝核菌(Rhizoctonia)检测方面，US6485907号专利针对ITS序列，设计了用于检测禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)的特异性引物。Carling等(2002)根据立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG2融合群内rDNA ITS序列差异，分别设计了特异性引物检测AG-2-1、AG-2-2IIIB、AG-2-2VI、AG-2-2LP、AG-2-3和AG-2-4。Andrea等(1998)根据与水稻纹枯病有关的3种真菌复合体Rhizoctoniasolani、Rhizoctonia oryzae和Rhizoctonia oryzae-sativae的ITS序列分析结果，从ITS1和ITS2区域的差异中设计了多对引物，利用这些引物可以快速、准确地区分这3种病原菌。然而，水稻纹枯病菌是个集合种，现有的对水稻纹枯病菌的鉴别方法是远远不够的，尚需要新的技术进一步补充完善。传统的菌丝融合判定标准具有较多的主要因素，不利于客观准确的判断水稻纹枯病菌的融合群类型。现时的分子技术只能判定少数融合群类型，无法区别多个融合群类型。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速、准确判定水稻纹枯病菌融合群类型的技术方案。本发明根据ITS-5.8S rDNA序列设计不同菌丝融合群鉴别的特异性引物，作为水稻纹枯病菌融合群判定的鉴别引物，并通过水稻纹枯病菌DNA提取，利用特异性鉴别引物和-对通用引物配对，进行一步双重PCR扩增，根据电泳图谱鉴定水稻纹枯病菌的融合群类型。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤：

1)隶属于立枯丝核菌不同菌丝融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的标准菌株R1～R8，分别采用改良的CTAB法提取其基因组总DNA；

2)设计判定水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物：以步骤1)得到的不同融合群标准菌株DNA为模板，以ITS1和ITS4为通用引物，分别进行各个菌丝融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列的PCR扩增，扩增后均得到单一的700bp的扩增条带，序列测定分析后，得到立枯丝核菌不同融合群菌株ITS区的核苷酸序列，找到区分不同菌丝融合群菌株ITS-5.8S rDNA序列的特异性碱基位点，设计出判定水稻纹枯病菌融合群类型的特异性鉴别引物。

ITS1核苷酸序列如SEQ No.1所示，

ITS4核苷酸序列如SEQ No.2所示，

菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.3所示，

菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.4所示，

菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.5所示，

菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.6所示，

菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.7所示，

菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.8所示，

菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.9所示，

菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.10所示，

菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.11所示，全序列包括了3’端18S rDNA小亚基的部分核苷酸序列、内转录间隔区1的序列(18S与5.8S之间)、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列(5.8S与28S之间)、以及5’端28S rDNA大亚基的部分序列；

菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.12所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.13所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.14所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.15所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.16所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.17所示，全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列；

菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列如SEQ No.18所示；全序列包括了18S rDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8S rDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28S rDNA的部分序列。

3)从水稻纹枯病感病茎杆或叶片中分离、纯化水稻纹枯病菌；

4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的总基因组DNA；

5)以步骤4)得到的水稻纹枯病菌DNA为PCR模板，用步骤2)中区分不同菌丝融合群菌株AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的特异性鉴别引物作为水稻融合群判定的鉴别引物，同时加入通用引物ITS4和ITS1，进行一步双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异性片段，即可判断出水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出700bp的单一条带，即可判断出水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤1)和步骤4)中立枯丝核菌标准菌株或水稻纹枯病菌基因组DNA采用改良的CTAB法提取：取0.2g菌丝，液氮研磨后加入800μLDNA提取液，65℃下水浴保温30min，10000g离心10min；取上清液用等体积的氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提，10000g离心10min；用氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提再抽提1次；上清液加入等体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心10min；弃上清，在沉淀中加入1M NaCl 300μL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提，10000g离心10min；取上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4℃下10000g离心10min，弃上清液，用70％的酒精清洗，抽干后加TE缓冲液充分溶解，即得到菌株的基因组总DNA，在-20℃下保存备用。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤2)中不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列的PCR扩增。PCR反应体系为：25μL总体积中含有10×Taq reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl₂，2.5mM dNTP，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，标准菌株DNA 100ng，0.5U Taq DNA polymerase，加ddH₂O补足体积至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。PCR反应结束后，在扩增产物中加入2.5μL的10×loading buffer于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤5)中水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR反应体系：25μL总体积中含有10×Taq reactionbuffer 2.5μL，25mM MgCl₂，2.5mM dNTP，10μM水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，水稻纹枯病菌DNA 100ng，0.5U Taq DNA polymerase，加ddH₂O补足体积至25μL，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。PCR扩增后扩增产物中加入2.5μL的10×loadingbuffer于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA提取液为：1L溶液中含有20g CTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、20mM EDTA和1ml β-巯基乙醇，pH值为8.0。

所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA沉淀液为：1L溶液中含有10g CTAB、50mM Tris-HCl和10mMEDTA，pH值为8.0。

本发明利用特定的重复多拷贝ITS-5.8S rDNA序列，通过Clustal X分析软件对立枯丝核菌不同菌丝融合群菌株的ITS-5.8S rDNA序列分析比较。结果显示，不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列之间有较大的差异。通过分析比较得到的变异位点为鉴别引物，能很好地区分各个菌丝融合群类型，并且有效地判定水稻纹枯病菌隶属的菌丝融合群。该发明会使水稻纹枯病用PCR技术进行田间早期诊断，有利于及早掌握病原菌田间发生的类型及发展情况。使水稻纹枯病的研究向定性检测方向发展，能够利用特异性引物定性检测出田间纹枯病菌的病原菌类型，对水稻纹枯病菌的检疫检验和生产实践中的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定引起的水稻纹枯病的病原物的综合治理策略提供理论参考，对进出境其它由丝核菌引起重要的检疫性真菌病害的分子检测具有实际借鉴意义。本发明设计了8条特异性鉴别引物，用双重PCR的扩增图谱辨别水稻纹枯病菌的融合群类型，具有准确快捷、公正客观、经济实用的特点。

附图说明

图1为不同菌丝融合群标准菌株的ITS-5.8S rDNA扩增电泳图；

图2为水稻纹枯病菌融合群判定的一步双重PCR扩增电泳图。

图中：M为标准DNA分子标记(100bp)；1为阴性对照(H₂O)；2-9分别为隶属于融合群AG-BI、AG-8、AG-6、AG-5、AG-1IA、AG-4、AG-2-1和AG-1IB的标准菌株R8、R7、R6、R5、R1、R4、R3和R2。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步说明本发明。

本发明的实验选用的材料：大田自然发病的水稻纹枯病样品，以及实验室保存的分别隶属于不同菌株融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8、AG-BI的标准菌株R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8。

主要试剂：10×Taq reaction buffer、MgCl₂、dNTP、Taq DNA聚合酶、ddH₂O、100bp DNA marker、DNA凝胶回收试剂盒(TAKARA)、E.coli DH5α、X-gal、IPTG、pMD18-T easy Vector(TAKARA)、引物均由上海生物工程有限公司合成。

实施例1 从感病的水稻茎杆上分离、纯化水稻纹枯病菌

从中国水稻研究所浙江富阳试验基地水稻田，采集感纹枯病的国稻六号杂交稻的水稻茎杆，带回实验室。将病杆组织经无菌水冲洗3次，用灭菌过的滤纸吸干组织表面的水分。再将病组织剪成长宽为5mm的小块，将其放置于2％水琼脂(琼脂20g，水1000mL)培养基中，置28℃培养箱下培养，24～36h后病组织周围长出丝核菌特征的菌落，用无菌的刀片切取单菌丝尖端移植于PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL)培养基中进行纯化，置28℃培养箱中纯化培养后，保存于4℃冰箱中备用。

实施例2 菌株基因组DNA的提取

菌丝的获取：将保存于斜面培养基上的立枯丝核菌标准菌株或分离得到的水稻纹枯病菌经平板活化后，挑取一小块菌丝块(约0.5mm×0.5mm)移入装有100mLPDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培养基的250mL三角瓶中，于28℃摇床振荡培养5～6d。将获得的培养物用灭菌水冲洗2次，然后用真空泵将培养物充分抽干，保存于-20℃冰箱中备用。

DNA提取：采用改良的CTAB法提取菌株总基因组DNA。取0.2g吸干的菌丝，液氮研磨，加800μL DNA提取液(1L溶液中含有20g CTAB、1.4M NaCl、100mMTris-HCl、20mM EDTA和1ml β-巯基乙醇，pH值为8.0)，在1.5mL的离心管中65℃下保温30min，保温期间轻摇3-4次，10000g离心10min；取上清至一新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(V(氯仿)∶V(异戊醇)＝24∶1)混合液，充分混匀，10000g离心10min；再取上清至一新的离心管中，再次加入等体积的氯仿/异戊醇(V(氯仿)∶V(异戊醇)＝24∶1)混合液，充分混匀，10000g离心10min；取上清加入等体积的DNA沉淀液(1L溶液中含有10g CTAB、50mMTris-HCl和10mM EDTA，pH值为8.0)，充分混匀，10000g离心10min；弃上清，沉淀中加入1M NaCl 300μL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇(V(氯仿)∶V(异戊醇)＝24∶1)混合液，充分混匀，10000g离心10min；取上清至一新的离心管中，加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，冰上放置30min沉淀DNA；4℃下10000g离心10min，弃上清，用70％的酒精洗涤沉淀2次，晾干，加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH值为8.0)充分溶解后，在-20℃下保存备用，即得到菌株的总基因组DNA。

DNA浓度测定，将样品用核酸-蛋白仪检测DNA的浓度和纯度(结果见表1)，将样品稀释为100ng/μl，用于PCR扩增。

表1 菌株总基因组DNA的纯度和浓度检测结果

实施例3 不同菌丝融合群标准菌株的ITS-5.8S rDNA序列的PCR扩增

对隶属于不同菌丝融合群菌株AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的标准菌株R1～R8，进行ITS-5.8S rDNA序列的PCR扩增。采用White等(1990)设计的通用引物ITS1和ITS4，由上海生物工程有限公司合成，ITS1和ITS4的序列分别为：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；SEQ No.1)，ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；SEQ No.2)。PCR反应体系为：25μL总体积中含有10×Taq reaction buffer 2.5μL，25mMMgCl₂，2.5mMdNTP，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，标准菌株DNA 100ng，0.5U Taq DNApolymerase，加ddH₂O补足体积至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。PCR反应结束后，在扩增产物中加入2.5μL的10×loading buffer于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果，如图1所示。结果表明，阴性对照H2O未出现条带，不同菌丝融合群的菌株均能产生单一的扩增条带，目的片段大小为700bp。

实施例4 不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列的克隆及测序

将上述各个菌丝融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列扩增的700bp产物，经琼脂糖凝胶电泳分离后切割目的条带，使用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒分别对PCR产物进行回收和纯化，按《分子克隆》GaCl₂方法制备感受态细胞(Joseph Sambrook，2001)，将纯化产物连接到pMD18-T Vector载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，用预先涂有X-gal和IPTG的氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆子，碱法提取克隆质粒DNA，再用pMD18-T Vector两端通用引物M13F和M13R在自动测序仪上进行测序，用Cluster X软件对序列进行分析，人工删除载体序列和引物序列，得到立枯丝核菌不同融合群菌株R1(SEQ No.11)、R2(SEQ No.12)、R3(SEQ No.13)、R4(SEQ No.14)、R5(SEQNo.15)、R6(SEQ No.16)、R7(SEQ No.17)或R8(SEQ No.18)的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列。

实施例5 水稻纹枯病菌融合群判定的特异性引物的设计

根据不同融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的标准菌株R1～R8的ITS-5.8S rDNA序列分析的比对结果，分别构建了不同菌丝融合群菌株的特异性引物WG3(SEQ No.3)、WG4(SEQ No.4)、WG5(SEQNo.5)、WG6(SEQ No.6)、WG7(SEQ No.7)、WG8(SEQ No.8)、WG9(SEQ No.9)和WG10(SEQ No.10)，如表2所示，作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性引物。

表2 不同融合群菌株的特异性引物序列

实施例6 水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR检测

以提取的水稻纹枯病菌总基因组DNA为模板，鉴别不同菌丝融合群菌株AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI特异性引物WG3～WG10为引物，分别进行水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR检测。PCR反应体系：25μL总体积中含有10×Taq reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl₂，2.5mMdNTP，10μM特异性鉴别引物(WG3或WG4或WG5或WG6或WG7或WG8或WG9或WG10)，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，水稻纹枯病菌DNA 100ng，0.5UTaq DNA polymerase，加ddH₂O补足体积至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min，PCR扩增后产物中加入2.5μL的10×loading buffer于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。从图2可以看出，当以WG3和ITS1和ITS4为引物时，从PCR产物中可以检测到500bp和700bp两条特异性片段；而以其它特异性引物为引物时，只可以检测到700bp的单条带，而没有扩增出500bp的特异性片段，也没有其它的额外片段。说明500bp的DNA片段是该水稻纹枯病菌的特异性片段，是融合群AG-1IA的标准菌株R1的特异性鉴别引物WG3和通用引物ITS4共同扩增的结果。结果表明，该水稻纹枯病菌属于AG-1IA菌丝融合群。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

<130>1

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>通用引物ITS1

<400>1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>通用引物ITS4

<400>2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的特异性鉴别引物WG3

<400>3

agttggtgga tttaattccat 21

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的特异性鉴别引物WG4

<400>4

tcaaggtcct ttggggttg 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的特异性鉴别引物WG5

<400>5

atggggaatt tacttgttg 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-4标准菌株R4的特异性鉴别引物WG6

<400>6

atgttttgtg ggggggaag 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-5标准菌株R5的特异性鉴别引物WG7

<400>7

atggggaatt tattgattg 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-6标准菌株R6的特异性鉴别引物WG8

<400>8

aagtgggact tttaattta 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-8标准菌株R7的特异性鉴别引物WG9

<400>9

atgggggaat ttattcatt 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的特异性鉴别引物WG10

<400>10

acgggggaaa tttttattt 19

<210>11

<211>618

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的ITS-5.8S rDNA序列

<400>11

aatgaggagt tgagttgttg ctggcctttt ctaccttaat ttggcaggag ggggcatgtg 60

cacaccttct ctttcatcca tcacaccccc tgtgcacttg tgagacagca atagttggtg 120

gatttaattc catccatttg ctgtctactt aatttacaca cactctactt aatttaaact 180

gaatgtaatt gatgtaacgc atctaatact aagtttcaac aacggatctc ttggctctcg 240

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 300

atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct tggtattcct tggagcatgc ctgtttgagt 360

atcatgaaat cttcaaagta aaccttttgt taattcaatt ggtctttttt actttggttt 420

tggaggatct tattgcagct tcacacctgc tcctctttgt gcattagctg gatctcagtg 480

ttatgcttgg ttccactcgg cgtgataagt tatctatcgc tgaggacacc cgtaaaaaag 540

gtggccaagg taaatgcaga tgaaccgctt ctaatagtcc attgacttgg acaatattct 600

attttatgat ctgatctc 618

<210>12

<211>624

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8S rDNA序列

<400>12

aatgaggagt tgagttgtag ctggcctttt aacattggca tgtgcacact cttctctttc 60

atccacacac ccctgtgcac ttgtgagaca gtcaaggtcc tttggggttg gggggcagag 120

ctttattgca aaaccctttt tccccttttg cctttgctgt ctactcaatt tatacacact 180

ctaattaatt ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatactaag tttcaacaac 240

ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt 300

gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg tattccttgg 360

agcatgcctg tttgagtatc atgaaatctt caaagcaaac cttttgttaa ttcaatcggg 420

tctcttgctt tggtattgga ggtctttgca cctgctcctc ttgttcatta gctggatctc 480

agtgttatgc ttggttccac tcggcgtgat aagttatcta tcgctgagga caccgtaaaa 540

aagtggccaa ggtaaatgca gacgaaccgc ttctaatagt ccattgactt ggacaattaa 600

atttttatga tctgatctca aatc 624

<210>13

<211>619

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8S rDNA序列

<400>13

aatgaagagt ttggttgtag ctggcccatt catttgggca tgtgcacacc tttctctttc 60

atcccacaca cacctgtgaa cctgtgagat cagatgggga atttacttgt tgctttttgg 120

aatacaaagg caataggtta ttggaccctc tgtctactca attaatataa actcaattta 180

ttttaaaacg aatgtaatgg atgtaacaca tctcatacta agtttcaaca acggatctct 240

tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt 300

cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc 360

tgtttgagta tcatgaattc ttcaaagtaa atcttttgtt aactcaattg gtttcacttt 420

ggtattggag gtcttttgca gcttcacacc tgctcctctt tgttcattag ctggatctca 480

gtgttatgct tggttccact cggcgtgata aattatctat cgctgaggac actgtaaaag 540

gtggccaagg taaatgcaga tgaaccgctt ctaatagtcc attgacttgg acaatacctt 600

tatgatctga tctcaaatc 619

<210>14

<211>631

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8S rDNA序列

<400>14

aatgtagagt ttggttgtag ctggctccta attaaacttg ggggcatgtg cacacctttc 60

tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttgtggg ggggaaggaa 120

ctttattgga ccttctactc ccccttgact tctgtctact taattcatat aaactcaatt 180

tattttaaaa cggatgtaat ggatgtaaca catctaatac taagtttcaa caacggatct 240

cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 300

ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc ttggtattcc ttggagcatg 360

cctgtttgag tatcatgaaa tcttcaaagt caaacctttt gttaattcaa ttggttctgc 420

tttggtattg gaggattatt gcagcttcac acctgctcct ctttgtgcat tagctggatc 480

tcagtgttat gcttggttcc actcagcgtg ataagttatc tatcgctgag gacaccctgt 540

taaaaagggg tggccaaggt aaatgcagat gaaccgcttc taatagtcca ttgacttgga 600

caatatctaa tttatgatct gatctcaaat c 631

<210>15

<211>608

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8S rDNA序列

<400>15

aatgagggga tatttggttg tagctggctc atcaatttgg gcatgtgcac acctatctct 60

ttcatccaca cacacctgtg cacttgtgag gcagatgggg aatttattga ttgtttttta 120

agaacaattg gtgctggacc ctctgtctac tcaatatata aactcaattt atttagaaat 180

gaatgtaatg gatgtaacgc atctaatact aagtttcaac aacggatctc ttggctctcg 240

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 300

atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct tggtattcct tggagcatgc ctgtttgagt 360

atcatgaaat cttcaaagta aatcttttgt taactcaatt ggttctactt tggtattgga 420

ggtctttgca gcttcacacc tgctcctctt tgttcattag ctggatctca gtgttatgct 480

tggttccact cagcgtgata agttatctat cgctgaggac actgtacagg tggccaaggg 540

aaatgcagat gaaccgcttc taatagtcca ttgacttgga cactattttt atgatctgat 600

ctcaaatc 608

<210>16

<211>535

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8S rDNA序列

<400>16

aatgtagagt tggttgtagc tggcctgatt ttaatatctg ggcatgtgca caccttctct 60

ttcatccaca cacacctgtg cacctgtgag acagaagtgg gacttttaat ttaatttaat 120

tgaaccctct gtctactcaa tccacacaaa ctcaatttat cttaaaatga atgtaactgg 180

atgtaacgca tctaatacta agtttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 240

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 300

gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc tgtttgagta tcatgaaatc 360

ttcaaagtga accttttgtt aactcaattg gttctgcttt ggtattggag gttattgcag 420

cttacacctg ctcctctttg tacattagct ggatctcagt gttatgcttg gttccactca 480

ccgcttccaa cagtccattc acttggacaa tactcttatg atctgatctc aaatc 535

<210>17

<211>590

<212>DNA

<213>菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITs-5.8s rDNA序列

<400>17

aatgaagagt tggttgtagc tggtccatta atttgggcaa tgtgcacacc tcctctttca 60

tccacacaca cctgtgcacc tgtgagacag atgggggaat ttattcattt attggacccc 120

tctgtctact caattcatat aaactcaatt tatttaaaaa tgaatgtaat gatgtaacac 180

atctaatact aagtttcaac aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg 240

aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc 300

ttgcgctcct tggtattcct tggagcatgc ctgtttgagt atcatgaaat cttcaaagta 360

aatcttttgt taattcaatt ggttctactt tggtattgga ggtcttttgc agcttcacac 420

ctgctcctct ttgtgcatta gctggatctc agtgttatgc ttggttccac tcagcgtgat 480

aaattatcta tcgctgagga cactgtaaaa agtggccaag gtaaatgcag atgaaccgct 540

tctaatagtc cattgacttg gacaatatta ttatgatctg atctcaaatc 590

<210>18

<211>648

<212>DNA

<213>水稻菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8S rDNA序列

<400>18

aatgaagagt ttggttgtag ctggtccatt aatttgggca acgtgcacac ctttctcttt 60

catccataca cacacctgtg aacctgtgag acagacgggg gaaattttta ttttgttcag 120

ataacaatga atgaagtaat cgggaacccc tctgtctact taatctcata taaactcaat 180

ttatttaaaa atgaatgtaa tggatgtaac acatctaata ctaagtttca acaacggatc 240

tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 300

attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cttggagcat 360

gcctgtttga gtatcatgaa atcttcaaag taaatctttt gttaattcaa ggtggtttca 420

ctttggtatt ggaggtcttg cagcttcaca cctgctcctc tttgtgtatt agctggatct 480

cagtgttatg cggtggttcc actcggcgtg ataacttatc taccgctgag gacactcttt 540

ctttttttcc ttaaaaaaat aaaataaagg tggccaaggg aaatgcagat gaaccgcttc 600

caatagtcca ttagcttgga caatattttt atgatctgat ctcaaatc 648

Claims

1.水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤：

1)隶属于不同菌丝融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的标准菌株，菌株代号分别为R1～R8，采用改良的CTAB法分别提取其基因组总DNA；

2)设计能鉴别水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物：以步骤1)得到的DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，分别进行各个标准菌株的ITS-5.8S rDNA序列的PCR扩增，扩增后均得到700bp的目的条带，经序列测定后得到不同融合群标准菌株的核苷酸序列，找到区分不同标准菌株的特异性碱基位点，设计出鉴别不同融合群标准菌株ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，

ITS1核苷酸序列如SEQ No.1所示，

ITS4核苷酸序列如SEQ No.2所示，

菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.10所示；

3)采集表现为水稻纹枯病症状的病株样本，从感病组织中分离、纯化水稻纹枯病菌；

4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的基因组总DNA；

5)水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR鉴定：用步骤4)得到的水稻纹枯病菌的DNA为PCR反应模板，以步骤2)得到的不同的融合群的特异性鉴别引物作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，同时加入通用引物ITS1和通用引物ITS4，分别进行双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异性片段，即可判定该水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出700bp的片段，即判断水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群；

上述的改良的CTAB法步骤如下：取0.2g菌丝，液氮研磨后加入800μL DNA提取液，65℃下水浴保温30min，10000g离心10min；取上清液用等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min；用氯仿/异戊醇再抽提1次；上清液加入等体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心10min；弃上清，在沉淀中加入1M NaCl300μL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min；取上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4℃下10000g离心10min，弃上清液，用70％的酒精清洗2次，抽干后加TE缓冲液充分溶解，即得到菌株的基因组总DNA；

上述的DNA提取液为：1L溶液中含有20g CTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、20mM EDTA和1mlβ-巯基乙醇，pH值为8.0；

上述的DNA沉淀液为：1L溶液中含有10g CTAB、50mM Tris-HCl和10mM EDTA，pH值为8.0。

2.如权利要求1所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤2)中PCR反应体系为：25μL总体积中含有10×Taqreaction buffer 2.5μL，25mM MgCl₂，2.5mM dNTP，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，标准菌株基因组总DNA 100ng，0.5U Taq DNA polymerase，加ddH₂O补足体积至25μL；

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。

3.如权利要求1所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤5)中双重PCR反应体系为：25μL总体积中含有10×Taq reaction buffer2.5μL，25mM MgCl₂，2.5mM dNTP，10μM特异性鉴别引物，10μM引物ITS1，10μM引物ITS4，水稻纹枯病菌DNA 100ng，0.5UTaq DNA polymerase，加ddH₂O补足体积至25μL；

PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环，循环结束后72℃再延伸10min。