CN101792774A - 农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 - Google Patents
农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101792774A CN101792774A CN201010143761A CN201010143761A CN101792774A CN 101792774 A CN101792774 A CN 101792774A CN 201010143761 A CN201010143761 A CN 201010143761A CN 201010143761 A CN201010143761 A CN 201010143761A CN 101792774 A CN101792774 A CN 101792774A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- callus
- naa
- culture medium
- rhizome
- dioscorea zingiberensis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241001678283 Dioscorea zingiberensis Species 0.000 title claims abstract description 18
- 235000004360 Dioscorea zingiberensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 18
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 title abstract description 7
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 244000281702 Dioscorea villosa Species 0.000 claims description 35
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 claims description 33
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 31
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 claims description 2
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N diosgenin Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(O)CC4=CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 5
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 5
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- DWCSNWXARWMZTG-UHFFFAOYSA-N Trigonegenin A Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(O)C=C4CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 DWCSNWXARWMZTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 3
- WQLVFSAGQJTQCK-VKROHFNGSA-N diosgenin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CC[C@H](O)CC4=CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 WQLVFSAGQJTQCK-VKROHFNGSA-N 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- NWMIYTWHUDFRPL-UHFFFAOYSA-N sapogenin Natural products COC(=O)C1(CO)C(O)CCC2(C)C1CCC3(C)C2CC=C4C5C(C)(O)C(C)CCC5(CCC34C)C(=O)O NWMIYTWHUDFRPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 235000002722 Dioscorea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000006536 Dioscorea esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000001811 Dioscorea oppositifolia Species 0.000 description 1
- 235000003416 Dioscorea oppositifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000000504 Dioscorea villosa Nutrition 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法，属于生物技术技术领域。本发明为通过转基因技术深入研究盾叶薯蓣的药用价值奠定了基础。本发明农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法包括以下步骤：(1)通过高频再生体系获得胚性愈伤受体材料；(2)挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中培养；(3)将诱导出的愈伤组织加入到农杆菌菌液中，经侵染、取出外植体转入共培养培养基上培养、过渡培养后，转入筛选培养基上进行筛选；(4)挑选抗性愈伤组织进行分化和生根。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别是一种盾叶薯蓣转基因育种技术。
背景技术
盾叶薯蓣(Dioscorea Zingiberensis C.H Wright)是单子叶植物薯蓣科薯蓣属的一种重要的药用植物，为我国的特有种，其根状茎中的薯蓣皂甙元(简称皂素)是制造甾体激素类药物的重要原料，在薯蓣属中含量最高。薯蓣皂甙元的结构经改造后可得到数千种甾体激素类药物和水溶性皂甙制剂，被医药界称为“药用黄金”。因此，盾叶薯蓣作为重要的药源植物具有很高的经济价值。近年来，随着盾叶薯蓣需求量的增加和采挖过程中缺乏科学的指导，使野生的盾叶薯蓣资源日渐枯竭，品质严重退化。另外，盾叶薯蓣主要通过根状茎进行繁殖，且需种量大，成本高，严重阻碍了盾叶薯蓣种植产业化发展。因此，培育稳定的根状茎高产或皂甙元高含量的盾叶薯蓣新品系，是缓解当前市场供需矛盾和解决栽培后品质退化的主要途径。
盾叶薯蓣主要进行无性繁殖，通过传统的杂交育种方法改良性状难度较大，而体细胞无性系变异，诱变育种又具有盲目性。目前国内提高薯蓣皂甙元产量的方法主要是优化栽培技术、组织培养和改善种植环境等方面。王志安、王日照用组织培养的方法筛选高产皂素植株系，田间成苗6830株，皂甙元平均含量2.48％，与野生盾叶薯蓣相比，皂素含量有一定程度的下降。毕世荣、谢碧霞分别利用盾叶薯蓣无性系变异进行高产细胞系的筛选研究，但存在植株再生困难的问题，难以获得可以大面积推广的植物新品种。周媛等通过离体诱导的方法获得的盾叶薯蓣四倍体植株，虽在试管苗阶段表现出明显的细胞体积大、数量多的特征，但移栽至大田后，其器官并不表现巨大的特征，与二倍体植株无明显差异，且药用有效成分并未检测。目前市场上的这些技术手段并没有实现盾叶薯蓣在遗传品种上的改良，通过这些筛选筛选获得的皂素高产植株存在着含量不稳定等问题。
转基因技术是一种有效的定向改良性状的技术手段，已经广泛应用于多种植物的性状改良。
本发明的目的在于利用转基因技术，开展盾叶薯蓣基因工程改良，缓解当前盾叶薯蓣产业中存在的问题，为促进盾叶薯蓣产业和特色农业可持续发展做出贡献。
发明内容
本发明的目的是提供一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法，为通过转基因技术深入研究盾叶薯蓣的药用价值奠定了基础。
本发明一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法所采用的技术方案是通过如下方式完成的：农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法包括以下步骤：
(1)通过高频再生体系获得胚性愈伤受体材料；
(2)挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中培养；
(3)将诱导出的愈伤组织加入到农杆菌菌液中，经侵染、取出外植体转入共培养培养基上培养、过渡培养后，转入筛选培养基上进行筛选；
(4)挑选抗性愈伤组织进行分化和生根。
本发明一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法的具体操作步骤是：
(1)将盾叶薯蓣块茎种植在土壤中，待盾叶薯蓣块茎萌发后并地上部分长到60cm左右时，取其茎段，切成含单个芽的单节茎，接种于腋芽诱导固体培养基MS+BA 1.0～2.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，pH 5.8，温度25±1℃，16h光照/8h黑暗光周期，1500～2000Lx光强度的培养室中光照培养无菌苗(培养室条件下同)；
(2)无菌苗长出后，取盾叶薯蓣无菌苗叶片或茎段，接种于固体的愈伤组织诱导培养基MS+BA 2.0～4.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，pH 5.8，黑暗培养1个月后可获得愈伤组织；
(3)制备工程菌、培养和活化，调整菌液浓度OD600值为0.3～0.7，取活性高的愈伤组织放入菌液中，侵染15～45分钟，吸干菌液，置于共培养固体培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+AS 200μmol/L，pH 5.3，培养2～3天；
(4)脱菌后先置于固体过渡培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef 400～500mg/L上过渡培养一周，后在培养基中添加40～50mg/L Hyg进行筛选培养；
(5)取抗性愈伤组织放在分化培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+cef 400～500mg/L+Hyg10～50mg/L上，光照条件下进行分化，将生长至3cm的无根再生苗置于大量元素减半的生根培养基1/2MS+NAA 0.1～0.2mg/L+Hyg40～50mg/L诱导生根；
(6)待再生苗长出10根以上的须根时，打开封口膜，炼苗一周，用蒸馏水洗去根部培养基，移栽到盛有营养土的花盆中，用稀释50倍的MS大量元素母液喷洒植株，覆盖塑料膜，一周后去掉塑料膜，获得抗性再生植株；
(7)GUS基因检测材料取自经过1～4步骤后获得的抗性愈伤组织，将经过1～6步骤后获得的抗性再生植株的叶片，用SDS法提取基因组DNA，以质粒DNA做阳性对照，未转化植株的DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，检测抗性再生植株。
在上述农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法中，所用的盾叶薯蓣块茎采自浙江仙居薯蓣种植基地，种于浙江师范大学苗圃内。
附图说明
图1为愈伤组织GUS染色结果照片。其中，照片中左侧为未转化的愈伤组织，照片中右侧为转化的愈伤组织。
图2为含目的片段的载体质粒D1-6中的T-DNA区段的结构图。
图3为对盾叶薯蓣抗性愈伤组织用HPT引物PCR扩增结果扫描图。
图4为对盾叶薯蓣抗性愈伤组织RRM1引物PCR扩增结果扫描图。
图5为盾叶薯蓣抗性愈伤组织筛选培养1个月后的照片。
图6为盾叶薯蓣转基因再生植株无菌苗照片。
图7为盾叶薯蓣转基因再生植株照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做出进一步的具体说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
一、诱导盾叶薯蓣愈伤组织
1、取经表面消毒的盾叶薯蓣实生茎段，切成含单个芽的单节茎，接种于腋芽诱导固体培养基MS+BA1.0～2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，pH 5.8，25±1℃，光照培养出无菌苗；
2、取无菌苗叶片和茎段各120个，叶片切成约0.5cm2大小，茎段切成约1cm大小接种于固体的愈伤组织诱导培养基MS+BA 3.0mg/L，25±1℃，黑暗培养，一个月以后获得愈伤组织139个。
二、农杆菌侵染转化
1、制备带GUS基因的工程菌、培养和活化，挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中震荡培养至OD600值0.4～0.6；
2、将胚性愈伤组织加入到农杆菌菌液中，侵染20～30分钟，取出外植体，转入共培养固体基MS+BA3.0mg/L+AS 200μmol/L，pH 5.3；
3、共培养2～3天后进行脱菌，转入固体过渡培养基MS+BA 3.0mg/L+cef 400～500mg/L；
4、过渡培养一到两周后转入固体筛选培养基MS+BA 3.0mg/L+cef 400～500mg/L+Hyg 40～50mg/L上筛选出抗性愈伤组织6个。
三、抗性愈伤组织的检验
1、将筛选出的抗性愈伤组织投入到已配置好的GUS染色液中，37℃浸泡24个小时后观察抗性愈伤组织的颜色；
2、实验结果表明，GUS基因已经成功转入到愈伤组织中，见图1。
实施例2
一、诱导盾叶薯蓣愈伤组织
1、取经表面消毒的盾叶薯蓣实生茎段，切成含单个芽的单节茎，接种于腋芽诱导固体培养基MS+BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，pH 5.8，25±1℃，光照培养出无菌苗；
2、取无菌苗茎段，接种于固体的愈伤组织诱导培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，25±1℃，黑暗培养，接种360个，一个月以后获得愈伤组织294个；
二、农杆菌侵染转化
1、制备根癌农杆菌菌株EHA105的工程菌，表达载体为D2-8，培养和活化，挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中震荡培养至OD值0.3～0.7；
2、将胚性愈伤组织加入到农杆菌菌液中，侵染20～30分钟，取出外植体，转入共培养固体基MS+BA2.0mg/L～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+AS 200μmol/L，pH 5.3；
3、共培养2～3天后进行脱菌，转入固体过渡培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef500mg/L；
4、过渡培养一到两周后转入固体筛选培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef 500mg/L+Hyg40～50mg/L上筛选出抗性愈伤组织。
三、抗性愈伤组织的检验
取抗性愈伤组织，用SDS法提取基因组DNA，根据潮霉素基因rFCA-RRM2基因片段设计PCR检测引物。以质粒D2-8作阳性对照，非转化植株及ddH2O作为阴性对照，进行PCR检测。结果显示，选取的抗性愈伤组织均分别扩增出了845bp和330bp的目的片段，与质粒DNA扩增的片段大小相同，而以未转化植株叶片DNA为阴性对照的扩增产物中无目的片段，初步说明外源基因已整合到抗性愈伤组织的基因组中。
实施例3
一、诱导盾叶薯蓣愈伤组织
1、取经表面消毒的盾叶薯蓣实生茎段，切成含单个芽的单节茎，接种于腋芽诱导固体培养基MS+BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，pH 5.8，25±1℃，光照培养出无菌苗；
2、取无菌苗茎段，接种于固体的愈伤组织诱导培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，25±1℃，黑暗培养，一个月以后可获得愈伤组织。
二、农杆菌侵染转化
1、制备根癌农杆菌菌株EHA105的工程菌，表达载体为D1-6，培养和活化，挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中震荡培养至OD值0.3～0.7；
2、将胚性愈伤组织加入到农杆菌菌液中，侵染15～45分钟，取出外植体，转入共培养固体基MS+BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+AS 200μmol/L，pH 5.3；
3、共培养2～3天后进行脱菌，转入固体过渡培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef 400～500mg/L；
4、过渡培养一到两周后转入固体筛选培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef 400～500mg/L+Hyg 40～50mg/L上筛选出抗性愈伤组织。
三、抗性转基因植株的获得
1、将抗性愈伤组织转入到含有40mg/L潮霉素的分化培养基中；
2、2个月后，只产生绿色芽点并没有分化成苗；
3、将选择压去掉1个月后抗性愈伤组织开始分化；
4、当小苗较壮实，伸展出许多叶片后，转入有选择压生根培养基1/2MS+NAA 0.1～0.2mg/L+Hyg 40mg/L中；
5、待抗性再生苗生长出许多粗壮、有白色绒毛的根，植株生长状况良好，炼苗后进行移栽，90％植株长出新生枝叶。
四、抗性植株的检验
取抗性植株的叶片，用SDS法提取基因组DNA，根据潮霉素基因rFCA-RRM1基因片段设计PCR检测引物。以质粒D1-6作阳性对照，非转化植株及ddH2O作为阴性对照，进行PCR检测。结果显示，选取的抗性愈伤组织均分别扩增出了845bp和154bp的目的片段，与质粒DNA扩增的片段大小相同，而以未转化植株叶片DNA为阴性对照的扩增产物中无目的片段，初步说明外源基因已整合到抗性愈伤组织的基因组中。
利用本发明的方法已成功地获得转基因盾叶薯蓣阳性植株10株。
Claims (2)
1.一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法，其特征在于农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法包括以下步骤：
(1)通过高频再生体系获得胚性愈伤受体材料；
(2)挑取农杆菌单菌落，加入到YEP液体培养基中培养；
(3)将诱导出的愈伤组织加入到农杆菌菌液中，经侵染、取出外植体转入共培养培养基上培养、过渡培养后，转入筛选培养基上进行筛选；
(4)挑选抗性愈伤组织进行分化和生根。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法，其特征在于农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法的具体操作步骤是：
(1)将盾叶薯蓣块茎种植在土壤中，待盾叶薯蓣块茎萌发后并地上部分长到60cm左右时，取其茎段，切成含单个芽的单节茎，接种于腋芽诱导固体培养基MS+BA 1.0～2.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，pH 5.8，温度25±1℃，16h光照/8h黑暗光周期，1500～2000Lx光强度的培养室中光照培养无菌苗(培养室条件下同)；
(2)无菌苗长出后，取盾叶薯蓣无菌苗叶片或茎段，接种于固体的愈伤组织诱导培养基MS+BA 2.0～4.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L，pH 5.8，黑暗培养1个月后可获得愈伤组织；
(3)制备工程菌、培养和活化，调整菌液浓度OD600值为0.3～0.7，取活性高的愈伤组织放入菌液中，侵染15～45分钟，吸干菌液，置于共培养固体培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+AS 200μmol/L，pH 5.3，培养2～3天；
(4)脱菌后先置于固体过渡培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0～0.5mg/L+cef 400～500mg/L上过渡培养一周，后在培养基中添加40～50mg/L Hyg进行筛选培养；
(5)取抗性愈伤组织放在分化培养基MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+cef 400～500mg/L+Hyg10～50mg/L上，光照条件下进行分化，将生长至3cm的无根再生苗置于大量元素减半的生根培养基1/2MS+NAA 0.1～0.2mg/L+Hyg40～50mg/L诱导生根；
(6)待再生苗长出10根以上的须根时，打开封口膜，炼苗一周，用蒸馏水洗去根部培养基，移栽到盛有营养土的花盆中，用稀释50倍的MS大量元素母液喷洒植株，覆盖塑料膜，一周后去掉塑料膜，获得抗性再生植株；
(7)GUS基因检测材料取自经过1～4步骤后获得的抗性愈伤组织，将经过1～6步骤后获得的抗性再生植株的叶片，用SDS法提取基因组DNA，以质粒DNA做阳性对照，未转化植株的DNA及ddH20做阴性对照，进行PCR扩增，检测抗性再生植株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010143761A CN101792774A (zh) | 2010-04-12 | 2010-04-12 | 农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010143761A CN101792774A (zh) | 2010-04-12 | 2010-04-12 | 农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101792774A true CN101792774A (zh) | 2010-08-04 |
Family
ID=42585688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010143761A Pending CN101792774A (zh) | 2010-04-12 | 2010-04-12 | 农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101792774A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728481A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-11-02 | 河南师范大学 | 一种怀山药遗传转化的方法 |
| CN110904148A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-03-24 | 湖北大学 | 一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株dzggppsts和盾叶薯蓣及其制备方法 |
| CN112931205A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-06-11 | 广东丰绿源生物医药科技有限公司 | 一种菊叶薯蓣组织培养繁育方法 |
| CN114711144A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-08 | 天津博奥聚能生物科技有限公司 | 一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014260A1 (en) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | University Of Florida | Methods for controlling viral diseases in plants |
| CN1551916A (zh) * | 2001-09-05 | 2004-12-01 | ������ɽ���� | 用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子 |
| CN101358234A (zh) * | 2008-08-02 | 2009-02-04 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记 |
-
2010
- 2010-04-12 CN CN201010143761A patent/CN101792774A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014260A1 (en) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | University Of Florida | Methods for controlling viral diseases in plants |
| CN1551916A (zh) * | 2001-09-05 | 2004-12-01 | ������ɽ���� | 用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子 |
| CN101358234A (zh) * | 2008-08-02 | 2009-02-04 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 任椒矫: "盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright）再生体系的建立和农杆菌介导的rFCA-RRM1基因片段转化研究", 《浙江师范大学硕士学位论文》, 31 December 2009 (2009-12-31) * |
| 任椒矫等: "盾叶薯蓣高频再生体系的建立", 《浙江师范大学学报（自然科学版）》, vol. 32, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 216 - 221 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728481A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-11-02 | 河南师范大学 | 一种怀山药遗传转化的方法 |
| CN110904148A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-03-24 | 湖北大学 | 一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株dzggppsts和盾叶薯蓣及其制备方法 |
| CN112931205A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-06-11 | 广东丰绿源生物医药科技有限公司 | 一种菊叶薯蓣组织培养繁育方法 |
| CN114711144A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-08 | 天津博奥聚能生物科技有限公司 | 一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102119655B (zh) | 铁皮石斛自然光快繁育苗方法 | |
| CN101457235B (zh) | 一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法 | |
| CN103966258B (zh) | 一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法 | |
| CN101869591B (zh) | 利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法 | |
| WO2022135246A1 (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
| CN101121940B (zh) | 一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法 | |
| CN105543278A (zh) | 一种砀山酥梨遗传转化方法 | |
| CN102286526B (zh) | 一种快速获得辣椒转基因植株的方法 | |
| CN102229950B (zh) | 一种快速高效的籼稻转基因方法 | |
| CN104472365B (zh) | 富贵榕组培快繁育苗方法 | |
| CN115720851A (zh) | 一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法 | |
| CN101711504B (zh) | 荻的快速繁殖方法 | |
| CN101946711B (zh) | 紫花苜蓿高效组织培养再生的方法 | |
| CN101953300B (zh) | 温郁金1号的组织培养法 | |
| CN101792774A (zh) | 农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因方法 | |
| CN102304545A (zh) | 一种农杆菌转化大豆的方法 | |
| CN109735538A (zh) | 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用 | |
| CN117070557A (zh) | 一种快速高效的农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法 | |
| CN106258976B (zh) | 一种芥菜型油菜的组织培养快速育苗方法 | |
| CN103060372B (zh) | 一种农杆菌介导的培育转基因旱柳植株的方法 | |
| CN102499075A (zh) | 一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法 | |
| CN100358413C (zh) | 兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法 | |
| CN104221854A (zh) | 一种文心兰的培养方法 | |
| CN101775409A (zh) | 通过农杆菌浸染幼穗获得转基因玉米的方法 | |
| CN107190019A (zh) | 一种农杆菌介导的麻竹转化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100804 |