CN109735538A - 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体设计一种提高草莓叶片再生效率的载体及其应用。从森林草莓中筛选得到森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段，构建得到森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300‑FveHK2，进而转染转基因工程菌，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK2基因的RNAi表达干扰株系，在离体叶片组织培养条件下，FveHK2基因抑制表达系的出芽时间早于野生型，出芽率显著高于野生型，表明遗传转化FveHK2干扰载体的森林草莓转基因株系叶片的再生能力显著提高。本发明对草莓叶片再生及转化效率的提高具有重要意义。

Description

一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用。

背景技术

草莓(Fragaria×ananazsa Duch.)属于蔷薇科草莓属，多年生草本植物。果实甜美可口，营养价值高，且具有保健功效。近年来，各地生产中急需大批优良草莓苗，但采用常规苗木繁殖，繁殖系数较低、成本较高，现多采用组培技术繁殖草莓苗。最早进行草莓离体培养研究是在20世纪60年代，日本的下村等研究表明，用热处理和生长点培养相结合的方法排除草莓病毒病效果较好。1963年，Miller首次报道了利用茎尖培养可成功获得草莓组培植株，Rosati等用凤梨草莓等4个品种的花药进行离体培养成功获得植株。1989年，Nehra最早建立了“Redcoat”草莓品种的高频叶盘再生***，之后陆续有一些草莓品种如红颊、章姬、丰香等叶片再生体系的研究报道。

另一方面，伴随草莓产业的快速发展，生产上对其优质种苗的需求量增加，不同草莓品种的需求亦是不断增加。然而，草莓生产面临着不断变化的病、虫害危害和高、低温等环境胁迫；传统的育种方法很难培育出优良的抗病和抗逆境品种，因此，亟需引入植物基因工程加快育种进程。而建立高效稳定的再生体系是进行基因工程育种的先决条件之一。

森林草莓(Fragaria vesca)与栽培草莓在花结构、花器官排列和早期果实发育等方面的特性基本相同，但具有生长周期短、转化体系成熟、基因组小的优势，由此是研究栽培草莓的理想模式植物。森林草莓叶片再生效率的提高对建立高效的栽培草莓叶片再生具有重要的参考价值。

叶片再生是指基于植物细胞的全能性原理，植物叶片在离体条件下，在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。目前，应用于草莓上的基因导入法主要是农杆菌介导的叶盘法，由于其培养中农杆菌侵染、选择再生培养中的选择压、抗生素作用、继代培养等因素，会使再生频率降低，从而无法获得有效的转基因植物，因此目的基因是否转移给受体并获得转基因植物，主要取决于是否有一个稳定、高效的离体再生***。

细胞***素是植物的生长调节因子，参与植物生长发育的各个过程，对植物形态建成和农作物产量有着重要意义。细胞***素是在植物根部产生的一类促进胞质***的物质，能促进多种组织的分化和生长，与植物生长素有协同作用。一定的细胞***素和生长素配比有利于植物再生过程中不定芽的产生。近年来，关于细胞***素调控大白菜子叶再生、拟南芥心皮离体再生、辣椒子叶再生等已有相关报道。因此，通过调控细胞***素相关基因的表达，有可能提高植物叶片再生的效率。

发明内容

针对前述的提高草莓叶片再生效率的问题，本发明提供一个森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体。

本发明的又一目的在于提供一种FveHK2的植物抑制表达载体的制备方法。

本发明所构建的植物抑制表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创造新种质，对草莓叶片再生及转化效率的提高具有重要意义。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的在于提供森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段在提高森林草莓叶片再生效率中的应用，所述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2包括FveHK2a和FveHK2b两个同源基因，所述RNA干扰片段核苷酸序列包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列为位于NCBI登录号为

XM_004293409的FveHK2b序列733～1032bp区域序列：

TCAATGTCAGCAAGAACCAGCTTCTGGCTTTAGCTTCCTTGTTCTCTGAATCAGATCAGATAGAATCCCTTGAATGTACCAAAGAAACAGGACCTGGGATGCTTTTAACTGATGGCATTTCCTGTGCTCTGAAGGCAGTGTGTTCAGATGAGACAGAATTTCAAGAGCATCATAAATGGGTGGGAGAATATGTTGAAGCCGAGGACCAATGCCCGGTTCAAGAACTAAACATCCCCAGGATGCTTGACCTATCATTGCTACAAGAAAATTCATTGGCAAAAGTTCCGCAGTCTACAGTAT

(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少有93％同一性(281/300＝93％)，且位于NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列834bp～1133bp区域序列。

本发明从森林草莓中鉴定得到序列高度相似的两个细胞***素受体基因FveHK2a和FveHK2b，FveHK2a和FveHK2b为草莓细胞***素受体基因FveHK2同源的两个基因，相似度达到90％以上。本发明的FveHK2的RNA干扰片段是FveHK2a基因序列和FveHK2b基因序列中，相似程度达到93％的一段序列，同时也是与其他细胞***素受体基因以及其他草莓特异的一段序列。可认为NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列的834bp-1133bp区域的序列同样可以作为本发明森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段，与SEQ ID NO.1所示的RNA干扰片段作用和效果相同。

本发明的第二个目的在于提供一种森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中***由前述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列构成的ihpRNA发夹结构所得到。

进一步的，所述植物抑制表达载体GN2300-FveHK2中ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

TCAATGTCAGCAAGAACCAGCTTCTGGCTTTAGCTTCCTTGTTCTCTGAATCAGATCAGATAGAATCCCTTGAATGTACCAAAGAAACAGGACCTGGGATGCTTTTAACTGATGGCATTTCCTGTGCTCTGAAGGCAGTGTGTTCAGATGAGACAGAATTTCAAGAGCATCATAAATGGGTGGGAGAATATGTTGAAGCCGAGGACCAATGCCCGGTTCAAGAACTAAACATCCCCAGGATGCTTGACCTATCATTGCTACAAGAAAATTCATTGGCAAAAGTTCCGCAGTCTACAGTATTTCGACCATATTATTCAGGTACATTCTGATTTCATTATCTTCCTACTTGGTTAAATTTCAACATGTAATACTATTTTTGGCTTCAAACATTTAAATTAAGGATGTGTACTTTAATGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGTATACTGTAGACTGCGGAACTTTTGCCAATGAATTTTCTTGTAGCAATGATAGGTCAAGCATCCTGGGGATGTTTAGTTCTTGAACCGGGCATTGGTCCTCGGCTTCAACATATTCTCCCACCCATTTATGATGCTCTTGAAATTCTGTCTCATCTGAACACACTGCCTTCAGAGCACAGGAAATGCCATCAGTTAAAAGCATCCCAGGTCCTGTTTCTTTGGTACATTCAAGGGATTCTATCTGATCTGATTCAGAGAACAAGGAAGCTAAAGCCAGAAGCTGGTTCTTGCTGACATTGA

本发明的第三个目的在于提供一种森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的构建方法，包括以下步骤：

S1：获得森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段：根据NCBI数据库登录号：XM_004293409公布的FveHK-2b序列为模板，设计特异性引物

FveHK2-RNAi-F1：5'-TCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQ ID No.4)和FveHK2-RNAi-R1：5'-CAGGATGCTTGACCTATCAT-3'(SEQ ID No.5)，扩增得到SEQ ID NO.1所示的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列；设计特异性引物

FveHK2-RNAi-F2：5'-ATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.6)和FveHK2-RNAi-R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGA-3'(SEQ ID No.7)，扩增得到SEQ ID NO.1所示森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列；

S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAGGTACATTC-3'(SEQ ID No.8)和Intron-R：5'-TGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGAGATCGTTCAAA-3'(SEQ ID No.9)，扩增得到SEQ IDNO.3所示的内含子片段；

CATATTATTCAGGTACATTCTGATTTCATTATCTTCCTACTTGGTTAAATTTCAACATGTAATACTATTTTTGGCTTCAAACATTTAAATTAAGGATGTGTACTTTAATGTGATGCAGCTTGCAAAGC

S3：构建含有内含子的Intron-GN2300载体：XbaI/SalI双酶切GN2300通用载体，将扩增的Intron片段连接到GN2300通用载体XbaI/SalI双酶切位点，得到含有内含子的Intron-GN2300载体；

S4：构建抑制表达载体GN2300-FveHK2：将SEQ ID NO.1所示的正向序列连接到含有内含子的Intron-GN2300载体的SalI酶切位点上，连接正向序列的引物为：

F1：5'-GGACTCTGCAGGTCGACTCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQ ID No.10)，

R1：5'-AGTTCCGCAGTCTACAGTATTTCGACCATATTATTCA-3'(SEQ ID No.11)；

得到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体，再将反向序列连接到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体的XbaI酶切位点上，连接反向序列的引物为：

F2：5'-GCTTGCAAAGCTCTAGTATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.12)，

R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGACTCTAGAGATCGTTCAA-3'(SEQ ID No.13)；

得到抑制表达载体GN2300-FveHK2，转化农杆菌GV3101，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，得到含有森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列(即正向序列位于内含子上游，反向序列位于内含子下游的)的ihpRNA发夹结构的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2。

本发明的第四个目的在于提供转染了前述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的转基因工程菌。

本发明的第五个目的在于提供前述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2在提高森林草莓叶片再生效率中的应用。

进一步的，本发明通过前述的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2下调了森林草莓离体叶片中FveHK2基因表达，提高森林草莓叶片离体情况下的再生能力。

本发明的第六个目的在于提供转染了前述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的转基因工程菌在提高森林草莓叶片再生效率中的应用。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

(1)本发明筛选得到森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段，构建得到森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，进而转染转基因工程菌，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK2基因的RNAi表达干扰株系，有效下调离体叶片组织FveHK2基因表达，增强了森林草莓叶片离体情况下的再生能力，并证实了FveHK2基因的表达与草莓离体叶片的再生能力有关。

(2)FveHK2基因的RNAi表达干扰株系其本身(即T0代)的生长情况不受影响，叶片的再生能力增强。

(3)本发明通过有效下调FveHK2基因表达可获得再生能力增强的草莓植株，这对草莓转基因过程中转化效率的提高具有重要意义。

附图说明

图1：实施例2中原始载体GN2300的图谱；

图2：实施例2构建的双链抑制表达载体ihpRNA的发夹结构；

图3：实施例4中叶片再生的出芽率统计，附图标记说明，2R为FveHK2抑制表达系，WT为野生型草莓品种夏威夷4(Hawaii4)；

图4：实施例4中qRT-PCR验证FveHK2抑制表达系中的FveHK-2a、FveHK-2b基因的表达量统计，附图标记说明，2R为FveHK2抑制表达系，WT为野生型草莓品种夏威夷4(Hawaii4)；

图5：实施例4中实施例4中的FveHK2抑制表达系叶片切下时期；

图6：实施例4中的FveHK2抑制表达系叶片愈伤时期，其中a为愈伤生长初期，b为愈伤生长后期；

图7：实施例4中的FveHK2抑制表达系的生出不定芽；

图8：实施例2构建的含有内含子的Intron-GN2300载体图。

图9：实施例4中培养45d时离体叶片出芽情况(9a为WT为野生型草莓品种夏威夷4，9b为FveHK2抑制表达系)

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂和生物材料，如未特别说明，均已公开。

实施例1：获得森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段

细胞***素受体基因FveHK2核苷酸正向序列的克隆：

根据NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)登录号：XM_004293409公布的FveHK-2b序列为模板，设计特异性引物FveHK2-RNAi-F：5'-TCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQID No.4)和FveHK2-RNAi-R：5'-CAGGATGCTTGACCTATCAT-3'(SEQ ID No.5)。

通过PCR反应扩增所需目的片段，反应体系如表1：

模板cDNA	1μL(约750ng)
		5×Prime STAR GXL Buffer	10μL
dNTP Mixture	4μL
		0.2μM正向引物	1μL
0.2μM反向引物	1μL
		Prime STAR GXL DNA Polymerase	1μL
灭菌蒸馏水	up to 50μL

反应程序：98℃预变性5min，98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸40s，32cycles，68℃延伸10min。

扩增得到SEQ ID NO.1所示的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列，长度为300bp。

根据NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)登录号：XM_004293409公布的FveHK-2b序列为模板，设计特异性引物FveHK2-RNAi-F2：5'-ATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.6)和FveHK2-RNAi-R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGA-3'(SEQ ID No.7)。

通过PCR反应扩增所需目的片段，反应体系如表1，反应程序同上。

扩增得到SEQ ID NO.1所示森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列，长度为300bp。

实施例2：植物表达载体GN2300-FveHK2的构建

具体步骤如下：

1.将内含子连接到GN2300载体，得到含有内含子的Intron-GN2300载体：

①以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAGGTACATTC-3'(SEQ ID No.8)和Intron-R：5'-TGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGAGATCGTTCAAA-3'(SEQ ID No.9)，PCR扩增内含子Intron片段。获得的Intron内含子片段序列如SEQ ID NO.3所示。

反应体系如表1。

反应程序：98℃预变性5min，98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸10s，32cycles，68℃延伸10min。

②GN2300是通用载体，载体图如图1所示，用XbaI/SalI双酶切GN2300通用载体。

双酶切体系：50μl的反应液中，1μg DNA，37℃的温度条件，1小时反应。

③将扩增的Intron片段连接到GN2300通用载体XbaI/SalI双酶切位点，得到含有内含子的Intron-GN2300载体，载体图如图8。

2.构建抑制表达载体GN2300-FveHK2：

将SEQ ID NO.1所示的正向序列连接到含有内含子的Intron-GN2300载体的SalI酶切位点上，连接正向序列的引物为：

F1：5'-GGACTCTGCAGGTCGACTCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQ ID No.10)，

R1：5'-AGTTCCGCAGTCTACAGTATTTCGACCATATTATTCA-3'(SEQ ID No.11)；

反应体系如表2所示：

10×T4ligase Buffer	1μL
		含有内含子的Intron-GN2300载体	2μL
SEQ ID NO.1所示的正向序列	6μL
		T4DNA连接酶	1μL

反应程序为：16℃过夜连接反应，提取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体的质粒。

得到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体。

再将反向序列连接到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体的XbaI酶切位点上，连接反向序列的引物为：

F2：5'-GCTTGCAAAGCTCTAGTATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.12)，

R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGACTCTAGAGATCGTTCAA-3'(SEQ ID No.13)；

反应体系为如表3所示：

10×T4ligase Buffer	1μL
		含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体	2μL
SEQ ID NO.1所示的反向序列	6μL
		T4DNA连接酶	1μL

反应程序为：16℃过夜连接反应，提取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取抑制表达载体GN2300-FveHK2的质粒。

得到抑制表达载体GN2300-FveHK2。

转化农杆菌GV3101，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，得到CaMV35S启动子驱动的，含有森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列(即正向序列位于内含子上游，反向序列位于内含子下游的)的ihpRNA发夹结构的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2。

ihpRNA发夹结构如图2所示。

实施例3：森林草莓的遗传转化

(1)使用农杆菌GV3101介导的遗传转化法将实施例2获得的载体转化森林草莓，具体步骤如下：

①菌种活化：将含抑制表达载体GN2300-FveHK2的农杆菌GV3101在固体培养基上划线，28℃培养2d，接种到液体LB培养基中,于28℃菌摇培养培养至OD600值0.4-0.6，将菌液离心后倒去上层清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用等体积的MS液体培养基重悬，将重悬后的菌液放入冰箱备用。

②材料准备：取二倍体森林草莓‘Hawaii 4’组培苗的叶片，用刀片划出3-4条伤口。

③农杆菌侵染：将切好的草莓叶片转移至农杆菌菌液中浸泡20min，将叶片转移至灭菌好的滤纸上吸干。

④共培养：侵染后的叶片接种在草莓共培养培养基上，25±2℃培养箱中黑暗培养3d。

⑤脱菌培养：将共培养3d后的草莓叶片转入脱菌培养基，25±2℃培养室中弱光培养15-20d。

⑥筛选培养：继续将草莓叶片转入筛选培养基，25±2℃培养室中弱光培养，20-25d。每15d更换一次新的培养基，当有少量绿色芽点露出时，转入生芽培养基。

⑦生芽培养：25±2℃培养室中弱光培养20-25d。

⑧生根培养：继续转入生根培养基，待其生根出苗。

以上遗传转化中所用到的培养基配方如下：

①LB液体培养基：

胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl粉末10g/L

用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

②共培养培养基：MS-B5培养基+2.2mg/L TDZ+0.3mg/L IBA

③脱菌培养基：MS-B5培养基+2.2mg/L TDZ+0.3mg/L IBA+300mg/L Ti

④筛选培养基：MS-B5培养基+3mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+300mg/L Ti

⑤生芽培养基：MS-B5培养基+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+300mg/L Ti

⑥生根培养基：1/2MS培养基+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti

以上培养基中所需的培养基及溶液配方如下：

培养基配方：

①MS-B5固体培养基：

蔗糖20g/L+MS培养基粉末(不含维生素)4302.09mg/L+B5有机溶液5mL/L+琼脂7g/L

用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。

②1/2MS固体培养基：

蔗糖20g/L+1/2MS培养基粉末4302.09mg/L+琼脂7g/L

用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。

③MS固体培养基：

蔗糖30g/L+MS大培养基粉末(包含维生素)4.406g/L+琼脂7g/L

用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。

④MS液体培养基：

蔗糖30g/L+MS大培养基粉末(包含维生素)4.406g/L

用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。

主要溶液配方：

①6-BA(4mg/mL)激素的配置：称取6-BA 24mg，用150μL的1N氢氧化钠溶解5min，加1mL酒精(起到杀菌作用)，待溶解完全后蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。

②TDZ(2mg/mL)激素的配置：称取TDZ 12mg，用150μL的1N氢氧化钠溶解5min，加1mL酒精(起到杀菌作用)，待溶解完全后蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。

③IBA(1mg/mL)激素的配置：称取IBA 6mg，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。

④Ti(300mg/mL)激素的配置：称取Ti 1.8g，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。

⑤Kan(100mg/mL)激素的配置：称取Kan 600mg，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。

⑥1N氢氧化钠贮存液:称取氢氧化钠4.0g，用蒸馏水溶解定容至100mL，室温保存备用。

⑦MS-B5有机溶液：称取维生素B1 2g，称取维生素B6 0.2g，称取烟酸0.2g，称取肌醇20g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，4℃保存备用。

(2)染色验证、移栽

将生根的转基因T0代植株叶片取下进行GUS染色，染色成功的可初步鉴定为转基因成功，然后将其移栽至室温下培养。

培养结果表明，FveHK2基因的RNAi表达干扰株系其本身(即T0代)的生长情况不受影响：即与野生型相比，除了FveHK2基因的RNAi表达干扰株系其本身(即T0代)在愈伤生长速度上变快，其他如愈伤结构、颜色等形态生长都与野生型相同。

实施例4：森林草莓离体叶片的再生

(1)收获转基因T1代的种子：

将实施例3获得的转基因T0代植株移栽入土，待其开花、结果，便得到转基因T1代的种子。

将野生二倍体森林草莓‘Hawaii 4’和FveHK2抑制表达系的T1代种子消毒，播种，待其在组培瓶中播下长出叶片，切下相同叶龄(45-60d)的转基因株系即FveHK2抑制表达系(图5)和森林草莓‘Hawaii 4’叶片各40片，至叶片再生培养基上培养，叶片再生培养基配方为：MS-B5培养基+0.2mg/L IBA+2mg/L TDZ，25±2℃培养箱中黑暗培养3d，3d后转入25±2℃培养室中弱光培养，每15d更换一次叶片再生培养基。

种子消毒、播种的具体操作为：75％酒精3-5min，1％的次氯酸钠7min，中间不停摇晃，然后放在MS固体培养基上黑暗催芽，大概5-7d有芽长出，发芽后移植MS固体培养基的组培瓶中，置于25±2℃培养室中光下生长。

(2)待野生二倍体森林草莓‘Hawaii 4’和FveHK2抑制表达系外植体长出愈伤组织(图6a为FveHK2抑制表达系愈伤生长初期，图6b为FveHK2抑制表达系愈伤生长后期)，生芽(图7为FveHK2抑制表达系出芽情况)，进行出芽率统计。

不定芽出芽率(％)＝再生不定芽的外植体数/接种外植体数×100％

本实验各培养了野生型和抑制表达系叶片40片，分别统计了切下后的50～69天的出芽情况，实验数据表明：切下后的50～69天，抑制表达系叶片的出芽率均远高于野生型叶片出芽率，表明遗传转化FveHK2干扰载体的森林草莓转基因株系叶片的再生能力显著提高(图3为叶片再生的出芽率统计。2R为FveHK2抑制表达系，WT为野生型草莓品种夏威夷4)。

在离体叶片组织培养条件下，FveHK2基因抑制表达系的出芽时间早于野生型：如说明书附图9a、9b分别为45d时WT野生型和的FveHK2抑制表达系离体叶片的生长状态，可以看出，45d时，FveHK2抑制表达系的离体叶片已开始出芽，WT野生型的离体叶片还未开始出芽，即FveHK2基因抑制表达系的出芽时间早于野生型。

(3)收集愈伤组织进行qRT-PCR，检测野生型与FveHK2抑制表达系中的FveHK2a、FveHK2b基因的表达量。

愈伤组织的qRT-PCR：以提取的愈伤组织为材料，将提取的愈伤组织样品利用RNASimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒提取总RNA(北京Tiangen公司)，并按照PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书提取总RNA，然后反转录成cDNA。进行qRT-PCR，检测野生型与FveHK2抑制表达系中的FveHK-2a、FveHK-2b基因的表达量。qRT-PCR的反应体系如表2：

反应程序：第一步预变性，95℃30s；第二步PCR反应，95℃5s，60℃30s，40cycles；第三步延伸，95℃15s，60℃30s，95℃15s。

以NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列设计FveHK2a基因的引物：

FveHK2a-qRT-PCR-F：5'-CATGCCTGCAGGTCGACTAGTCGGTGGTAGTAGCT-3'(SEQ IDNo.14)

FveHK2a-qRT-PCR-R：5'-TACCATGATCCTCTAGAGCTACTAAAACCACACTAC-3'(SEQ IDNo.15)

NCBI登录号为XM_004293409的FveHK2b序列设计FveHK2b基因的引物：

FveHK2b-qRT-PCR-F：5'-GCATGCCTGCAGGTCGATGCCATGGCATATTTTTATG-3'(SEQ IDNo.16)

FveHK2b-qRT-PCR-R：5'-CTACCATGATCCTCTAGGCTACTAAAGCACACACC-3'(SEQ IDNo.17)

收集愈伤组织进行qRT-PCR，检测野生型与FveHK2抑制表达系中的FveHK2a、FveHK2b基因的表达量，结果显示：与WT野生型相比，FveHK2抑制表达系中的FveHK2a、FveHK2b基因的表达量均显著低于WT野生型(图4：qRT-PCR验证FveHK2抑制表达系中的FveHK-2a、FveHK-2b基因的表达量)。证实了FveHK2基因的表达与草莓离体叶片的再生能力有关。本发明筛选得到的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段，构建森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，能够有效下调离体叶片组织FveHK2基因表达，增强森林草莓叶片离体情况下的再生能力。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaatgtcag caagaaccag cttctggctt tagcttcctt gttctctgaa tcagatcaga 60

tagaatccct tgaatgtacc aaagaaacag gacctgggat gcttttaact gatggcattt 120

cctgtgctct gaaggcagtg tgttcagatg agacagaatt tcaagagcat cataaatggg 180

tgggagaata tgttgaagcc gaggaccaat gcccggttca agaactaaac atccccagga 240

tgcttgacct atcattgcta caagaaaatt cattggcaaa agttccgcag tctacagtat 300

<210> 2

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaatgtcag caagaaccag cttctggctt tagcttcctt gttctctgaa tcagatcaga 60

tagaatccct tgaatgtacc aaagaaacag gacctgggat gcttttaact gatggcattt 120

cctgtgctct gaaggcagtg tgttcagatg agacagaatt tcaagagcat cataaatggg 180

tgggagaata tgttgaagcc gaggaccaat gcccggttca agaactaaac atccccagga 240

tgcttgacct atcattgcta caagaaaatt cattggcaaa agttccgcag tctacagtat 300

ttcgaccata ttattcaggt acattctgat ttcattatct tcctacttgg ttaaatttca 360

acatgtaata ctatttttgg cttcaaacat ttaaattaag gatgtgtact ttaatgtgat 420

gcagcttgca aagctctagt atactgtaga ctgcggaact tttgccaatg aattttcttg 480

tagcaatgat aggtcaagca tcctggggat gtttagttct tgaaccgggc attggtcctc 540

ggcttcaaca tattctccca cccatttatg atgctcttga aattctgtct catctgaaca 600

cactgccttc agagcacagg aaatgccatc agttaaaagc atcccaggtc ctgtttcttt 660

ggtacattca agggattcta tctgatctga ttcagagaac aaggaagcta aagccagaag 720

ctggttcttg ctgacattga 740

<210> 3

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catattattc aggtacattc tgatttcatt atcttcctac ttggttaaat ttcaacatgt 60

aatactattt ttggcttcaa acatttaaat taaggatgtg tactttaatg tgatgcagct 120

tgcaaagc 128

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatgtcag caagaaccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggatgctt gacctatcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atactgtaga ctgcggaact 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggttcttg ctgacattga 20

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggactctgca ggtcgaccat attattcagg tacattc 37

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtgatgcag cttgcaaagc tctagagatc gttcaaa 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggactctgca ggtcgactca atgtcagcaa gaaccag 37

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agttccgcag tctacagtat ttcgaccata ttattca 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttgcaaag ctctagtata ctgtagactg cggaact 37

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggttcttg ctgacattga ctctagagat cgttcaa 37

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgcctgca ggtcgactag tcggtggtag tagct 35

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taccatgatc ctctagagct actaaaacca cactac 36

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcatgcctgc aggtcgatgc catggcatat ttttatg 37

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctaccatgat cctctaggct actaaagcac acacc 35

Claims (8)

1.森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段在提高森林草莓叶片再生效率中的应用，所述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2包括FveHK2a和FveHK2b两个同源基因，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列为位于NCBI登录号为XM_004293409的FveHK2b序列733～1032bp区域的序列；

(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少有93％同一性且位于NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列834bp～1133bp区域的序列。

2.一种森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，其特征在于，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中，***由权利要求1所述的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列构成的ihpRNA发夹结构所得到。

3.根据权利要求2所述的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，其特征在于，所述植物抑制表达载体GN2300-FveHK2中ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：获得森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段：根据NCBI数据库登录号：XM_004293409公布的FveHK-2b序列为模板，设计特异性引物FveHK2-RNAi-F1：5'-TCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQ ID No.4)和FveHK2-RNAi-R1：5'-CAGGATGCTTGACCTATCAT-3'(SEQ ID No.5)，扩增得到SEQ ID NO.1所示的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列；设计特异性引物FveHK2-RNAi-F2：5'-ATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.6)和FveHK2-RNAi-R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGA-3'(SEQ ID No.7)，扩增得到SEQ ID NO.1所示森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列；

S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAGGTACATTC-3'(SEQ ID No.8)和Intron-R：5'-TGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGAGATCGTTCAAA-3'(SEQ ID No.

9)，扩增得到SEQ ID NO.3所示的内含子片段；

S3：构建含有内含子的Intron-GN2300载体：XbaI/SalI双酶切GN2300通用载体，将扩增的Intron片段连接到GN2300通用载体XbaI/SalI双酶切位点，得到含有内含子的Intron-GN2300载体；

S4：构建抑制表达载体GN2300-FveHK2：将SEQ ID NO.1所示的正向序列连接到含有内含子的Intron-GN2300载体的SalI酶切位点上，连接正向序列的引物为：

F1：5'-GGACTCTGCAGGTCGACTCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQ ID No.10)，

R1：5'-AGTTCCGCAGTCTACAGTATTTCGACCATATTATTCA-3'(SEQ ID No.11)；

得到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体，再将反向序列连接到含有正向序列和内含子的Intron-GN2300载体的XbaI酶切位点上，连接反向序列的引物为：

F2：5'-GCTTGCAAAGCTCTAGTATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQ ID No.12)，

R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGACTCTAGAGATCGTTCAA-3'(SEQ ID No.13)；

得到抑制表达载体GN2300-FveHK2，转化农杆菌GV3101，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，得到含有森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列的ihpRNA发夹结构的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2。

5.转染了权利要求2所述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的转基因工程菌。

6.权利要求2所述森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2在提高森林草莓叶片再生效率中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，本发明通过权利要求2所述的森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2下调了森林草莓离体叶片中FveHK2基因表达，提高森林草莓叶片离体情况下的再生能力。

8.权利要求5所述的转染了森林草莓细胞***素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的转基因工程菌在提高森林草莓叶片再生效率中的应用。